王春玲[1]2017年在《转ZmABP9棉花抗逆功能分析和CRISPR/Cas9介导的棉花基因定点突变初探》文中指出棉花是世界范围内种植范围最广的经济作物之一,同时也是棉籽油和棉纤维的主要来源。但是干旱、高盐等非生物胁迫严重制约着棉花生长、发育和产量。ZmABP9是通过酵母单杂交的方法从玉米(Zea mays)幼胚中克隆筛选得到的一个编码bZIP转录因子的基因,其编码蛋白脱落酸应答元件连接蛋白 9(ABA responsive element binding protein 9,ABP9)能与玉米 catalase1(Cat1)基因的ABRE2元件相互作用。ZmABP9的表达显着提高了拟南芥对多个非生物胁迫的耐受性,但在棉花中的作用研究较少。另外,由于棉花基因组的复杂性,利用CRISPR/Cas9技术对棉花基因组的编辑有一定的困难。因此本课题通过农杆菌介导的遗传转化技术将ZmABP9基因转到棉花中进行抗逆功能分析,同时对通过CRISPR/Cas9系统介导的棉花基因定点突变进行了初步研究,这对培育具有耐旱耐盐的棉花新品系以及通过CRISPR/Cas9技术进行棉花功能基因组学的研究具有重要意义。在本实验中,首先通过农杆菌介导的遗传转化方法将ABP9基因成功导入陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种R15,并成功获得12个独立的转基因棉花株系。选取L24和L66两个株系进行一系列的胁迫处理实验。结果表明,过表达ABP9基因综合提高了转基因棉花的耐盐耐旱性,包括在温室中转基因株系都具有更好的生长表型和更强壮的根系;在培养箱中转基因株系种子的萌发率,幼苗长度也都明显高于R15,而气孔开度和叶片下表皮气孔密度却低于R15。生理生化指标检测发现,在高盐和渗透胁迫下,转基因棉花叶片中的叶绿素,脯氨酸以及可溶性糖含量都高于R15叶片中的含量,而丙二醛(MDA)含量低于R15叶片的含量。特别是在干旱控水时,转基因棉花的叶片相对含水量(RWC)及复水后的存活率都高于同处理的R15植株。在盐胁迫下,转基因株系中的几个抗逆相关基因的表达量不仅相较于R15明显上调,而且其抗氧化酶的活性及酶基因的表达也都高于R15,增强了活性氧(ROS)的清除能力,提高了抗氧化能力,缓解了对细胞的伤害,组织染色也证明了这一点。另外,ABP9过表达增强了转基因株系在种子萌发,幼苗生长,气孔开度以及保卫细胞密度等生理过程中对外源ABA的敏感性。以棉花愈伤组织和生长一周的棉花子叶为材料,建立了稳定的,高效的棉花原生质体的制备及40%PEG4000介导的目标基因转化和瞬时表达体系。以棉花番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)基因为靶标基因,选择合适的靶标位点,通过棉花原生质体的瞬时表达及农杆菌介导的遗传转化实现了利用CRISPR/Cas9系统对PDS基因的定点突变。综上所述,ABP9可能通过参与ABA-依赖的信号转导途径和ROS的代谢调节从而赋予了棉花耐盐耐旱等多种非生物胁迫耐性;通过CRISPR/Cas9技术实现了对棉花基因的定点编辑并获得突变体表型。这些结果为抗逆棉花新品种的培育以及棉花功能基因组学的研究提供了优良的资源和强有力的工具。
张霞[2]2003年在《玉米转录因子ABP9在转基因植物中的抗逆生理功能分析》文中指出干旱、盐渍和低温是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害。据统计我国有占全国耕地面积38％的干旱和半干旱耕地和5.54亿亩的盐渍土壤，均有待提高单产和开垦利用；同时，低温冷害在我国南北方农业生产中也严重限制着早春作物的种植和晚秋作物的收获。因此，如何克服干旱、盐渍、低温等非生物逆境对植物的伤害作用，提高植物的抗逆能力，进而提高农作物的产量和质量具有重要的理论和实践意义。 氧化逆境是干旱、盐渍、低温等非生物逆境危害植物的共同机制。在干旱、高盐、低温等逆境条件下植物体内ABA(Abscisic Acid)含量的升高，直接或间接的诱导大量活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的产生，造成植物体内氧化逆境的形成。ROS本身化学性质十分活泼，对植物具有严重的伤害作用。为了降低伤害，植物体在长期的进化过程中形成了酶促与非酶促等抗氧化系统。但是逆境条件下植物抗氧化系统受诱导的能力不足，导致抗性提高幅度有限。因此，要提高植物抗逆性必须提高植物的抗氧化逆境的能力。 作为植物内源抗氧化系统的一部分，玉米Catl(Catalasel)基因对于清除体内过量ROS具有不可或缺的作用。本实验室的研究表明Catl基因受ABA调控，已经鉴定了Catl基因启动子应答ABA信号的顺式元件ABRE(ABA Responsive Element)并克隆了与之特异性结合的转录因子ABP9(ABRE Binding Protein 9)。由于许多抗非生物逆境相关基因的启动子区都含有ABRE顺式作用元件，因此，本研究的目的是以玉米悬浮系及模式植物拟南芥菜为系统，通过瞬间表达和转基因手段分析ABP9所调控一系列抗非生物逆境相关基因及抗氧化逆境基因的表达情况，鉴定ABP9在植物抗逆反应中的功能。 本论文的研究工作及得到的主要结果如下： 1．将本实验室分离得到的反式因子ABP9构建成两类表达载体：体内转录激活表达载体pAHC25ABP9和植物稳定转化表达载体pBI121ABP9；同时建构启动子区连有ABRE顺式元件的报告质粒载体pIGA。 2．以玉米悬浮细胞为受体材料，通过基因枪转化法将体内转录激活表达载体和报告质粒载体进行共转化。实验结果证明ABP9能够与ABRE结合并启动下游报 告基因GUS的表达，表明ABPg在植物细胞中具有ABRE结合特异性和转录 激活功能。3．以模式植物拟南芥为材料，通过真空渗透转化法获得转ABPg基因植株，共获 得62棵转化植株，TI代植株的PCR检测阳性率为75．8％。4．以 PCR阳性的 5棵 T；单株门’，4＼ 5＼ 8＼ 12勺为材料，对 ABPg基因及 一系列下游逆境相关基因的表达情况进行Northern检测。结果表明，ABPg在 这 5棵单株中均有不同程度的表达，其中 5‘表达最强；同时实验还证明 ABPg 能够启动或增强抗逆相关基因ocr4二 ocr1J4 koj erd14的表达。5．对生长状况基本一致（约3周）的转基因植株汀3纯系）及未转基因的对照植 株进行耐非生物逆境的抗性分析。结果表明，转基因植株在2％盐浓度， 20％PEG6000的失水条件，6C低温条件下均能够不同程度的正常存活，而对 照则出现枯死，萎蔫，冻伤。证明ABPg基因能够显着提高植株的抗盐、抗寒 和抗旱的能力。6．电子自旋共振光谱解析技术对植物体内源活性氧含量的分析结果表明，转入 ABPg基因的植株 ROS含量均比对照植株的 ROS含量降低，如：4’植株的 ROS 含量为对照的52．50，5’植株的ROS含量为对照的55．50。说明转入的ABPg 基因一定程度上起到了清除植物体内源活性氧的作用。该结果和上述Northem 表达分析结果一起在生理和分子水平解释了ABPg基因提高植物抗逆性的机 制。 综上所述，本论文的研究工作通过瞬间表达和转基因手段证明了转录因子ABPg在植物抗逆反应中的作用，为提高植物抗非生物逆境能力的基因工程提供了优良基因源。
李早霞[3]2008年在《玉米转录因子ABP9互作蛋白NCP1在植物逆境应答中的功能分析》文中研究说明氧化逆境是干旱、盐渍、低温等非生物逆境危害植物的共同机制。为了降低这种氧化胁迫带来的伤害,植物进化出了一系列的酶促与非酶促抗氧化系统。研究植物的这种抗氧化机制和抗逆信号传导途径,对利用分子生物学和基因工程技术来提高植物的耐逆性具有重要的指导意思。玉米Cat1(Catalase1)基因对于体内过量活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的清除具有重要的意义。本实验室的前期工作从玉米幼胚的cDNA表达文库中,通过酵母单杂交系统,利用Cat1基因启动子应答ABA信号的顺式元件ABRE(ABA Responsive Element)克隆到一个bZIP类转录因子ABP9,通过转ABP9拟南芥和水稻的分析证明ABP9基因具有抗非生物逆境的功能。为了进一步解释ABP9在植物抗逆过程中是如何被调控的,克隆了一系列与ABP9相互作用的蛋白,NCP1(ABP Nine Complex Protein 1,NCP1)属于其中功能未知的蛋白之一。本论文的主要工作是利用转NCP1单基因及转NCP1和ABP9双基因的拟南芥进一步分析NCP1的表达及其与ABP9的互作在植物逆境应答中的功能,以期进一步解析植物抗逆信号传导ABP9途径中的调节组分及其作用机制。通过本论文的研究工作得到的主要结果如下:1.在玉米内源系统中,NCP1和ABP9基因的表达受低温、干旱、高盐、ABA和H2O2的诱导,两者的表达谱具有一致性。2.通过农杆菌花序侵染法将本实验室构建的植物表达载体pCHF3-NCP1转化拟南芥植株,获得过表达NCP1的转基因纯合株系。生理分析发现,NCP1过表达上调体内ROS水平,并导致转基因植株对低温、干旱、高盐逆境敏感。3.分析转NCP1植株对ABA的反应发现, NCP1过表达增强了转基因植株在种子萌发和根伸长阶段对ABA的敏感性,在气孔关闭过程中则降低了对ABA的敏感性。4.将NCP1转基因植株与ABP9转基因植株进行杂交,获得双表达NCP1和ABP9的转基因株系。5.转NCP1和ABP9双基因植株相对于野生型在种子萌发、幼苗根伸长和气孔关闭过程中对ABA敏感,但其敏感性与转ABP9基因植株的相比较弱;在幼苗绿色部分生长过程表现对ABA不敏感,与转ABP9基因植株的敏感形成鲜明对照,说明NCP1与ABP9互作在ABA应答中发挥调节作用。6.转NCP1和ABP9双基因植株与野生型相比耐旱性和耐盐性较强,但是比转ABP9植株的弱,说明NCP1与ABP9互作调节植物抗逆性。7.活性氧染色实验发现,正常条件和盐处理,转NCP1和ABP9双基因植株中的ROS水平高于转ABP9基因植株的,但远低于野生型中的ROS水平,说明NCP1与ABP9互作调解体内ROS平衡。8.盐逆境下,转NCP1基因株系和转NCP1和ABP9双基因株系都具有提前开花的表型,后者的表型尤其明显,而ABP9转基因株系则表现发育延迟和晚开花,说明NCP1与ABP9互作在植物的开花过程中起调控作用。9.拟南芥转基因植株体内ROS清除相关基因及逆境应答基因的实时荧光定量PCR分析发现,一方面NCP1可以通过调节一系列ROS清除相关的抗氧化酶类基因如PER27、CAT3、CSD2和CSD1等的表达,参与植物体内ROS的代谢调节;另一方面NCP1还通过调节一些逆境应答相关功能基因如Cor15a,RD29B,AAA-ATPase,Kin1,H1-3等的表达,参与ABA和寒、旱、盐等逆境应答反应的调节。综上所述,本论文的研究结果证明NCP1通过与ABP9互作在ABA/逆境应答、ROS水平调节、基因表达和开花等过程中发挥重要调节作用,为进一步解析逆境信号传导ABP9途径奠定了基础。
孟慧[4]2007年在《玉米转录因子ABP9在转基因拟南芥逆境应答中的功能分析》文中研究表明我国的干旱和半干旱耕地为5.7亿亩,占全国耕地面积的38%,另外还有5.54亿亩的盐渍化土地。低温冷害也严重限制着我国早春作物的种植和晚秋作物的收获。干旱、盐渍和低温等诸多非生物逆境已成为对作物危害最为严重的自然灾害。因此,理解非生物逆境信号在植物体内的传导途径和非生物逆境响应基因表达的调控机制以及通过基因工程手段提高植物的抗逆性在理论上和生产上具有重要的理论和实践意义。氧化逆境是干旱、盐渍、低温等非生物逆境危害植物的共同机制。在干旱、高盐、低温等逆境条件下植物体内ABA(Abscisic Acid)含量的升高,直接或间接的诱导大量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的产生,造成植物体内氧化逆境的形成。ROS本身化学性质十分活泼,对植物具有严重的伤害作用。为了降低伤害,植物体在长期的进化过程中形成了酶促与非酶促等抗氧化系统。但是逆境条件下植物抗氧化系统受诱导的能力不足,导致抗性提高幅度有限。因此,要提高植物抗逆性必须提高植物的抗氧化逆境的能力。作为植物内源抗氧化系统的一部分,玉米Cat1(Catalase1)基因对于清除体内过量ROS具有不可或缺的作用。本实验室的研究表明Cat1基因受ABA调控,已经鉴定了Cat1基因启动子应答ABA信号的顺式元件ABRE(ABA Responsive Element)并克隆了与之特异性结合的转录因子ABP9(ABRE Binding Protein 9)。由于许多抗非生物逆境相关基因的启动子区都含有ABRE顺式作用元件,因此,本研究的目的是以模式植物拟南芥菜为系统,通过转基因手段分析ABP9所调控一系列ABA逆境相关基因及抗氧化逆境基因的表达情况,鉴定ABP9在植物ABA和ROS信号转导反应中的功能。本论文的研究工作及得到的主要结果如下:1.将本实验室分离得到的反式因子ABP9构建成表达载体:植物稳定转化表达载体pBI121-35Sp-ABP9-NOSter和pCHF3-35Sp-ABP9Dominant Negative- NOSter;2.以模式植物拟南芥为材料,通过真空渗透转化法获得转ABP9和ABP9DN基因植株,分别获得62棵和41棵转化植株,T1代植株的PCR检测阳性率为75.8%和82.9%。3.以PCR阳性的转ABP9基因植株T3单株5#为材料,对ABP9基因及一系列ABA相关基因的表达情况进行RT-PCR检测。结果表明,ABP9在5P2、5P3中均有表达,其中5P3表达最强;同时实验证明:野生型作对照,ABP9能够下调ABA合成相关基因nced3、aba1的表达,而ABA调节基因abi1被下调。4.对转基因拟南芥ABA应答的调控分析,结果表明:过表达ABP9改变了拟南芥中ABA相关基因的表达,降低转基因拟南芥内源ABA含量,平均降幅为30%~40%。却增强了转基因拟南芥萌发,根伸长和苗的发育对ABA的敏感性。这表明ABP9基因调控了拟南芥ABA信号途径的应答。5.对转基因拟南芥活性氧含量的分析结果表明,转ABP9基因的拟南芥ROS含量均比对照的ROS含量低,平均降低78.9%~57.7%。说明转ABP9基因在一定程度上起到了清除植物体内源活性氧的作用。这些结果表明ABP9是一个联系植物ROS和ABA信号途径的bZIP类转录因子,可能在调控植物ABA和ROS信号途径相互作用过程中发挥作用。6.对转基因过表达拟南芥分析,结果表明ABP9在转基因拟南芥生长发育过程中起着重要的作用。综上所述,本论文的研究工作通过转基因手段,证明了转录因子ABP9对拟南芥ABA和ROS信号转导途径具有调控作用,为提高植物抗非生物逆境能力的基因工程提供了优良基因源。
凌键[5]2004年在《rd29A启动子调控的玉米转录因子ABP9融合基因的构建及转基因拟南芥中的表达》文中研究指明干旱、盐渍和低温是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害。据统计我国有占全国耕地面积38％的干旱和半干旱耕地；有5.54亿亩的盐渍土壤有待提高单产和开垦利用；同时，低温冷害在我国南北方农业生产中也严重限制着早春作物的种植和晚秋作物的收获。因此，如何克服干旱、盐渍、低温等逆境环境对植物的伤害作用，提高植物的抗逆能力，进而提高农作物的产量和质量具有重要的理论和实践意义。 在干旱、高盐、低温等逆境条件下植物体内ABA(Abscisic Acid)含量的升高，直接或间接的诱导大量活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的产生，造成植物体内氧化逆境的形成。ROS本身化学性质十分活泼，对植物具有严重的伤害作用。因此，要提高植物抗逆性必须提高植物的抗氧化逆境的能力。 作为植物抗氧化内源系统的一部分，玉米Catl(Catalasel)基因对于清除体内过量ROS具有不可或缺的作用。研究表明，Catl基因受ABA调控。已经鉴定了Catl基因启动子应答ABA信号的顺式元件ABRE(ABA Responsive Element)并克隆了与之特异性结合的转录因子ABP9(ABRE Binding Protein 9)，而且已知许多抗非生物逆境相关基因的启动子区都含有ABRE顺式作用元件，因此，反式作用因子ABP9不仅仅能rd29A启动了调控的不米转录因了ABPg融合基因的构建及在转纂因拟南芥中的表达够提高Catl基因的表达，还可能调控其它的一系列抗氧化逆境和相关的抗逆境基因的表达。由常用的组成型启动子CaMV 355启动r来启动ABPg在转基因拟南芥中的表达，在正常生长条件下，植物的生长期会明显受到抑制，其表现为生长缓慢，叶片卷曲，矮化。这表明，由355启动子启动ABPg的表达，植物的抗逆能力的获的是以其生长受到抑制为代价的。为解决这个问题，本文采用诱导型的rd29A启动子来启动ABPg在转基因植物中的表达;为了对ABPg在植物组织中表达情况进行分析，将ABPg和绿色荧光蛋白基因(GFP gene)形成融合基因，并将其置于rd29A启动子的调控之下。为此，本文构建了植物表达载体pZPZ 12一rd29A promoter一ABPg和pZP212一rd29A promoter一ABPg一GFP，并成功获得了转基因的拟南芥植株。通过转基因植株和野生型拟南芥在正常环境下的对比，发现携带rd29A启动子调控ABPg表达的转基因植株的生长不会受到抑制。为了研究rd29A启动子逆境下能否启动ABPg的表达，对转rd29A promoter一ABPg一GFP基因的植株进行低温处理。观察结果表明，4℃低温处理可诱导转基因植株的根尖检测到绿色荧光蛋白(GFP)，而未做处理的对照植株的根尖未观察到绿色荧光蛋白。由此可以推测，在逆境条件下，rd29A启动子能够被诱导活化，启动ABPg的表达。
蒲妍君[6]2016年在《玉米转录因子ABP9的染色体定位、发育表达谱及功能分析》文中提出玉米转录因子ABP9(ABRE binding protein 9)是通过酵母单杂交的方法,以活性氧清除基因Cat1(Catalase1)启动子的顺式元件ABRE2为目标序列,从玉米自交系齐319授粉后17天的幼胚cDNA文库中筛选得到的能够与ABRE2结合的转录因子。ABP9全长cDNA序列共1 510 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 158 bp,编码358个氨基酸。据此cDNA序列,本实验室前期通过PCR法克隆了ABP9编码区的基因组序列,还通过PCR步移法克隆了ABP9起始ATG上游2 006 bp的启动子序列。研究表明,ABP9基因的表达受ABA、干旱、H2O2和高盐胁迫等非生物逆境的诱导;ABP9过表达转基因拟南芥能大幅度提高植株对干旱、低温、高盐等多种非生物逆境的耐受性,在逆境下,转ABP9拟南芥能提高植株的光合能力,具有更强的ROS清除能力,且表现出ABA和气孔关闭响应的高敏感性。这些结果说明ABP9基因在植物抗逆性过程中发挥了重要的作用。尽管如此,对于ABP9的认知和应用还有待于进一步研究。存在的科学问题有:ABP9基因完整且准确的基因组序列和染色体定位信息;ABP9在玉米整个生育期的时空表达特异性以及转基因功能等。本文第一部分是对已构建好的玉米自交系齐319的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)文库中含有ABP9基因的单克隆进行筛选,通过测序和比对来获得ABP9准确的基因组序列和染色体定位信息;第二部分是通过构建Pabp9-GUS载体并转化玉米以研究该基因在玉米的整个生长发育过程中的时空表达特异性;第叁部分是将ABP9基因与不同强度启动子进行融合以研究其在转基因玉米中表型及抗逆能力,以期筛选到驱动ABP9适量表达的启动子,用以培育生长发育和抗逆性俱佳的玉米新品种。主要研究成果如下:1、应用PCR分级筛选法从玉米自交系齐319的BAC文库中筛选到19个含有ABP9基因的一级阳性混池;从BAC-103,BAC-159两个一级阳性混池中筛选到4个含有ABP9基因的阳性单克隆,分别是:BAC-103-C3、BAC-103-L5、BAC-159-D1、BAC-159-E1。2、阳性单克隆BAC-103-C3经全序列测定获得了ABP9基因准确的基因组序列及其旁侧基因组序列;序列比对后将ABP9基因定位于玉米自交系Mo17基因组的3号染色体上。3、对ABP9基因启动子Pabp9驱动GUS表达的转基因玉米生育期各组织器官的GUS染色和GUS相对酶活进行分析,ABP9基因在种子萌发24小时(G0)的胚芽和胚根、播种6天(G1)的整个植株,V18期、R1期的雌穗及授粉第6、第8天的籽粒种皮中表达最强,其他时期的组织器官中表达较弱或不表达,推测该基因是一个组织特异性表达的基因,并且参与玉米籽粒发育早期的调控。4、对水稻α-微管蛋白基因Os-TubA4启动子Postuba4驱动ABP9表达的转基因玉米干旱逆境下的光合参数进行测定,转基因株系比非转基因株系的光合能力和水分利用效率更强,说明Postuba4-ABP9转基因株系可以提高玉米的抗旱能力。5、根据玉米基因芯片的分析结果从玉米自交系B73中克隆了六个中等强度表达的启动子,根据原生质体瞬时表达结果从中筛选到两个相对表达量较高的启动子,构建稳定表达载体并进行玉米遗传转化以供下一步分析。本文的研究结果对于ABP9基因的结构、功能、表达调控的研究以及该基因分子标记的开发、分子标记辅助和转基因抗逆育种奠定了基础。
张霞[7]2008年在《玉米转录因子ABP9在转基因拟南芥ROS代谢平衡、ABA信号传导及非生物逆境耐受性中的功能分析》文中提出干旱、盐渍、低温等非生物逆境严重影响植物的生长发育和作物的产量。解析逆境下植物体内的基因表达及信号传导网络调控机制对于阐明植物的适应性反应及培育耐逆性作物具有重要的理论和现实意义。研究表明,非生物逆境刺激植物体内ABA和ROS的产生或积累,二者通过诱导气孔关闭和抗氧化等耐逆反应在植物的适应性信号传导途径中发挥重要作用;同时ROS过量积累会引起氧化逆境对植物造成伤害,因此其体内含量必须受到严格控制。本研究室前期工作通过酵母单杂交的方法分离得到与玉米过氧化氢酶cat1启动子区ABRE2顺式元件特异性结合的转录因子ABP9,并且证明其内源表达受ABA、H2O2和干旱、高盐等非生物逆境诱导。本研究以转35S-ABP9拟南芥为材料,通过分析转基因株系的耐逆性、ABA敏感性、体内ROS含量变化、逆境下的光合表现以及逆境相关基因的表达,探讨ABP9在植物非生物逆境应答反应中的功能。本论文工作取得的主要研究结果如下:1.组成型表达ABP9综合提高了转基因植物对干旱、高盐、低温和氧化逆境的耐受性。2. ABP9作为正调节因子参与ABA信号传导。组成型表达ABP9增强了转基因拟南芥在种子萌发、根伸长和气孔关闭等生理过程中对ABA的敏感性,导致转基因植株的蒸腾速率和气孔开度组成型降低,增强转基因植物脱水胁迫下的保水能力。3. ABP9参与ROS代谢调节,其表达增强植物的ROS清除能力。正常生长条件、盐胁迫以及ABA处理条件下,ABP9的组成型表达均显着降低转基因植株的内源ROS含量,并且不同转基因株系内ROS的含量与ABP9的表达水平呈负相关。另外,ABP9组成型表达导致气孔保卫细胞中ABA诱导的ROS相对于野生型在总体水平降低的同时能够有更大的上升幅度。4.组成型表达ABP9能够调节转基因植物逆境下改变其光合色素分子的组成、耗散多余的吸收光能、增强碳的利用效率、增加ABA含量、提高水分利用效率以及增强逆境条件下各种光合/逆境响应基因的表达,从而改善植物在逆境条件下的光合能力。本研究结果从光合生理的角度再度证明ABP9在提高植物耐逆性方面发挥重要作用。5.基因芯片和实时荧光定量PCR结果证明,一方面ABP9通过调节一系列ROS清除相关的抗氧化酶类基因(CSD1,CSD2,CAT3,PER27)和ROS信号传导相关的调节基因(Zat10,Zat12,SRO5)的表达,参与植物体内ROS代谢调节;另一方面ABP9还通过调节多种逆境/ABA应答相关功能基因(COR15a,KIN1,RD29B,AAA ATPase)和调节基因(CBF1,CBF2,AZF2,H1-3, PP2C,MYB2等)的表达,参与ABA信号传导和寒、旱、盐等逆境防御反应,从而提高植物耐受氧化逆境以及多种非生物逆境的能力。本研究结果为进一步解析非生物逆境/ABA信号传导ABP9途径的其它调控组分及其作用机制奠定了良好的工作基础,为利用ABP9通过分子育种手段综合提高作物对多种非生物逆境的耐受性提供了理论依据和优良的基因源。
李昊文[8]2008年在《玉米转录因子ABP5在植物逆境应答中的功能分析》文中指出干旱、低温、高盐是影响植物生长和发育的主要环境因子。如何减少这些非生物逆境对植物的伤害,提高植物的抗逆能力,已成为目前农业生物科研工作者的一项重要课题。在生物或非生物逆境下,植物体都会诱导产生大量脱落酸(ABA)和活性氧(ROS)。ABA是植物体内重要激素之一,参与植物多种生理生化过程,众多的研究证明ABA信号通路在非生物逆境中起着非常重要的作用。活性氧一方面作为信号分子参与细胞代谢、逆境信号传导,为植物生命活动所必需;但是活性氧的大量积累又会对植物体造成严重的损伤。因此,活性氧水平在植物体内是受到严格控制的,其产生与清除处于动态平衡之中。了解植物体抗氧化基因的表达调控机制对改良作物抗逆性有重要意义。过氧化氢酶(CAT)是植物体内活性氧清除体系的重要成员。玉米的CAT1基因受ABA的调控,其启动子区域的ABRE2是响应ABA调控所必需的顺式元件。本实验室利用酵母单杂交的方法,对玉米幼胚17天和21天cDNA文库进行筛选,克隆到与ABRE2特异结合的bHLH类转录因子ABP5。得到该基因全长cDNA序列1652bp,其中开放阅读框为1020bp,并初步证明该基因在玉米中的表达受逆境和ABA的诱导。本论文的主要研究目的是鉴定ABP5的转录因子活性,并利用转基因的手段分析ABP5在植物逆境反应中的功能,试图弄清ABP5与ABA、活性氧水平控制、抗逆相关基因表达以及植株抗逆性的关系。本论文取得的主要研究结果如下:1.利用酵母单杂交的方法验证ABP5与CAT1基因启动子顺式作用元件ABRE在酵母体内存在特异性相互作用。2.构建pDB-ABP5ORF/N/M/C载体,在酵母Mav203中证实ABP5不具有转录激活功能。3.构建pCHF3-ABP5-GFP植物稳定表达载体,转化拟南芥,阳性植株在激光共聚焦扫描显微镜下观察。结果显示ABP5具核定位信号,定位于转基因拟南芥细胞的细胞核中。4.通过Real-time PCR的方法,分析不同逆境处理下ABP5在玉米中的内源表达情况。ABA、NaCl、PEG、4℃低温诱导ABP5的表达。H2O2抑制ABP5的表达。5.对ABP5过表达系和野生型拟南芥植株进行表型观察,发现ABP5转基因与野生型植株在种子萌发和早期生长阶段表型无明显差异。但ABP5基因能够使转基因拟南芥植株提前抽苔和开花,加快转基因植株生长速度。6.通过ABA平板上种子萌发率、幼苗存活率和根伸长实验,证明ABP5提高了转基因植物对ABA的敏感性。7.对ABP5过表达系5-33-5、5-4-2、5-26-7,RNAi系5R-3-29和野生型拟南芥植株进行NBT和DAB染色,发现转ABP5基因过表达系植株体内的活性氧(超氧阴离子,过氧化氢)水平高于野生型;RNAi系植株体内的活性氧水平低于野生型。说明ABP5能促进植物体内ROS的积累。8.对转基因拟南芥纯系植株和野生型进行抗非生物逆境生理实验,证明转ABP5基因拟南芥对寒、旱、盐及氧化逆境的耐受性低于野生型。9.通过Real-time PCR分析,在正常条件和NaCl处理条件下,抗逆相关基因RD29A、RD29B、COR47、COR414、CAT3、CSD2在ABP5转基因拟南芥中的表达量均低于野生型;RD22、ERD5、CSD1、RbhoD、ZAT12表达量均高于野生型;COR15A、FSD3、PER72表达量变化趋势不同。10.基因芯片分析显示,转基因拟南芥中一些与ROS代谢、生物逆境及开花相关的基因表达发生变化。由上述结果初步推测,ABP5可能作为一类调控蛋白,参与ABA依赖性逆境信号通路,并对ROS水平起重要调节作用。本研究试图弄清非生物逆境中的信号转导和基因表达调控机制,对于改良植物的抗逆性有重要的理论和实践意义。
潘振[9]2015年在《转录因子ABP9增强玉米非生物胁迫耐受性的相关研究》文中指出干旱、盐碱、洪涝等非生物胁迫每年造成大量粮食减产,严重威胁着全球的粮食安全。玉米是全球产量最大的重要农作物,通过生物工程方法提高玉米的非生物胁迫耐受性,是保障玉米生产的有效手段。本课题组的前期研究中,以过氧化氢酶CAT1启动子中G-box基序为诱饵,从玉米自交系Q139胚cDNA文库中筛选得到一个转录因子ABP9。研究表明ABP9受各种非生物胁迫的诱导；ABP9过表达转基因拟南芥的耐旱性、耐盐性、耐冻性和耐氧化性都得到很大提高；并且转基因植株表现出ABA响应和气孔关闭响应的高敏感性,并且具有更强的ROS清除能力。这些实验证据说明ABP9参与了植物逆境响应途径,具有增强植物抗逆性的能力。同时在前期的实验中,有初步证据证明ABP9转录过程中存在一种新型的转录后修饰,产生一种多碱基插入修饰的转录本。围绕以上对ABP9的已知信息,可提出以下科学问题：首先ABP9乃至玉米中是否存在一种尚未发现的转录修饰方式?ABP9增强抗逆性的基因功能是否应用于玉米分子育种?如ABP9确实可以增强玉米耐受非生物胁迫的能力,那么其调控的生物学机制有哪些?针对以上问题,对ABP9相关性质进行验证和解答具有显着的学术意义和实际应用价值。因此,本研究进行了以下研究并得到了初步结论：1.通过多种方法再次验证ABP9是否存在多碱基插入型转录本。实验结果表明无法重复之前的生物现象,无法得出ABP9存在特殊转录修饰的结论。2.创建了ABP9转基因玉米,并验证了转基因事件真实有效。通过大田耐旱实验证实,ABP9过表达转基因玉米在旱胁迫条件下比野生型表现出更强的耐受性,产量更高。为利用ABP9创造优质耐旱玉米新品种奠定基础。3.通过下一代高通量测序实验,确定了ABP9下游靶基因的范围,和一批可信度高的候选基因。初步阐明了ABP9增强玉米抗逆性的分子机理。
王磊[10]2002年在《玉米Cat1基因顺式作用元件ABRE的反式作用因子的克隆和功能分析》文中指出干旱、盐渍和低温是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害，它严重影响作物的产量和种植面积。因此，一直以来，人们都很注重对干旱、盐渍和低温等非生物逆境的研究。但由于非生物逆境的复杂性，人们对植物与非生物逆境之间的关系的理解仍比较有限，人们在改良作物抗非生物逆境方面的结果也不理想。随着分子生物学与现代生物技术的发展，使人们从分子水平上深入认识植物与非生物逆境之间的关系成为现实，并为改良作物的抗非生物逆境性能开拓了新的途径。 研究表明在干旱、盐渍和低温等逆境条件下，植物体内会产生大量的活性氧，形成氧化逆境。由于活性氧具有非常活泼的化学性质，它会对细胞造成严重的伤害，因此活性氧的及时清除对植物抗非生物逆境性能的提高具有重要意义。为了减小这种伤害，植物在进化过程中形成了酶类和非酶类的抗氧化系统。在活性氧的清除过程中，过氧化氢酶CAT1起作重要作用，但在逆境条件下，植物本身的抗氧化系统受诱导表达的能力比较弱，不能及时地清除体内的活性氧，影响了植物抗逆性的提高。在Cat1基因的启动子区含有ABRE顺式作用元件，它是逆境条件下Cat1基因响应ABA作用的重要元件，事实上许多抗非生物逆境相关基因的启动子区都含有ABRE顺式元件，所以通过ABRE 顺式元件来调控Cat1表达的转录因子的研究具有重要意义。因为这样的反式因子它不仅仅是能够调控Cat1基因的表达，还可能调控其它的一系列的抗氧化逆境基因和相关的抗非生物逆境基因的表达。因此，本论文开展了玉米Cat1基因ABRE顺式作用元件的反式作用因子的克隆和功能分析方面的研究工作。旨在了解逆境诱导Cat1基因表达的信号传导通路中的重要的未知调控因子：转录因子；并初步了解该转录因子在抗非生物逆境中的作用。 通过本论文的研究工作得到的主要结论如下： 1．构建了玉米17dpp、21dpp幼胚(授粉后17天、21天)cDNA文库，容量分别为5.2×10~6和3.34×10~6，文库重组率为85％，其中76％大于1kb。 2．采用酵母单杂交的方法对文库进行了筛选，共得到7个不同的克隆，命名为 ABRE结合蛋白（ABRE Binding Proteins，ABPs），分别是 ABPZ、ABP3、ABP4。 ABPS、ABP6、ABP7、ABPg。序列分析表明ABPZ、ABP4、ABP6、ABPg 属于bZIP类转录因子，ABP3、ABPS、ABP7属于bHLH类转录因子。它们 均含有保守的DNA结合结构域。实验证明所克隆的ABP在酵母体内均具 有ABRE结合特异性，这是玉米中具有ABRE结合特异性的转录因子的首 次报道。3．根据ABPs的DNA序列推测出其蛋白序列并输入GenBank中，BLAST分 析表明：与ABPZ同源性最高的是拟南芥的ABF3，为34．l％；与ABP3同 源性最高的是水稻基因组中的SPAT为o6．9％＊ 但水稻中SPAT的研究尚未 有报道；与AB P4同源性最高的是水稻11LABI因子，为44．3％：与AB严 同源性最高的是拟南芥基因组中的 MYC蛋白，但同源性仅为 19％，且功能 未知；与ABP6同源性最高的是水稻基因组中的ABI，为54石％，但水稻中 ABI的研究尚未有报道；与ABP7同源性最高的是水稻基因组中的DNA结 合蛋白＊＊P，仅为26石％，且功能未知：与AB的同源性最高的也是水稻基 因组中的ABI，为41．9O。4．ABP基因在盐、干旱、HpyABA、低温等不同逆境条件下的表达情况比 较复杂：盐仰aCI）可以抑制ABP4、ABP7的表达，诱导ABPZ、ABP工ABP工 ABPd、ABPg的表达。干旱诱导除ABP4、ABP7之外的所有的ABPs的表达。 H。O。抑帘ABP4、ABP7的表达，诱导ABPZ、ABP叁、ABPS、ABP6、ABPg 的表达。ABA诱导除ABP4之外的所有的ABP的表达。低温对所有的ABP 都没有诱导作用。这种复杂性说明ABPs分别在不同的逆境条件下发挥着不 同的功能，它们既有区别又有联系，同时也反映出在逆境条件下植物细胞内 基因表达调控的复杂性。由上面的实验结果推知ABPZ、ABP3、ABP工ABP氏 ABP7、ABPg很可能是依赖于ABA的能够与Catl基因ABREZ顺式元件相 互作用的反式因子 CBF类；ABP4则很可能是不依赖于 ABA的能够与 Catl 基因ABREZ元件相互作用的反式因子CBFZ类。本论文的工作为非生物逆 境诱导Caf基因表达的信号传导通路的完善提供了新的数据。5．通过5’RACE的方法得到了ABPZ基因的全长CDNA序列为1450hp，推测 的读码框为1056hp，编码351个氨基酸。ABPZ蛋白全序列与拟南芥ABRE 结合因子ABF3的同源性最高，但仅为33石％；ABP4基因的全长CDNA序 列为1835hp，推测的读码框为1083hp，编码360个氨基酸。ABP4蛋白与 水稻flMBI因子同源性最高，为44．3O，但在蛋白序列的N端ABP4比TRABI 且且 多出约60个氨基酸，ABPJ不受ABA的诱导，而TAsBI则受ABA的诱导， 看来二者的同源性虽然较高，但在功能上存在着差别；
参考文献：
[1]. 转ZmABP9棉花抗逆功能分析和CRISPR/Cas9介导的棉花基因定点突变初探[D]. 王春玲. 中国农业大学. 2017
[2]. 玉米转录因子ABP9在转基因植物中的抗逆生理功能分析[D]. 张霞. 中国农业科学院. 2003
[3]. 玉米转录因子ABP9互作蛋白NCP1在植物逆境应答中的功能分析[D]. 李早霞. 中国农业科学院. 2008
[4]. 玉米转录因子ABP9在转基因拟南芥逆境应答中的功能分析[D]. 孟慧. 华南热带农业大学. 2007
[5]. rd29A启动子调控的玉米转录因子ABP9融合基因的构建及转基因拟南芥中的表达[D]. 凌键. 西南师范大学. 2004
[6]. 玉米转录因子ABP9的染色体定位、发育表达谱及功能分析[D]. 蒲妍君. 中国农业科学院. 2016
[7]. 玉米转录因子ABP9在转基因拟南芥ROS代谢平衡、ABA信号传导及非生物逆境耐受性中的功能分析[D]. 张霞. 中国农业科学院. 2008
[8]. 玉米转录因子ABP5在植物逆境应答中的功能分析[D]. 李昊文. 中国农业科学院. 2008
[9]. 转录因子ABP9增强玉米非生物胁迫耐受性的相关研究[D]. 潘振. 中国农业科学院. 2015
[10]. 玉米Cat1基因顺式作用元件ABRE的反式作用因子的克隆和功能分析[D]. 王磊. 中国农业科学院. 2002
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