拟南芥RNA编辑因子（MORF2）和线粒体RNA聚合酶（RPOTm）结构与功能研究

论文摘要

RNA编辑是一种转录后修饰过程,通过碱基的插入、删除或替换可以改变RNA分子的遗传信息。RNA编辑通常发生在植物的质体和线粒体中,会改变编码的核苷酸,引入新的启动子和终止子,具有校正和调控翻译等生物学意义。目前为止已经鉴定出许多RNA编辑因子。2005年,发现了第一个RNA编辑因子CRR4,它是PLS型五肽重复（PPR）蛋白家族的成员。随后又发现许多其他PLS型PPR蛋白参与植物RNA编辑。事实上,所有研究的PPR蛋白都位于质体或线粒体中。一般认为PPR蛋白是一类参与RNA编辑的反式作用因子,作为RNA结合蛋白起作用。还有一类非PPR蛋白质对开花植物叶绿体和线粒体中的RNA编辑也是必须的,它们被称为MORF蛋白或RIP蛋白家族。MORF蛋白是一个小蛋白家族,在拟南芥中有10个成员。其中MORF2和MORF9位于质体中,MORF1和MORF3-7位于线粒体中,MORF8则是定位于两个细胞器中,MORF10则被认为不参与RNA编辑。通过酵母双杂交实验以及pull down实验表明,MORF蛋白之间存在相互作用,能形成同源或异源聚合体,说明MORF蛋白可能需要共同作用来参与编辑。在本篇论文中,我们通过克隆、表达和纯化的方法得到拟南芥MORF2状态较好的可溶性蛋白质。利用气相扩散法进行结晶实验后得到拟南芥叶绿体MORF2 2.4 A分辨率的结构。分析结构发现MORF2在晶体中是二体结构。MORF2采用在线粒体MORF1和叶绿体MORF9中观察到的典型MORF-box折叠的结构,展示了类似MORF1二体模式。MORF2和MORF9两种模式之间的差异可归因于F157（MORF1中相应的F162和MORF9中的W160）,其在二聚化时引起60°偏移。MORF蛋白包含特征性MORF结构域,都能形成同源或异源二聚体,并与RNA编辑因子PPR蛋白和含有RRM结构域的蛋白质相互作用。MORF1,MORF2和MORF9结构分析表明它们的疏水界面是同源或异源二聚体的形成基础。在MORF1结构中,两个C85残基之间的二硫键桥接两个二聚体并形成四聚体。然而,所有MORF蛋白中这种绝对保守的半胱氨酸却在MORF2和MORF9中不起作用,无法形成四聚体。（PLS）3PPR-MORF9复合物的结构显示了每个PLS结合一种MORF9单体,这表明在RNA编辑体形成期间,MORF蛋白的二聚体发生解离。对MORF2二聚体和模拟的PPR-MORF2复合物的结构分析表明,（PLS）3PPR-MORF2复合物的界面与二聚化界面重叠。RNA聚合酶是以DNA为模板合成RNA所必须的生物催化剂。大部分原核生物RNA聚合酶都是由核心酶和转录起始因子σ因子构成,构成一个分子质量约500 kDa聚合酶的全酶。真核生物中也存在着多亚基RNA聚合酶,相比原核生物的更复杂,分别是RNAP Ⅰ、RNAPⅡ和RNAP Ⅲ。与原核和真核RNA聚合酶相比,某些噬菌体的RNA聚合酶,如T7,T3,SP6和K11,以及线粒体RNA聚合酶都是单亚基聚合酶。在被子植物中,细菌型RNA聚合酶（称为质体编码的质体RNA聚合酶的PEP）不足以转录叶绿体基因,需要一种或两种噬菌体型RNA聚合酶（称为核编码的质体RNA聚合酶的NEP）的活性来补充。在被子植物中存在三个噬菌体型RNA聚合酶,分别是定位在质体的RPOTp,定位在线粒体的RPOTm和定位在两个细胞器的RPOTmp。在此论文中,研究的第二个课题即拟南芥线粒体RNA聚合酶的结构与功能。在该课题研究中,通过不同序列截短和不同的载体,构建完成多个重组质粒,得到状态较均一的可溶性蛋白。通过气相扩散法进行晶体结晶,尝试改变结晶时的蛋白浓度、晶体生长的温度和不同晶体试剂盒,但目前并未得到蛋白质晶体。后续还需要更换条件来摸索蛋白质结晶条件,并衍射收集数据,从原子角度阐明线粒体RNA聚合酶转录机制。

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摘要

Abstract

第一部分拟南芥MORF2蛋白的结构生物学研究

第一章引言

1.1 RNA编辑

1.2 与RNA编辑相关蛋白

1.2.1 PPR蛋白家族

1.2.2 MORF蛋白家族

1.2.3 ORRM蛋白

1.2.4 其他RNA编辑因子

1.3 本论文的选题依据以及创新性

1.3.1 选题依据

1.3.2 选题创新性

第二章实验材料与方法

2.1 基因克隆与表达载体的构建

2.1.1 菌种

2.1.2 表达载体

2.1.3 试剂的配置

2.1.3.1 培养基配置

2.1.3.2 抗生素的配置

2.1.3.3 SDS-PAGE试剂的配置

2.1.3.4 常规试剂配置

2.1.4 实验设备

2.1.5 菌种保存

2.1.6 感受态细胞的制作

2.1.7 PCR反应

2.1.8 基因和载体的酶切

2.1.9 连接反应

2.1.10 转化

2.1.11 鉴定重组质粒

2.2 蛋白表达和纯化

2.2.1 蛋白表达流程

2.2.2 蛋白纯化

2.2.3 亲和层析方法

2.2.4 离子交换层析方法

2.2.5 凝胶滤过层析方法

2.3 蛋白晶体生长

2.3.1 晶体筛选

2.3.2 晶体优化

2.4 数据收集与结构解析

第三章 MORF2蛋白晶体生长和结构解析

3.1 AtMORF2基因与蛋白序列信息

3.2 目的基因的PCR扩增和表达载体构建

3.3 AtMORF2的表达和纯化

3.4 晶体筛选和优化

3.5 数据收集和结构解析

第四章 MORF2蛋白整体结构

4.1 AtMORF2整体结构

4.2 二聚体的结构基础

4.3 与PPR蛋白的相互作用

第五章总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

第二部分拟南芥RPOTm蛋白的克隆表达与纯化

第一章引言

1.1 RNA聚合酶简介

1.2 多体RNA聚合酶

1.3 单体RNA聚合酶

1.4 RPOT基因简介

第二章实验材料与方法

第三章 RPOTm蛋白表达纯化及晶体生长

3.1 拟南芥RPOTm蛋白的序列分析

3.2 拟南芥RPOTm蛋白的构建

3.3 拟南芥RPOTm蛋白的表达和纯化

3.3.1 第一批构建重组蛋白的表达和纯化

3.3.1.1 试表达

3.3.1.2 Ni-NTA亲和层析

3.3.1.3 凝胶过滤层析

3.3.1.4 质谱分析结果

3.3.2 第二批构建重组蛋白的表达和纯化

3.3.2.1 新截短重组蛋白的表达和纯化

3.3.2.2 带有MBP助溶标签重组蛋白的表达和纯化

3.3.2.3 两端带有His6标签重组蛋白的表达和纯化

3.4 拟南芥RPOTm蛋白的晶体生长与筛选

第四章总结与展望

4.1 总结

4.2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨婧渝

导师: 张敏,刘琳

关键词: 拟南芥,编辑因子,聚合酶,晶体结构

来源: 安徽大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 安徽大学

分类号: Q943.2

总页数: 99

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拟南芥RNA编辑因子（MORF2）和线粒体RNA聚合酶（RPOTm）结构与功能研究

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