胡舜钦[1]2003年在《新型生物分子固定技术用于构建电化学免疫传感器的研究》文中进行了进一步梳理长期以来，由于电化学免疫传感器具有设计制造简单、高灵敏度、价格低廉而被广泛研究并已在生物检测中逐步得到了应用。然而，如何将生物活性组分有效地固定在电极表面上的固定化方法、降低甚至消除蛋白质在传感器上的非特异性吸附以及免疫传感器的重现性和重复使用性能等方面存在的问题阻碍了电化学免疫传感器的发展和应用。其中有效的生物活性组分的固定方法是构建性能优良的生物传感器的关键步骤，据此本研究论文发展了五种新型的生物活性组分在电极上的固定化技术，并以此来构建电化学免疫传感器。主要内容如下： (1)在第二章和第叁章发展了基于邻氨基硫酚在金电极上进行自组装和电催化聚合形成低聚合物膜技术的电容型电化学免疫传感器。采用邻氨基硫酚低聚合物膜固定生物活性组分，构建电容型免疫传感器的优势在于一方面其表面存在自由的氨基可以用戊二醛活化或结合纳米金来固定抗体构建电容免疫传感器；另一方面，邻氨基硫酚低聚合物膜可完全封闭金电极表面，而且所形成的低聚合膜为一种有机半导体膜，可赋予传感器具有较高的初始电容值，以提高其检测范围及检测灵敏度。采用循环伏安法研究这类传感器的基本性能如法拉第电流效应、离子的不可通透性等，均表明该低聚合膜能很好的满足构建电容免疫传感器的要求。采用恒电位脉冲计时安培法可确定传感器的电容值，实验结果表明，用戊二醛活化邻氨基硫酚低聚合物膜固定转铁蛋白抗体而构建的传感器，对溶液中转铁蛋白检测的浓度的线性范围为1.25-80.0ng／ml，检测下限为0.12ng／ml。而采用结合纳米金来进一步固定转铁蛋白抗体所构建的电容免疫传感器，对溶液中转铁蛋白的测定的浓度线性范围为0.1-1000ng／ml，检测下限达0.08ng／ml。 (2)κ型角叉皂素(κ-LC)为带磺酸基的天然聚电解质，是一种具有强电负性的物质，将κ-LC与蛋白质偶联，可以增强蛋白质的负电荷性而使通过静电自组装技术固定的蛋白质的稳定性得到提高。本论文的第四章采用此技术构建了亲和柱用于流动免疫分析方法检测了溶液中NH IgG，其检测的浓度的线性范围为0.1-1000μg／ml，该亲和柱用于免疫分析具有重复性较好、非特异性吸附影响低等特点。 褐藻酸钠与壳聚糖之间可通过静电自组装而形成牢固的小分子可透过性的天然高分子膜。可利用褐藻酸钠这一特性可构建电化学免疫传感器，即将褐藻酸钠通过EDC活化与目标生物活性组相联，将壳聚糖通过包埋技术固定在碳糊电极里；这样，负载有生物活性组分的褐藻酸钠与固定在电极表面的壳聚糖分子之间发生静电自组装的同时也将摘要生物组分固定到电极表面而完成了电化学免疫传感器的构建。第五章描述了采用该技术固定日本血吸虫抗体构建了一种新的日本血吸虫电化学免疫传感器。实验结果表明该传感器对日本血吸虫抗原检测的浓度线性范围为0.64一40雌/m1，检测下限为0.40阳/m1，且该固定化方法具有重复性好、蛋白质的非特异性吸附影响较低的特点。 (3) TriS改性的褐藻酸钠或通过肤胺而固定在金电极表面上的TriS改性的褐藻酸钠在CaZ十存在下引发固定抗体构建了电化学免疫传感系统和免疫传感器。通过对转铁蛋白免疫反应体系来评价这两种技术固定抗体技术的可行性。实验证明此免疫传感器具有重现性好、重复使用性能良好及蛋白质的非特异性吸附影响低等特点。用该传感器检测溶液中转铁蛋白的浓度的线性范围为0.2一30阳/m1，其检测下限可达0.05雌/m1;而采用免疫传感系统分析转铁蛋白的浓度线性范围为5.0一35协g/m1，其检测下限为2.3雌/ml，也具有蛋白质的非特异性吸附影响低等特点，但实验操作较传感器稍繁琐。 (4)纳米金(胶体金)可用于吸附固定抗体，己在免疫分析中得到广泛的应用。近年来的研究发现，纳米金能降低一些物质在电极上发生反应的氧化还原电位，并催化这些物质在电极上的电化学氧化还原反应。利用纳米金的上述特征，第八章设计了非标记的电化学免疫传感器用于直接测定溶液中的对氧磷含量。研究发现在纳米金存在下，对氧磷分子上的硝基能在一165mV的电位下被还原，在一O，smV电位下可被氧化;而无纳米金存在下，其电化学还原电位大于一800mV.应用该传感器检测溶液中对氧磷浓度的上限为1920林g/L，其检测下限可达12哪/L。 (5)该电极用于吸附固定转铁蛋白抗体构建了转铁蛋白电化学免疫传感器。实验表明，采用该电极研制的传感器在检测溶液中电活性组分时，较石蜡碳糊电极具有更高的灵敏度，且该电极能用简单的抛光技术处理而重复使用;采用竞争免疫分析方法及计时安培测量技术，该传感器能在浓度范围为0.5一70.。协g/ml实现对转铁蛋白的检测，其检测下限达0.35林g/m1，且具有良好的重现性、重复使用性和较低的蛋白质非特性吸附性能。
梁文斌[2]2008年在《基于纳米材料为载体的免疫传感器的研究》文中研究说明电化学免疫传感器是将免疫分析技术与电化学传感器相结合的一种新型免疫分析方法,是基于测量电流、电位变化来进行免疫分析的生物传感器。电化学免疫传感器在临床医学、环境和食品工业等方面都有重要应用,并以其体积小、专一度强、灵敏度高、检测快速方便、成本低和容易实现实时在线活体检测等优点,成为当前研究的热点之一。而电化学免疫传感器的性能主要取决于生物活性物质的固定方法,因此如何将生物活性组分有效地固定在电极表面上并保持其良好的生物活性是电化学免疫传感器研究和开发中最为重要的工作。近年来,纳米技术逐步进入生物传感器领域,并引发突破性的进展。纳米颗粒可以广泛地应用于敏感分子的固定、待测物质的富集和浓缩、信号的检测和放大。由于纳米结构有着优异的化学和物理性能,有着极高的比表面,有利于提高敏感分子的吸附能力,并能提高生化反应的速度,因此被广泛用于生物传感器表面吸附层的制作。本文正是基于以上考虑,探索和研究基于纳米材料为载体的一系列生物分子固定方法等。第一部分基于功能化纳米材料的免疫传感器的研究1.利用一种具有良好的导电功能的有机化合物制备了一种新型的具有良好导电性能的功能化纳米二氧化钛(PV-NTiP)材料,并将其应用于电化学免疫传感器的研究应用。采用简单的滴涂法将PV-NTiP修饰于电极表面,再静电吸附纳米金,并进一步固定抗体于修饰电极表面,制备成一种灵敏的电化学免疫传感器。通过循环伏安法(CV)和交流阻抗技术(EIS)考察了电极表面的电化学特性,并对该免疫传感器的性能进行了详细的研究。PV-NTiP的引入,使得电极的电流响应增强,并使得电化学免疫具有较高的灵敏度和较低的检测下限。该免疫传感器线性范围为1.25～200.0 ng·mL~(-1),线性相关系数为0.9982,检出限为0.6 ng·mL~(-1)。将该免疫传感器用于病人的血清样品分析,并应用F检验统计数据分析的方法将其与ELISA法的结果相比较,结果表明两者之间不存在显着性差异,即该免疫传感器能够代替现有的ELISA法应用于临床分析。2.据文献报道及大量的实验证明,纳米金具有良好的蛋白质吸附能力和生物兼容性,适用于生物分子,如抗体、酶等的固定。但是由于纳米粒子固定于电极表面形成纳米金层后,纳米粒子之间存在一定的空隙,一定程度上降低了纳米金层的导电能力,影响了电化学免疫传感器的电流响应及灵敏度等。基于此,我们合成了一种具有良好导电能力的双巯基功能有机化合物,并将其与纳米金联合形成具有高导电能力及良好生物兼容性的功能化金纳米粒子,将其修饰于玻碳电极表面后,形成比表面大、吸附性能强且高导电能力的功能化纳米金层,并进一步吸附甲胎蛋白抗体,将其固定到电极表面,从而制得甲胎蛋白抗原免疫传感器。该免疫传感器的线性范围为2.0～200.0 ng·mL-1,其线性方程为i=0.047 C_[AFP]+0.1803,线性相关系数为0.9983,检出限为0.8 ng·mL-1。同时对该免疫传感器的选择性和再生性能等进行了研究,表明该免疫传感器具有良好的性能,有望进一步应用于临床研究应用。第二部分基于磁性纳米材料的免疫传感器的研究1.在纳米技术发展过程中,纳米材料的开发和应用处于核心地位,纳米材料从根本上改变了材料的结构,被公认为是21世纪最具有前途的科研领域。纳米材料具有良好的吸附能力、催化效果等,尤其是磁性纳米材料更具有独特磁性等,在近年来的研究中受到了特别的青睐。通过磁性纳米粒子的掺杂可以使得导电能力较差的聚苯胺具有了较为良好的导电能力,从而应用于电化学传感器的研究。ITO导电玻璃是表面修饰有SnO_2/InO_2薄层,从而赋予了其一些特殊的性能,如良好的导电性、便于修饰等,另外其造价便宜、适合于机械加工等使得其在电化学免疫传感器的应用中具有独特的研究前景。采用滴涂法将聚苯胺掺杂Fe_3O_4纳米粒子固定于ITO导电玻璃表面用以吸附抗体,从而制得便捷、实用的电化学免疫传感器。采用交流阻抗及循环伏安等技术对电化学免疫传感器的制备过程进行了表征。研究发现,该免疫传感器具有良好的响应性能,其回归方程为i(μA)=-0.8037 C(ng/mL)+246.4,相关系数0.9975,检测限为0.6 ng/mL;同时,还对其选择性、再生性能进行了研究。2.电化学免疫传感器由于其简便、快速、灵敏度高等特点而具有良好的应用前景,然而其再生性能在一定程度上限制了其发展及在临床中的应用。我们采用制备的新型磁性金纳米线研制了一种新型的免再生电化学免疫传感器,并取得了良好的响应性能。电位响应差值△E(抗原抗体反应前后电位差)与AFP抗原浓度(C_(AFP))的对数值在0.4～50 ng·mL~(-1)范围内线性相关,回归方程为:△E=34.11C_(AFP)+39.43,相关系数(r)为0.9978,检测限为0.13 ng·mL~(-1)。
章毅[3]2015年在《高灵敏功能性生物传感器检测城市生活垃圾堆肥中污染物及特征物质的研究》文中认为本文考察了高灵敏生物传感器应用于城市生活垃圾堆肥复杂系统中污染物和特征物质检测的可行性和机制研究。结合目前已经完成的工作讨论了基于免疫分析的免疫传感器、基于寡聚核苷酸技术的DNA传感器和汞传感器,以及人工神经网络结合酶生物传感器检测堆肥系统中目标物的研究情况。重金属和有机污染物在堆肥处理的城市生活垃圾中很普遍,重金属(不能生物降解)和有机污染物尤其是难降解的持久性有机污染物,因为具有累积和富集的效应,即便浓度很低,也有可能给环境和人体带来严重危害。这类物质需要格外关注和严格监控,但由于城市生活垃圾来源广泛,使得堆肥系统成分构成复杂,具有不确定性;同时堆肥化体系反应复杂,给监测造成了巨大难度。使用传统监测方法,操作繁琐,在多种物质共存的条件下易受干扰,影响检测的精度和准确性,难以满足精确高效的现代监测技术的发展需求。生物传感器和在线检测策略是环境检测领域近年的研究热点。将生物传感器技术和在线检测技术应用于堆肥系统的监控领域,结合神经网络以及现代新型材料,开展用于检测环境污染物和生物大分子的生物传感检测研究,建立高灵敏、高选择性的新型动态分析检测和无损检测方法以及多元参数的检测监视方法,从而实现城市生活垃圾堆肥研究中的一项关键技术,提高堆肥过程监控。为环境科学与工程中的实际问题的解决提供新的科学工具。针对城市生活垃圾堆肥过程涉及广泛的检测目标种类和指标,本文围绕堆肥中一些具有代表性的污染物和特征生物活性物质,系统开展高灵敏生物传感器技术用于堆肥复杂系统中污染物及相关生物组分检测的研究,主要进行了以下4个方面的研究:(1)基于免疫反应,开发适用于检测堆肥中有机污染物的免疫传感器。以除草剂毒莠为代表,将这类小分子半抗原与牛血清蛋白结合,合成既有免疫原性又有反应原性的完全抗原,进而注射入活兔体内进行免疫培养,制备出高效价的毒莠定免疫抗体。采用竞争式的检测策略,利用顺磁性将负载有毒莠定免疫抗体的核-壳磁性纳米颗粒将固定在碳糊电极表面,在漆酶标记的毒莠定浓度固定的情况下,根据与不同浓度毒莠定竞争发生免疫反应,形成电化学信号变化,开发出一种高灵敏的电化学免疫传感器。在优化条件下进行I-t扫描,I-t响应电流的平均下降比DP(%)与待测毒莠定浓度的自然对数成线性关系,检测下限为1×10~(-4)μg/m L,线性范围为1×10~(-4)~10μg/m L,相关系数为0.9945,并用于堆肥体系和湘江水样中的毒莠定检测。基于脂质体包埋荧光素,研制出一种超灵敏的荧光免疫传感器用于堆肥体系和城市污水处理厂水样中的毒莠定检测。将FITC荧光素包埋在标记了毒莠定抗体的脂质体内。使用醛基功能化的玻片分别连续与毒莠定、脂质体标记的毒莠定免疫抗体反应。反应完成后,溶解脂质体释放FITC,并检测FITC的荧光强度。荧光强度和毒莠定浓度的对数呈线性关系,浓度的线性范围为1×10~(-4)~100ng/m L,相关系数0.996,检测下限达到1×10-5 ng/m L(S/N=3)。(2)利用环境功能性物质,结合新型纳米材料和生物分子材料,构建高灵敏生物传感检测体系测定目标物的研究。利用木质素过氧化物酶(Li P)的特异性保守DNA序列互补的DNA片段制备构建可识别堆肥中Li P的DNA保守序列的电化学DNA传感器。在堆肥处理城市生活垃圾过程中,微生物分泌的Li P被认为是启动微生物降解木质素的一种关键酶。通过检测Li P特定编码基因片段能够有效表征微生物降解木质素过程中Li P的动态变化情况。使用MNPs-Cys/MWCNTs-GNPs/Chi功能化电极,并构建基于酶联放大的竞争式基因杂交反应电化学传感体系。在优化条件下测定HRP催化的电化学氧化还原电流。I-t响应电流平均下降比和Li P目标链浓度的自然对数呈线性关系,浓度的线性范围为0.001~1μM,相关系数0.994,检测下限1 n M,灵敏度为2.707×103 m A/M cm。基于Hg~(2+)可以与DNA上胸腺嘧啶(T)特异性绑定的协调化学作用,进而形成T-Hg~(2+)-T错配的双链DNA构型的性质,使用富含胸腺嘧啶(T)的DNA探针开发新型汞传感器用于堆肥样品监测。开发了一种基于汞特异性DNA、3D纳米金簇和阴离子嵌入剂构建的电化学生物传感器进行堆肥浸出液等环境样品中的痕量汞的检测识别。在电极表面电沉积3D金纳米簇,并运用阴离子嵌入剂——2,6-蒽醌二磺酸钠(AQDS),显着改善了传感器的检测性能,并在环境样品的Hg~(2+)检测中表现出了良好的效果。该传感器具有较强的环境适应性、良好的选择性、灵敏性以及再生能力。优化条件下进行SWV检测,在浓度范围0.05~350 n M,峰电流响应与Hg~(2+)浓度的对数呈线性相关,相关系数为0.9952,检测下限为0.01 n M。还开发了一种基于石墨烯、纳米金以及功能化策略的超灵敏Hg~(2+)检测方法,在玻碳电极表面依次电沉积上石墨烯和纳米金,再自组装修饰上汞特异性DNA探针,配合亚甲基蓝标记的纳米金信号放大策略构建了一个超灵敏的电化学汞传感器。优化条件下,在浓度范围1.0 a M~100 n M,峰电流响应与Hg~(2+)浓度的对数呈线性相关,检测下限达到0.001 a M。(3)运用不同的功能化电极以及纳米金信号放大策略构建电化学传感器,进行电化学传感策略检测性能影响的机制研究,以便更有效地开发适用于堆肥复杂体系中目标物检测的电化学传感策略。分别使用纳米金功能化电极、金纳米簇功能化电极、碳纳米管-纳米金功能化电极、石墨烯-纳米金功能化电极,选取亚甲基蓝作为电化学信号指示剂,搭配纳米金信号放大策略构建电化学传感器检测相同的目标物。实验结果表明,纳米金载体信号放大策略对电化学检测性能具有一定的提升作用(效能约为30%),但是不同的功能化电极能够表现对电化学检测性能出更加显着的影响力(效能超过70%)。(4)结合人工神经网络(ANN),复杂环境体系中定量检测有机污染物的数据分析研究。基于核-壳磁性纳米粒子在电极表面固定漆酶的生物传感器,拓展构建了ANN模型与漆酶生物传感器检测系统快速、低成本定量分析堆肥浸出液中的对苯二酚含量。该检测系统不仅继承了生物传感器快速、简便,灵敏的优势,还能有效避免检测范围限制、信号重迭和干扰等影响,实现复杂环境污染物体系的快速准确检测。相比于直接使用漆酶生物传感器检测堆肥中对苯二酚,该检测系统利用非线性检测和ANN模型的预测能力,不仅将检测范围扩大到1.5×10-8M~3.6×10~(-4) M,优于已知的对苯二酚传感器,而且提升了检测精度,为开发可应用于复杂环境中污染物的高效在线检测系统奠定基础。总之,进行堆肥中污染物及特征物质的在线检测高灵敏传感器技术的研究,能够为应用传感器技术进行堆肥过程控制和堆肥产品安全监测提供理论基础和技术支持。开发高灵敏功能性生物传感器作为一种监测手段用于堆肥中污染物及特征物质的在线检测,具有良好的可行性,能够有效避免干扰进行目标物特异性的检测,并具有良好的检测精度,是一种极具发展潜力的符合现代技术要求的新型监测方法。
陈婧怡[4]2016年在《新型生物电化学传感器的构建与研究》文中研究说明生物电化学传感器是一种基于生物材料(如:酶、抗原、抗体等)作为敏感元件与电极之间转换为电化学信号输出的传感器。该方法具有灵敏度高、成本低、检测设备简单等优点。其中生物蛋白分子的固载是构建高性能生物传感器的一个关键步骤,因为该步骤不仅仅影响了生物蛋白分子固定量的多少,也间接影响了其生物活性的大小。通常利用纳米颗粒来有效固载生物分子,借助纳米颗粒的良好生物兼容性来保持酶的活性。然而,单独的纳米颗粒容易在电极表面上发生聚集,使得纳米颗粒大的比表面积得不到很好的利用,阻碍了电子的传输,也不利于蛋白质活性的保持。生物质多孔碳材料由于其来源广、可再生、环境友好、以及大的比表面积、高的孔隙率、短的扩散路径、快的质子传递、好的导电性、出色的吸附能力和容易的表面化学等优越的性能,可以当做支撑材料构筑生物电化学传感器。因此,如何保持生物分子在电化学传感器中的活性,增加生物分子在电极上的固载量成为了研究的热门问题。本论文从生物分子的固定化以及活性的保持出发开展了以下五个工作:1、在超低离子溶液中利用银纳米颗粒的氧化产生银离子,从而引起溶液中电导的变化来检测葡萄糖。首先,在氧气饱和溶液中,葡萄糖氧化酶(GOD)催化葡萄糖为葡萄糖酸的同时消耗氧气产生过氧化氢(H2O2)。接着,H2O2氧化柠檬酸叁钠包裹的银纳米颗粒(CCAgNPs)产生银离子(Ag+)同时伴随着柠檬酸根从CCAgNPs表面的脱落。产生的Ag+,葡萄糖酸及脱落的柠檬酸根引起了溶液中离子浓度的大大增加,从而进一步引起溶液中电导率的增加。通过检测电导率的增强,就可以间接检测出溶液中葡萄糖的含量。基于此成功地构建了一种新型的低离子强度的电导型葡萄糖传感器,其线性范围为0.06–4.0 mM,检出限为18.0μM。该新型电导葡萄糖传感器不仅仅实现了在实际样品(红牛饮料)中葡萄糖含量的测定,还首次提出了电导型生物传感器在葡萄糖检测中的应用。2、本工作,首次利用洋麻杆制备的叁维多孔碳材料(3D-KSCs)一步法直接固载生物大分子葡萄糖氧化酶(GOD)构筑葡萄糖生物传感器。处理好的3D-KSCs和3D-KSCs/GOD修饰电极通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)进行了形貌的表征。通过SEM和TEM图像可以看出,3D-KSCs是一种呈蜂窝状的大孔结构且在3D-KSCs表面还有一些微孔和缺陷。接着,通过循环伏安法和电化学交流阻抗法对3D-KSCs/GOD修饰电极进行电化学行为和电化学催化性能的探究。实验结果表明,该葡萄糖传感器有一个较宽的线性范围(0.1 mM~14.0 mM)和较低的检出限(50.75μM)。该工作最大亮点是,首次使用生物多孔碳实现了生物大分子的固载。3、本工作,首先合成了AuNPs-Ab2-GOD-ConA复合物作为探针,制备了BSA-Ab1/CHIT-AuNPs/3D-KSCs修饰电极作为信号收集转换器构筑了一个新型的叁明治夹心型pH开关行为的免疫传感器。通过原子力显微镜(AFM)、扫描电子显微镜(SEM)、紫外可见吸收光谱仪(UV)、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)对材料进行了探究与表征。利用免疫反应定量捕获癌胚抗原(CEA)后大大阻碍了Fe(CN)63-/4-在该修饰电极上的电子转移,从而导致了电阻的大大增加。其主要原因是因为捕获抗原以及标记探针后,蛋白质阻碍了电子传输能力并且探针所带负电对Fe(CN)63-/4-具有强烈的静电斥力。该过程利用电化学交流阻抗进行验证。该修饰电极具有大的比表面积可以装载大量的Ab1,并且具有pH开关行为的探针也大大提高了检测CEA的灵敏度。该新型免疫传感器对CEA的检测具有宽的线性范围(5 pg mL-1~50 ng m L-1),低的检出限(1.3 pg mL-1)和高的灵敏度(57.573μA ng m L-1 cm-2)。此外,该免疫传感器具有良好的重现性和稳定性。4、首先通过电沉积的方式将CHIT-AuNPs沉积在3D-KSCs上,接着首次将Tb@mesoMOF与CHIT-AuNPs/3D-KSCs结合并且构筑了新的一个支撑复合材料来固载微过氧化氢酶(MP-11)。MP-11分子与Tb@mesoMOF中的有机框架可以紧密结合是因为MP-11中的血红素通过π…π键与Tb@mesoMOF中的有机配位体叁嗪苯环相互结合。这强烈的相互作用使得MP-11分子可以保留在金属有机框架的孔洞中,并且对过氧化氢(H2O2)的催化活性也得到了保存。3D-KSCs材料具有非常大的有效表面积、叁维多孔碳结构和良好的导电性。MP-11/Tb@mesoMOF/CHIT-AuNPs/3D-KSC修饰电极的电化学行为和电催化性能通过循环伏安法和计时电流法进行测定。对H2O2具有良好的催化效果,其线性范围为5μM~0.5 mM,检出限为1.27μM(R=0.996;n=11)。因此,本工作首次构筑了Tb@mesoMOF与3D-KSCs相结合的生物电化学传感器为以后MOF与其他多孔碳材料结合从而提高酶的固载量提供了可能。5、通过碳纳米管(CNTs)与Tb@mesoMOF结合形成新的纳米复合材料构筑一个以葡萄糖脱氢酶(GDH)为敏感元件的葡萄糖传感器。该工作中,CNTs-Tb@mesoMOF复合材料作为基底将电子媒介体(MG)和GDH固载在电极表面构筑成一个简单的葡萄糖电化学生物传感器,并且CNTs-Tb@mesoMOF复合材料对于MG和GDH显示出极好的吸附能力。我们首先将CNTs-Tb@mesoMOF-MG复合材料固载在玻碳电极表面,接着将GDH固载在CNTs-Tb@mesoMOF-MG复合材料上。因此,该新型生物传感器对葡萄糖检测具有一个宽的线性范围(25μM~17 mM),低的检出限(8μM)(R=0.998,n=10)。
施志玉[5]2015年在《饲料中伏马菌素B_1电化学生物传感器检测方法建立与应用》文中提出霉菌毒素(Mycotoxins)是由各种霉菌产生的一系列有毒次级代谢产物。在不同的霉菌毒素中,伏马菌素是世界上玉米种植区最常见的霉菌毒素,由于其与人类和家畜疾病有关,因此玉米谷物中伏马菌素污染被认为是一个严峻的问题。伏马菌素包括伏马菌素B_1、B_2和B_3,是由多种镰刀菌产生的,主要自然产生于串珠镰刀菌、轮枝镰刀菌和多育镰刀菌。伏马菌素可导致马的脑白质软化症,这是在马中发生的一种严重甚至死亡的疾病,也可引起猪的致命疾病-猪的肺水肿综合症。伏马菌素已被国际癌症研究机构(IARC)列为人类可能的致癌物。近年来,霉菌毒素的检测技术不断发展,常见的检测技术有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)及酶联免疫吸附法(ELISA)等。其中高效液相色谱具有较高的灵敏度和可靠性,是当前使用最多的方法。但HPLC需要对样品进行提取净化,操作较为复杂,且检测周期较长。电化学生物传感器将生物分析方法与电化学传感器技术结合,既具有高选择性又兼有高灵敏性,在生物工程、环境监测、医药工业、食品安全和农业分析等领域有广阔的应用前景。纳米材料具有诸多优良特点,如比表面积大、催化活性高、亲和力强、具有优秀的生物相容性等,已广泛应用于电化学生物传感器的制备。近年来,具有微型化、特异性强、灵敏度高的电化学生物传感器技术成为霉菌毒素检测的发展趋势。本试验将饲料中的伏马菌素B_1(FB_1)作为研究对象,通过完全抗原的制备,以单克隆抗体技术为支撑,分别采用间接竞争和直接竞争的检测原理,以硫堇作为信号探针,对构建伏马菌素B,的电化学生物传感器进行了探索。试验Ⅰ基于纳米磁珠和石墨烯信号放大的电化学免疫传感器的构建为了制备FB_1的单克隆抗体并测定其效价,本试验采用戊二醛法将FB_1与卵清蛋白(OVA)载体蛋白偶联,制备FB_1完全抗原FB_1-OVA。偶联后的FB_1-OVA通过考马斯亮蓝试剂盒检测蛋白质含量为1 mg/mL。通过SDS-PAGE鉴定FB_1-OVA偶联成功,将其作为ELISA检测抗体效价的包被抗原。采用腹水制备技术制备腹水型FB_1单克隆抗体。首先,复苏培养杂交瘤细胞,观察细胞形态,测定细胞上清抗体效价及其稳定性。复苏的杂交瘤细胞形态良好,其上清抗体效价为1:1600,分泌抗体稳定性良好。其次,选取20只BALB/c雌性小鼠,腹腔注射杂交瘤细胞悬液。试验期间,每天观察小鼠生长情况,待小鼠腹部膨大时,收集腹水。利用HiTrap Protein G HP蛋白纯化柱纯化腹水获得FB_1的单克隆抗体,通过蛋白质含量测定,FB_1单克隆抗体的浓度为10mg/mL,经SDS-PAGE鉴定,FB_1单克隆抗体分子量为149.50kDa,且抗体纯度较高。通过ELISA测定,FB_1腹水单克隆抗体的效价为1:102400,可用于构建电化学免疫传感器。采用硫堇作为电活性探针,构建了一种新的以Fe_3O_4磁珠作为信号分子载体的电化学免疫传感器用于检测FB_1。首先,利用硫堇与石墨烯制备石墨烯硫堇复合物,通过紫外分光光度计表征石墨烯硫堇复合物合成成功。然后,将连有氨基的Fe304磁珠与羊抗鼠二抗通过戊二醛偶联,获得Fe_3O_4磁珠/Ab2偶联物。用EDC和NHS激活石墨烯硫堇复合物的羧基,与Fe_3O_4磁珠/Ab2偶联物氨基连接,成为该电化学免疫传感器的信号分子。本试验中采用金电极作为工作电极,将金电极浸入半胱氨酸进行自组装,通过戊二醛作为连接臂,修饰FB_1-BSA偶联物,用3%BSA溶液封闭非特异性结合位点。样品溶液中的FB_1与电极表面固定的FB_1-BSA偶联物竞争结合Ab1,信号分子与Ab1连接。通过循环伏安法检测电极表面硫堇的电流响应值对FB_1进行定量。本试验中,通过交流阻抗法对电极修饰过程进行电化学表征,结果显示电极表面进行了层层组装,对电子传递的阻碍逐渐增加。优化了电化学免疫传感器的检测条件,结果发现FB_1-BSA包被抗原的最佳浓度为100μg/mL,Ab1的最佳稀释比例为1:7000,Ab2的最佳稀释比例为1:10000,循环伏安法检测溶液最佳pH为7.0,FB_1与FB_1-BSA竞争结合Ab1的最佳孵育时间为40 min,反应温度为37℃。在最佳试验条件下,该免疫传感器的线性范围从10-8 mg/mL到10-4 mg/mL,线性方程为Ⅰ(μA)=55.7-66.2×1gCFB_1(mg/mL),相关系数为-0.9989,检测限为0.01 ng/mL。结果表明该传感器具有良好的重复性、重现性、稳定性和特异性。试验Ⅱ基于金纳米颗粒和石墨烯硫堇复合物双重信号放大电化学适配体传感器的构建本试验中,构建了一种基于金纳米颗粒和石墨烯硫堇复合物(GS-TH)双重信号放大的电化学适配体传感器用于检测FB_1。首先,通过改进的氯金酸还原法制备了金纳米颗粒,通过透射电子显微镜表征,制备的金纳米颗粒直径为13 nm。本试验中采用的工作电极为玻碳电极,将金纳米颗粒滴至电极表面干燥后,修饰捕获DNA,捕获DNA与适配体DNA特异性结合,将修饰电极浸入石墨烯硫堇溶液中自组装。通过循环伏安法检测探针硫堇的电化学信号。样品溶液中的FB,与适配体DNA发生特异性结合,使得石墨烯硫堇复合物从电极表面脱落,电化学信号降低。通过循环伏安法检测电极表面硫堇的减少量对FB_1进行定量。优化了电化学适配体传感器的检测条件,捕获DNA的最佳反应浓度为0.25μM,石墨烯硫堇复合物固定的最佳时间为3 h。在优化条件下,建立该电化学适配体传感器用于检测FB,的标准曲线,其中FB_1浓度的线性范围为10-12至10-4 mg/mL,线性方程为△I(μA)=1.175+0.067×1gCFB_1(mg/mL),相关系数为0.9982,FB_1的检测限为1 pg/mL。结果表明该传感器具有良好的重复性、重现性、稳定性和特异性。试验Ⅲ电化学适配体传感器与高效液相色谱法的比较在试验Ⅱ中已建立的电化学适配体传感器标准曲线,通过样品的加标检测,FB_1的最低检测限为1μg/kg。测定玉米、小麦和全价饲料样品中FB_1的回收率,添加FB_1浓度分别为5μg/kg、50μg/kg和100μg/kg,结果显示,叁种饲料的回收率均高于90.0%,变异系数均小于10.0%。本试验建立FB_1高效液相色谱法的标准曲线,FB_1的检测范围为10～1000 ng/mL,线性相关系数r为0.9998。通过样品的加标检测,FB_1的最低检测限为10μg/kg。测定玉米、小麦和全价饲料样品中FB_1的回收率,添加FB_1浓度分别为50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg,叁种饲料的回收率均高于80.0%,变异系数均小于10.0%。收集来自全国各地饲料送检样品62份,主要包括玉米、小麦、全价饲料等其他饲料。经过提取、净化后,分别采用电化学适配体传感器和HPLC检测样品中FB_1的含量。结果显示,62份饲料样品,两种检测方法的检出率均为100%。采用电化学适配体传感器检测全部饲料样品中FB_1平均含量为833.3μg/kg,高于HPLC检测值791.4μg/kg。比较适配体传感器和HPLC两种检测方法的相关性,将检出FB_1饲料的HPLC检测结果作为横坐标,同一样品的适配体传感器结果作为纵坐标,建立相关曲线,相关系数为0.9999,结果表明,适配体传感器和HPLC方法对于检测饲料中FB_1具有良好的相关性。以上结果说明电化学适配体传感器在线性范围内可用于农产品中FB_1的检测,与HPLC相比具有更高的灵敏度。
汤琳[6]2009年在《环境污染控制过程高灵敏生物传感技术研究及其检测体系构建》文中研究指明在环境污染控制过程中,污染物的降解大多是通过微生物的相互协同作用完成的,对污染物及参与降解过程的微生物的种群分布、功能活性和代谢产物变化等进行快速、灵敏的追踪、监测与时空分辨,是研究污染物降解过程的重要途径。生物传感技术是一种对待测物实现快速、实时、在线分析检测的新兴技术,它利用生物识别作用对待测的物质进行分析测定,与传统的分析方法相比,具有高灵敏度、高专一性、快速测定、简便易携、适用于复杂体系的实时、在线测定等优点,为环境污染物及其降解过程涉及到的各种生物组分或代谢产物的分析检测提供了一个新的技术平台。系统地构建环境污染控制过程中生物传感技术检测体系,为环境污染控制工作提供及时、准确的生物信息,对于解决环境科学与工程领域的实时、在线监测技术难题,最终实现自动化控制,推动环境检测技术大跨度发展具有重要意义。本文研制了一系列生物传感检测方法,用于环境中痕量污染物及其降解产物等的高灵敏检测,并以堆肥环境体系为例,建立起了一套基于生物传感技术的检测环境复杂系统中的污染物及参与其降解过程的生物酶、微生物种群、功能基因和代谢产物动态变化的新方法体系,克服了传统的分析检测方法在环境污染控制过程实时在线检测等方面的局限性,有利于深入了解整个垃圾堆肥处理过程的微生物学机理,高效指导微生物接种和堆肥工艺革新。论文工作从整体上分为四个部分:第一部分为环境中痕量有毒有害污染物及降解产物的高灵敏生物传感检测技术研究。通过采用二茂铁掺杂电聚合和伴刀豆蛋白A自组装等技术将酶固定在电极表面,构建了抑制型葡萄糖氧化酶传感器和抑制型辣根过氧化物酶传感器,分别用于检测土壤样品中的痕量Cr(VI)和Hg(II)与湘江水中的苯肼,具有灵敏度高、抑制可逆、稳定性和选择性好等优点,获得的Cr(VI)和Hg(II)的检测下限均为0.49μg L~(-1),苯肼的检测下限为1.7×10~(-6) M,并运用酶传感器实验数据,推导出了辣根过氧化物酶对H_2O_2、对苯二酚的催化反应以及苯肼对该反应的抑制作用的动力学模型,进行了模型拟合与参数估计;将有机氯农药毒莠定与牛血清蛋白交联制备人工抗原,并注射入新西兰大白兔体内提纯出抗体,研制了一种基于壳聚糖/纳米金复合膜的电化学免疫传感器,用于检测稻米、莴苣和稻田水中的痕量毒莠定,该免疫膜具有很好的选择性,灵敏度高,可批量制作、一次性使用,检测下限为5 ng mL~(-1) ;利用酚类物质普遍具有的还原性,研制了一种传感晶片,以固定在玻片表面的金纳米颗粒为晶种,运用在酚还原作用下金纳米颗粒催化增长的原理和吸收光谱变化规律,用于好氧发酵液等复杂体系中酚浓度检测,检测下限为7×10-6 M,该方法操作简便,成本低,灵敏度高;还利用漆酶催化邻苯二酚氧化还原反应和磁性颗粒分离技术,研制了一种基于磁性纳米颗粒固定技术的漆酶传感器,可用于检测堆肥复杂系统中的浓度低至7.5×10~(-7) M的痕量邻苯二酚。第二部分着重开展基于生物传感技术的堆肥系统微生物降解酶活性及生物表面活性剂的跟踪监测。堆肥系统中多种酶的活性是检测堆肥腐熟度的重要指标,本文利用电极表面固定化纳米金原位扩增对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化的生物电催化活性,研制了一种新型NADH电化学传感器,响应迅速,灵敏度高,能够在酸性缓冲液中检测浓度低至2.5×10~(-7) M的NADH,3个月内保持检测结果精确;利用在NADH还原作用下Au/Ag核壳型纳米颗粒催化增长的原理和吸收光谱变化规律,研制了一种NADH光学纳米生物传感晶片,检测下限为1.56×10~(-5) M;利用木素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)催化底物的氧化还原反应,研制了一种快速同步检测堆肥中木质素降解酶活的电化学酶传感器,检测样品LiP活性范围为8.14~29.79 U L~(-1) ,MnP活性范围为0.085~1.37 U L~(-1) ,该方法能够排除堆肥浸出液中浊度和光干扰物质的干扰,较传统的分光光度法更加快速、灵敏和精确,是堆肥系统中快速、低成本的堆肥腐熟度检测技术;堆肥常见微生物铜绿假单胞菌发酵代谢产生的鼠李糖脂是一种可改善堆肥微环境的生物表面活性剂,本文制备了二鼠李糖脂人工抗原和抗体,研制了一种基于3,3’-二氨基联苯胺(DAB)显色的二鼠李糖脂酶联免疫试纸,可用于肉眼检测浓度低至0.05 mg L~(-1)的二鼠李糖脂,该方法简便、快速,可重复性良好。第叁部分着重开展基于基因传感技术的堆肥系统微生物种群动态和功能基因的跟踪监测。堆肥中某些高效降解污染物的微生物具有相应的功能基因,LiP是真菌降解木质素的一种关键酶,设计合成了黄孢原毛平格菌lip基因探针,研制了一种夹心式杂交识别lip基因的酶联电流型DNA传感器,结合聚合酶链式反应(PCR)和限制性酶切技术,成功检测了黄孢原毛平格菌的基因组DNA提取样品中的lip基因,检测下限为0.03 nM,该DNA传感器能够有效识别相同长度的错配核酸链样品;纤维二糖水解酶(CBH)是纤维素降解的一种关键酶,设计合成了瑞氏木霉cbh2基因探针,运用纳米金原位扩增技术制备了一种金/硅/铁叁层复合型核壳磁性纳米颗粒,研制成竞争式杂交识别cbh2基因的电化学纳米DNA传感器,检测下限达到10-13 M;还将羧基化的多壁碳纳米管-多聚(3,4-乙烯二氧噻吩)复合膜沉积在电极表面,制备了cbh2基因传感器,优化实验参数,进行了扫描电镜(SEM)和电化学表征;细菌的16S rDNA/rRNA基因序列具有高度的保守性,可用于种属特异性鉴定,研制了一种基于分子信标荧光分析的铜绿假单胞菌16S rRNA体外定量检测方法,用于检测总RNA提取样品中的16S rRNA,杂交反应需时约30 min,该方法具有高度的特异性,不受核酸交叉污染,检测前不需要对细菌总RNA进行分离和纯化。第四部分为复杂环境体系污染物及降解性能定量检测的数据解析。由于环境样品组成复杂,干扰物质较多,多种待测组分可能同时存在,给分析监测带来很大的不确定性,本文利用人工神经网络(ANNs)解析信号的优良性能,将人工神经网络和电化学酶传感技术相结合,用于黄孢原毛平革菌接种堆肥中木质素降解酶活性电化学检测及漆酶传感器检测邻苯二酚的定量分析,与线性回归模型相比,该方法更加精确、灵敏、稳健;土壤阳离子交换量(CEC)是土壤保留阳离子营养物质和缓冲污染物能力的重要指标,本文还构建了一种基于径向基函数神经网络的土壤传递函数,用于定量分析不同地区、不同土层的土壤CEC,该复合神经网络模型在大规模数据拟合中具有优越性。
安海珍[7]2008年在《癌胚抗原及癌抗原15-3电化学免疫传感器的研究》文中研究说明癌胚抗原(CEA)和癌抗原15-3(CA 15-3)是国际公认的肿瘤标志物,目前被普遍应用于恶性肿瘤的辅助诊断、疗效评价和检测复发,如果血液中CEA或CA 15-3呈现较高浓度时,往往与肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝硬化及肝炎等疾病有很大的关系,因此,快速、准确地检测血清中CEA或CA 15-3的含量具有非常重要的临床价值。目前检测方法主要包括酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射性免疫法(RIA)和化学发光免疫法(CLIA)等,但这些方法操作复杂、检测时间长、有放射性污染等缺点。电化学免疫传感器在临床医学、环境监测、食品和发酵工业以及农业和国防等方面都有重要应用,并以其制备简单、灵敏度高、价格低廉、检测快速方便和容易实现实时在线活体检测等优点,成为当前研究的热点之一。近年来,国内外一些学者采用不同的固定方法将抗体固定在传感器上来检测肿瘤标志物,并取得了较好的进展,但其检测方法和灵敏度仍不能满足实际的需要,因此,开发高灵敏、简便、快速的检测方法对免疫传感器中抗原或抗体的检测具有重要的理论意义和实际应用价值。在电化学免疫传感器的构建中,如何有效地利用生物分子固定化技术及固定化材料决定着生物传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能。本文运用电沉积、静电吸附、共价键合等技术,利用具有强吸附作用的纳米颗粒(纳米金)和纳米复合材料(DNA/纳米银复合物)将不同的抗体固定在电极表面,实现抗原-抗体实时、在线检测;同时利用生物相容性良好的双链DNA(dsDNA)分子扩大电极的表面积,增加抗体的固定量,解决了传统免疫传感器灵敏度低、寿命短的缺点。本论文主要从以下几方面开展研究工作:1.利用纳米金和(3-巯基丙基)-叁甲氧基硅烷(MPTS)作为双重放大基质,研制成一种高灵敏电位型癌胚抗原(CEA)免疫传感器。MPTS通过-SH固定在金电极表面,并通过叁个-OCH_3为后续分子的固定提供更多的键合位点实现第一重放大。纳米金通过其大的比表面积和良好的生物相容性吸附更多抗体实现第二重放大。比较研究了戊二醛(GA)和MPTS共修饰的免疫传感器、纳米金和巯基乙胺(AET)共修饰的免疫传感器、纳米金和MPTS共修饰的免疫传感器的电位响应,证实了纳米金和MPTS的双重放大作用。另外研究了电极修饰过程中MPTS和羟胺(NH)的反应时间、抗原和抗体的孵育时间、孵育温度等实验条件和参数对传感器性能的影响。在最优实验条件下,该免疫传感器的线性范围是4.4～85.7 ng·mL~(-1),检出限为1.2ng·mL~(-1)。2.将硫堇聚合到玻碳电极(GCE)表面形成带正电的多孔聚硫堇(PTH)复合膜,通过静电吸附固定DNA/纳米银复合物,利用复合物中纳米银大的比表面积和强的吸附能力将癌胚抗体(anti-CEA)固定到电极表面,从而制得高灵敏的电流型癌胚抗原(CEA)免疫传感器。通过循环伏安法考察了电极表面的电化学行为,并对免疫传感器的性能进行了详细研究。在最优的实验条件下,用示差脉冲伏安法(DPV)对癌胚抗原进行检测,其线性范围为1.0～10.0 ng·mL~(-1)和10.0～80.0 ng·mL~(-1),线性相关系数分别为0.9983和0.9970,检测限为0.24 ng·mL~(-1),并将该免疫传感器用于血清样品中CEA的检测。3.利用电化学还原氯金酸(HAuCl_4)的方法将第一层纳米金固定在普鲁士蓝(PB)修饰的金电极(Au)表面,再通过共价键合固定双链DNA(dsDNA),最后电化学还原氯金酸将第二层纳米金固定在双链DNA的表面,利用纳米金大的比表面积和强的吸附能力将癌抗原15-3抗体(anti-CA 15-3)固定到电极表面,从而制得高灵敏的电流型癌抗原15-3(CA 15-3)免疫传感器。通过扫描电子显微镜(SEM)和循环伏安法(CV)考察了电极的修饰过程,并对免疫传感器的性能和影响因素进行了详细研究。在最优的实验条件下,用循环伏安法对癌抗原15-3进行检测,其线性范围为1.0～15.0 ng·mL~(-1)和15.0～240.0 ng·mL~(-1),检测限为0.6ng·mL~(-1)。该免疫传感器呈现较高的灵敏度、良好的选择性和较强的稳定性,并将该免疫传感器用于血清样品中CA 15-3的检测。
韩静[8]2015年在《基于碳纳米复合材料与信号放大技术构建电化学生物传感器的研究》文中提出电化学生物传感器是一种将电化学分析方法与生物学技术相结合而发展起来的具有响应快速、灵敏度高、选择性好、操作简单、成本低等优点的生物传感器。碳纳米材料(如石墨烯、富勒烯)因具有比表面积大、表面活性位点高及生物相容性好等优点被广泛的应用到生物传感器领域。近年来,基于新型纳米材料催化、酶催化以及生物学放大技术用于蛋白质检测的电化学生物传感器的研究颇受关注。本文的研究目的是将碳纳米复合材料、生物以及化学等多种放大技术相结合,实现高灵敏的检测。围绕本研究目的主要从功能化复合纳米材料的制备、敏感界面的构建以及新型信号放大技术的应用等进行了探索和研究。研究工作分为以下几个部分：1.电化学催化放大技术用于神经元特异性烯醇化酶的检测本文研制了基于金-石墨烯复合膜／铁氰化镍纳米粒子／纳米金修饰的电流型免疫传感器用于神经元特异性烯醇化酶(NSE)的检测。值得注意的是：1)基于铁氰化镍纳米粒子(NiHCFNPs)固有的电化学活性,NiHCFNPs修饰电极呈现出良好的氧化还原活性,可以用来指示免疫反应发生的进程,构建了无试剂型电化学免疫传感器。2)NiHCFNPs能够有效的催化DA,显着增强信号,避免了使用生物酶在标记过程中易失活这一缺点。3)金和石墨烯复合纳米材料(Au-Gra)具有比表面积大、吸附力强、生物相容性好等优点,大大提高抗体分子的固载量。该方法基于简单的直接法进行,不需要在测试溶液中加入其他的电活性物质,只需将NiHCFNPs固载到电极表面即可,具有操作简单、响应快速的优点。与传统的直接法相比,该传感器有较高的灵敏度,线性范围为0.001～100 ng mL-1,检测下限为0.3 pg mL-1(S/N=3)。2.基于多功能化洋葱状石墨烯层和双重催化放大构建电化学免疫传感器用于两种肿瘤标志物同时检测为了提高传感器的检测通量,本研究以功能化洋葱状石墨烯层结合双重催化放大技术构建了一种夹心型电化学免疫传感器,实现了基于同一敏感界面对于游离前列腺特异性抗原(fPSA)及前列腺特异性抗原(PSA)的同时检测。采用洋葱状石墨烯层为纳米载体,通过静电吸附作用在其表面修饰不同的电活性纳米材料,随后进一步固载亲和素(SA)和生物素标记的碱性磷酸酯酶(bio-AP),形成多重标记的洋葱状石墨烯纳米复合材料。当测试液中存在抗坏血酸酯(AA-P)时,bio-AP首先能够催化AA-P水解生成抗坏血酸(AA),接着,生成的AA进一步被电活性纳米材料(普鲁士蓝纳米粒子：PBNPs或铁氰化镍纳米粒子：NiNPs)催化产生DHA,实现双重信号放大。实验结果表明PBNPs和NiNPs具有良好的氧化还原可逆性且氧化还原峰电位相互分离,结合双重催化信号放大策略,完成了同时对两种目标蛋白质高特异和高灵敏的检测。该免疫传感器对fPSA和PSA的检测限分别达到6.7 pg mL-1和3.4pgmL-1。3.基于磁性石墨烯杂化微球构建电化学免疫传感器用于甲状腺疾病标志物的检测生物酶在标记过程中可能会影响蛋白的特异性位点,致使生物活性丧失。本研究基于杂交链式反应(HCR)为模板固载双酶(细胞色素c氧化酶和葡萄糖氧化酶)能够有效提高酶的固载量和很好的保持酶的生物活性。本文首先利用层层自组装方法制备以Si02为模板的磁性石墨烯杂化微球,该纳米材料集电化学氧化还原活性、磁性于一体,构建可再生的电化学免疫传感器。将制备的磁性石墨烯杂化微球作为纳米载体通过化学键合作用固载信标抗体和引物链S1,通过生物催化放大技术和双酶逐级催化有效的放大响应信号。基于夹心免疫反应,将该免疫传感器用于检测甲状腺疾病标志物,线性范围为0.05 pg mL-1～5 ng mL-1,检测限达15 fgmL-1。经实验研究证明该方法切实可行,为传感器灵敏度的提高提供了新的思路。4.基于多功能化的C60纳米复合材料作为信号标签构建电化学适体传感器随着对碳材料性质研究的进一步深入,C60作为一种生物传感材料开始被应用于电化学传感器领域。C60易溶于苯、甲苯和二硫化碳等非极性有机溶剂,但不溶于水,而且导电性能不高。为了改善C60的水溶性,我们用带有NH2活性端基的苝四甲酸(PTC-NH2)功能化nano-C60,基于超分子化学得到了水溶性好的C60纳米材料(FC60NPs)。接着通过化学键合作用在其表面修饰纳米金包裹的普鲁士蓝纳米粒子(Au@PBNPs),继而得到多功能化的C60纳米复合材料(Au@PB/FC60)。为了提高传感器的灵敏度,将碱性磷酸酯酶(AP)标记到Au@PB/FC60表面,在底物抗坏血酸酯(AA-P)存在下,AP首先能够催化AA-P水解生成抗坏血酸(AA),接着,生成的AA进一步被Au@PB/FC60催化产生DHA,实现双重信号放大。将该适体传感器用于检测血小板源性生长因子(PDGF),线性范围为0.002～40 nmolmL-1,检测限达0.6 pmol mL-1。实验表明,该适体传感器具有选择性好、灵敏度高,有望应用于临床检测中。5.C60纳米材料作为氧化还原纳米探针构建电化学免疫传感器用于兴奋剂的检测碳纳米材料因具有比表面积大、导电性及生物相容性好等特点通常作为纳米载体被广泛的应用到生物传感器领域,却很少被用作氧化还原纳米探针。C60除了具有上述碳纳米材料的优点外,还具有内在的氧化还原特性,如强的接受电子能力容易形成相应的阴离子。本文首先用聚酰胺-胺(PAMAM)功能化C60纳米颗粒(PAMAM-C60NPs),然后利用PAMAM-C60NPs表面大量的氨基可以吸附纳米金,得到了C60氧化还原纳米探针(Au-PAMAM-C60NPs)并用于标记信标抗体构建了夹心型免疫传感器。值得注意的是,当修饰好的免疫电极表面孵育四辛基溴化铵(TOAB)后,Au-PAMAM-C60NPs内在的氧化还原活性被唤醒,在-0.45～0.3 V的电位范围内得到一对可逆的氧化还原峰。基于夹心免疫反应,将该传感器用于检测兴奋剂(EPO),有较宽的线性范围和较低的检测下限,将其用于临床样品检测,得到满意的结果。此外,该研究工作为将碳材料作为氧化还原纳米探针用于电化学生物传感器的构建提供了新方法。
李丽华[9]2016年在《基于纳米粒子的光、电免疫传感器的构建及其在肿瘤标志物检测中的应用研究》文中提出癌症的诊断、治疗与预后与肿瘤的分期状态密切相关,越早诊断预示着预后越理想。而肿瘤的分期状态又与患者血清中肿瘤标志物的含量密不可分。因此,准确而灵敏地定量检测患者血清中肿瘤标志物含量显得非常重要。目前肿瘤标志物的定量分析主要采用免疫分析法,并在此基础上发展起来各种各样的免疫传感器。与其他类型的免疫传感器相比,荧光免疫传感器和电化学免疫传感器分别以其卓越的稳定性和灵敏性备受关注。但是随着癌症患者病情的不断变化,肿瘤标志物含量也在不断的变化,血清中某些肿瘤标志物的含量可能呈现出极低的水平,这就给现有的免疫传感器提出了更大的挑战,要求持续发展和构建灵敏度更好的免疫传感器。本论文中,我们将荧光分析方法的稳定性、电化学分析方法的灵敏性、纳米粒子的信号放大作用以及免疫反应的特异性有机结合起来,构建了几种新型的光学和电化学免疫传感器,对前列腺癌抗原、癌胚抗原及甲胎蛋白进行了单检测、双检测和叁检测的系列实验研究,开展的具体工作如下:1.基于SiO_2 NSs和HRP放大的荧光免疫传感器的构建及其对前列腺癌抗原的检测。本工作中,我们构建了一种简单的荧光免疫传感器,将一抗固定在96孔培养板中,采用二氧化硅纳米球(SiO_2 NSs)来负载辣根过氧化物酶(HRP)及其标记的二抗,在目标分析物前列腺癌抗原(PSA)存在的条件下,形成一个夹心型的免疫复合物,在L-酪氨酸和过氧化氢体系中,底物L-酪氨酸被催化氧化,生成能发射荧光的二聚体。通过荧光技术采集反应信号,实现了对前列癌抗原的光学测定。并利用红外光谱、紫外光谱及扫面电镜技术对实验中使用的纳米复合物进行表征。实验结果显示,该免疫传感器在最优的条件下检测范围为0.05~100 ng mL~(-1),检测限为0.01 ng m L~(-1)。2.基于Si/CdTe QDs和Si/Au NCs作为标记物的荧光免疫传感器测定两种肿瘤标志物。本工作中,我们设计了一种新型的荧光免疫传感器,采用磁珠作为捕获抗体固定的平台,碲化镉量子点(CdTe QDs)和金纳米簇(Au NCs)沉积的硅纳米球作双信号标记物,癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)作目标分析物,经过一个特异性的夹心免疫反应后,免疫复合物在550 nm和655 nm处发射出两个较强的荧光信号峰,它们分别对应的是CdTe QDs和Au NCs的荧光发射峰。在优化的实验条件下,荧光强度在0.1~400 ng mL~(-1)范围内与CEA和AFP的浓度呈线性关系。与此同时,我们还考察了该免疫传感器对人血清样本的实际分析能力以及免疫探针在细胞标记和细胞成像中的初步应用。3.基于金、银纳米粒子装饰的碳纳米球作为标记物的多分析电化学免疫传感器。在这个工作体系中,我们发展了一种多分析的电化学免疫传感器,碳纳米球(CNSs),形貌统一并具有良好的分散性,用作银纳米粒子(Ag NPs)、金纳米粒子(Au NPs)、硫堇(Thi)和二抗固定的载体,制备了两种复合物CNSs@Ag NPs-Ab_2和CNSs@Thi-Au NPs-Ab_2,用作电化学信号探针。CEA和AFP作为模型蛋白质。而金纳米粒子/氧化还原石墨烯复合物用作传感界面。在CEA和AFP同时存在的条件下,两种信号探针通过抗原-抗体反应结合到修饰的电极表面,形成夹心型的免疫复合物。在差示脉冲伏安曲线中,能观察到两个区分明显的信号峰,峰电位分别在+0.16V和-0.33V,对应的是Ag NPs和Thi的氧化峰位置。实验结果表明,两种肿瘤标志物能在0.01~80 ng mL~(-1)范围内被灵敏的检测,检测限分别低至2.8 pg mL~(-1)(CEA)和3.5 pg mL~(-1)(AFP)。4.基于金属离子标记的纳米复合物作为信号探针的多分析电化学免疫传感器。本项工作中,基于金属离子标记的纳米复合物作为信号探针,我们发展了一种多分析的免疫传感器,为同时测定叁种肿瘤标志物。我们将金纳米粒子沉积在玻碳电极上来固定叁种一抗,而免疫探针则是通过分别组装叁种金属离子(Pb~(2+)、Cd~(2+)、Zn~(2+))和对应的二抗在金纳米粒子/碳纳米球复合物上来制备。在叁种肿瘤标志物(PSA、CEA、AFP)同时存在时,能在传感界面上形成叁种免疫复合物。在方波伏安曲线中得到叁个区分明显的信号峰,峰电位分别在-0.63 V(Pb~(2+))、-0.85 V(Cd~(2+))和-1.12 V(Zn~(2+))。实验结果显示,该传感器具有良好的选择性和较高的灵敏度,无明显的交叉反应,可以用作同一个体系中多个肿瘤标志物的同步分析。
刘海凤[10]2012年在《基于二氧化钛纳米管的信号增强型电化学生物传感器研究》文中研究说明生物传感器是一门涉及化学、生物学、医学、物理学、电子技术等诸多领域的交叉学科,在工农业生产、临床医学、环境保护等诸多领域的应用有着广阔前景。近年来纳米技术的飞速发展,使生物传感器的发展也进入了新阶段,并产生了探究纳米材料在生物传感技术中的应用这一崭新的研究领域。与传统的生物传感器相比,纳米生物传感器表现出了更高的灵敏度以及其它许多优越的性能。本论文在综述了纳米材料和生物传感器的研究背景及其最新发展和应用的基础上,又着眼于纳米材料在生物传感器的应用方面的研究。制备了二氧化钛纳米管和金纳米粒子,尝试将其应于构建新型电化学传感界面,以期待制得更加稳定、灵敏的电化学生物传感器。具体内容如下：第一章综述了生物传感器和纳米材料的概念及其最新发展和应用,介绍了电化学生物传感器的原理及功能生物分子的固定化技术,在此基础上,还介绍了纳米技术在生物传感器中的应用。纳米技术引入生物传感器领域后,其化学和物理性质以及对生物分子的检测灵敏度大幅提高,检测的反应时间缩短了,最后简述了本论文的工作和意义。第二章主要是致力于制备出一种基于二氧化钛纳米管(TiNTs)阵列的多功能信号放大的电极界面,并将其应用于临床免疫检测常用模拟分析物一抗原的检测。首先是以阳极氧化法制备的二氧化钛纳米管阵列(TiNTs)作为免疫传感平台,通过共价键合作用将抗体分子固载于其上；以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体修饰金纳米粒子作为免疫识别分子,用于构建电化学免疫传感器。实验结果表明,一方面,由于二氧化钛纳米管比一般的纳米材料具有更大的比表面积,固载在二氧化钛纳米管电极表面的免疫分析物的量远远大于平板电极；另一方面,金纳米粒子的使用增加了单位免疫反应引入的HRP量,同时金纳米粒子促进了固载在二氧化钛纳米管阵列电极上的HRP与溶液中H202的催化氧化还原反应。使其对H202的电化学信号明显增大。该传感器的线性范围100pg/mL～100μg/mL,检出限为10pg/mL。且在4℃下保存2个月后,对H202的响应电流,仅下降了28.3%。在第叁章中,我创新性地在二氧化钛纳米管(TiNTs)阵列的管壁原位生成金纳米粒子(AuNPs),构建了AuNPs/TiNTs电极,该电极界面为生物大分子的固定化和电子传递提供了理想的平台。首先在TiNTs的管壁吸附牛血清白蛋白(BSA),作为“牺牲”模板,将氯金酸根(AuCl4-)通过静电吸附作用与BSA表面的正电荷基团结合,利用TiO2优良的光催化性能,通过紫外光照将Au3+还原为AuNPs,同时将蛋白质模板分解除去。本文采用SEM,XRD等表征技术对制备的AuNPs/TiNTs复合膜材料进行了表征,实验结果表明AuNPs已成功地修饰在了TiNTs表面,AuNPs的直径约为4nm；这些在TiNTs管壁形成的AuNPs,作为纳米级“金属导线”能够有效地促进血红蛋白(Hb)与TiNTs的直接电子转移。并基于该AuNPs/TiNTs电极界面,成功构建了H202传感器,实现了对H202的分析检测,线性检测范围为0.01mmol/L～0.16mmol/L,检出限为2μmol/L。
参考文献：
[1]. 新型生物分子固定技术用于构建电化学免疫传感器的研究[D]. 胡舜钦. 湖南大学. 2003
[2]. 基于纳米材料为载体的免疫传感器的研究[D]. 梁文斌. 西南大学. 2008
[3]. 高灵敏功能性生物传感器检测城市生活垃圾堆肥中污染物及特征物质的研究[D]. 章毅. 湖南大学. 2015
[4]. 新型生物电化学传感器的构建与研究[D]. 陈婧怡. 江西师范大学. 2016
[5]. 饲料中伏马菌素B_1电化学生物传感器检测方法建立与应用[D]. 施志玉. 南京农业大学. 2015
[6]. 环境污染控制过程高灵敏生物传感技术研究及其检测体系构建[D]. 汤琳. 湖南大学. 2009
[7]. 癌胚抗原及癌抗原15-3电化学免疫传感器的研究[D]. 安海珍. 西南大学. 2008
[8]. 基于碳纳米复合材料与信号放大技术构建电化学生物传感器的研究[D]. 韩静. 西南大学. 2015
[9]. 基于纳米粒子的光、电免疫传感器的构建及其在肿瘤标志物检测中的应用研究[D]. 李丽华. 安徽师范大学. 2016
[10]. 基于二氧化钛纳米管的信号增强型电化学生物传感器研究[D]. 刘海凤. 东北大学. 2012