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枯草芽孢杆菌谷氨酰胺酶的表达和分子改造

2020-12-08阅读(967)

枯草芽孢杆菌谷氨酰胺酶的表达和分子改造

论文摘要

谷氨酰胺酶（Glutaminase,EC 3.5.1.2）能催化谷氨酰胺的γ-谷氨酰基水解,生成具有鲜味的谷氨酸,在酱油等传统酿造食品加工过程中具有应用良好的应用潜力。针对酱油生产工艺中高盐和高温的特点,本研究以来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168的谷氨酰胺酶（YbgJ）为研究对象,基于B.subtilis WB600表达系统,通过饱和突变及N端融合自组装双亲短肽（Self-assembling amphipathic peptides,SAPs）等策略对谷氨酰胺酶的耐热性和耐盐性进行改造,以期提高其应用效果。主要研究结果如下:（1）谷氨酰胺酶的表达及性质分析将YbgJ基因克隆至载体pP43NMK,构建得到表达质粒pP43NMK-YbgJ,并转化B.subtilis WB600进行表达。酶活检测表明,重组B.subtilis WB600发酵15 h时,胞内谷氨酰胺酶活达到最高值149 U?mL-1。SDS-PAGE分析显示,重组B.subtilis WB600胞内具有分子量约为37kDa蛋白条带,与YbgJ理论分子量基本一致。经镍柱亲和层析纯化得到具有活性的YbgJ并进行酶学性质分析,结果如下:YbgJ比酶活达到563 U?mg-1;最适反应温度和55℃半衰期(t1/2)分别为50℃和10.79 min;最适反应pH为9.0,在pH 7-9,40℃保温6 h,残余酶活超过80%。在pH 5的酱油发酵模拟体系中,添加YbgJ（每5 mL模拟体系中添加2 U酶）后谷氨酸的含量较对照组（不添加YbgJ）提高了54%。上述结果表明,重组YbgJ在酱油增香工艺中具有应用潜力。（2）饱和突变提高谷氨酰胺酶的热稳定性为了提高YbgJ的热稳定性,利用Discovery studio 2018对YbgJ中具有不利相互作用的49个氨基酸进行虚拟突变,确定了影响酶热稳定性的关键氨基酸位点E3、E55、D213。对上述3个位点分别进行饱和突变,筛选得到55℃的t1/2较野生酶分别提高58%、69%和41%的突变体E3C、E55F和D213T。构建复合突变体E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T,其t1/2分别较野生酶提高173%、144%、122%和97%。其中,E3C/E55F比酶活较野生酶提高23%,达到693 U?mg-1。进一步分析作用力发现,突变体E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T分别较野生酶增加30、23、11和8个氢键及减少5、4、4和3个不利相互作用。结果表明,酶分子内部关键氨基酸的替换对YbgJ热稳定性有较大的影响,且分子内部不利相互作用的减少和氢键的增加可能是YbgJ热稳定性提高的重要原因。（3）N端融合SAPs提高谷氨酰胺酶的耐盐性为了提高YbgJ的耐盐性,基于B.subtilis WB600表达系统,将两类双亲短肽（AEAK、LELK）及PT-Linker分别融合至突变体E3C/E55F/D213T的N端,得到融合酶AEAK-E3C/E55F/D213T和LELK-E3C/E55F/D213T。值得注意的是,融合LELK的YbgJ主要以活性包涵体形式表达。与E3C/E55F/D213T相比,AEAK-E3C/E55F/D213T和LELK-E3C/E55F/D213T在18%NaCl溶液中处理120 min的残余酶活分别提高6.4倍和7倍,55℃的t1/2分别提高58%和69%。在pH 5的酱油发酵模拟体系中,添加AEAK-E3C/E55F/D213T和LELK-E3C/E55F/D213T（每5 mL模拟体系中添加2 U酶）谷氨酸的含量分别较对照组（添加E3C/E55F/D213T）提高69%和114%。研究获得的耐盐性及热稳定性提高的融合酶将有助于谷氨酰胺酶在酱油加工过程中的工业化应用。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 谷氨酰胺酶概述
  •     1.1.1 谷氨酰胺酶催化反应及酶来源
  •     1.1.2 谷氨酰胺酶的结构与功能
  •     1.1.3 谷氨酰胺酶的应用
  •   1.2 谷氨酰胺酶的生产
  •     1.2.1 野生菌发酵
  •     1.2.2 异源表达研究现状
  •   1.3 谷氨酰胺酶的酶学性质及稳定性改造
  •     1.3.1 谷氨酰胺酶的酶学性质
  •     1.3.2 谷氨酰胺酶的稳定性改造
  •   1.4 酶热稳定性及耐盐性改造策略
  •     1.4.1 点突变提高酶稳定性
  •     1.4.2 融合双亲短肽提高酶稳定性
  •     1.4.3 酶分子稳定性改造的其他策略
  •   1.5 研究意义及主要研究内容
  •     1.5.1 研究意义
  •     1.5.2 主要研究内容
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 菌株与质粒
  •     2.1.2 主要仪器
  •     2.1.3 培养基
  •     2.1.4 主要试剂
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 分子生物学操作
  •     2.2.2 YbgJ基因的克隆和表达载体的构建
  •     2.2.3 YbgJ突变体构建
  •     2.2.4 融合双亲短肽的YbgJ重组质粒的构建
  •     2.2.5 培养方法
  •     2.2.6 YbgJ纯化方法
  •     2.2.7 分析方法
  •     2.2.8 酱油发酵模拟体系的构建
  • 第三章 结果与讨论
  •   3.1 谷氨酰胺酶的表达及性质分析
  •     3.1.1 谷氨酰胺酶基因的克隆及其表达载体的构建
  •     3.1.2 谷氨酰胺酶在B.subtilis600中的表达与纯化
  •     3.1.3 YbgJ酶学性质
  •     3.1.4 YbgJ在酱油发酵模拟体系中的应用
  •   3.2 饱和突变提高谷氨酰胺酶的热稳定性
  •     3.2.1 YbgJ突变位点的确定
  •     3.2.2 YbgJ突变体的构建与表达
  •     3.2.3 YbgJ突变体酶学性质分析
  •     3.2.4 复合突变提高YbgJ热稳定性
  •     3.2.5 YbgJ突变体的稳定化机制分析
  •     3.2.6 YbgJ在酱油发酵模拟体系中的应用
  •   3.3 融合自组装双亲短肽提高谷氨酰胺酶耐盐性
  •     3.3.1 YbgJ融合酶构建与表达
  •     3.3.2 E3C/E55F/D213T及融合酶的纯化与性质
  •     3.3.3 E3C/E55F/D213T及融合酶的耐盐性
  •     3.3.4 E3C/E55F/D213T及 AEAK-E3C/E55F/D213T在盐溶液中的储存稳定性
  •     3.3.5 E3C/E55F/D213T及融合酶表面疏水性分析
  •     3.3.6 E3C/E55F/D213T及融合酶粒径分析
  •     3.3.7 酱油发酵模拟体系中E3C/E55F/D213T及融合酶的应用
  • 结论与展望
  •   主要结论
  •   展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录 ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 陈笑

    导师: 李江华

    关键词: 谷氨酰胺酶,枯草芽孢杆菌,热稳定性,耐盐性,饱和突变,自组装双亲短肽

    来源: 江南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 江南大学

    分类号: Q78;Q55

    总页数: 52

    文件大小: 3121K

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