颜晔[1]2003年在《STAT3与巢蛋白在神经发育过程中的表达与功能研究》文中指出第一部分 STAT3基因在神经发育过程和COS7细胞中的表达与功能研究信号转导和转录激活蛋白Stat3在细胞的生长、分化、存活和运动过程中扮演重要角色。Stat3基因敲除小鼠在胚胎发育早期死亡，表明该基因在胚胎发育过程中起重要作用。本文首先利用免疫组化方法观察E10.5至P1期间Stat3蛋白在中枢神经系统和眼睛中的表达模式,发现其表达区域随发育进行而变化，并且其活性形式——酪氨酸磷酸化的Stat3Y705蛋白在神经管发育中的分布较Stat3蛋白更局限在一些特定的区域。其次，蛋白免疫印迹实验表明Stat3蛋白及Stat3Y705蛋白在E10.5至P20小鼠大脑，神经管，小脑，视网膜和晶状体的各发育阶段都存在，而且它们的表达水平随发育进行而变化。凝胶阻滞实验分析表明发育过程中的Stat3活性蛋白可以在体外与顺式元件hSIE结合形成DNA-蛋白复合物。进而通过卵内电转技术在鸡胚中转入Stat3特异识别元件所指导的报告基因，发现Stat3蛋白在鸡胚的中枢神经系统与眼睛发育过程被激活，并与顺式元件结合，启动报告基因的表达，而转入显性失活的Stat3F cDNA则减弱了报告基因的表达。这些结果表明Stat3蛋白在中枢神经系统和眼睛发育过程中存在并被激活，Stat3活性蛋白在体内与其特异反应元件形成转录复合物。提示Stat3蛋白在中枢神经系统和眼睛的发育过程中发挥重要作用。另一方面，分别通过免疫细胞化学染色、免疫沉淀结合免疫印迹及瞬时转染Stat3特异识别元件所指导的报告基因等方法，从Stat3蛋白的胞内分布、<WP=3>酪氨酸磷酸化及与特异识别元件的结合活性叁方面说明COS7细胞中存在活性Stat3蛋白的表达。Stat3 cDNA和报告基因在COS7细胞中的共转染实验表明，外源的Stat3蛋白具有DNA结合活性，并可增强报告基因的表达。过量表达Stat3的COS7细胞呈现显着的细胞形态变化，如：细胞体积增大，胞体伸出突起，有些突起有分枝和伪足。继而转染显性失活的Stat3F cDNA，抑制Stat3蛋白的酪氨酸磷酸化从而阻遏了Stat3蛋白的活化，但细胞仍然发生类似的形态变化。这些结果提示Stat3蛋白在细胞骨架的重建，细胞的粘附和迁移过程中可能具有重要功能。而Stat3蛋白的这种新的功能可能是通过一种新的机制直接调节细胞骨架蛋白的聚合来实现的。关键词: Stat3; Stat3Y705;中枢神经系统; 眼睛; 发育; 卵内电转; COS7细胞;过量表达；细胞形态；Stat3F第二部分 小鼠巢蛋白基因(Nestin)的表达与功能研究 巢蛋白(Nestin)属于第六类中等纤维蛋白家族，是神经干细胞的特异分子标记。继大鼠、人和仓鼠的Nestin基因被克隆后, 本实验室近年来又克隆了小鼠的Nestin基因。其cDNA全序列为5983 bp，编码1821个氨基酸的蛋白质。本文首先建立了稳定转染小鼠Nestin cDNA全长的NIH/3T3细胞株, RT-PCR结果显示细胞中存在Nestin mRNA的过量表达，但蛋白免疫印迹实验不能检测出Nestin蛋白质的表达。将去除5'和3'非翻译区序列的Nestin cDNA开放阅读框与EGFP的融合蛋白表达质粒瞬时转染COS7和NIH/3T3细胞，免疫染色结果显示EGFP-Nestin融合蛋白能过量表达，而且呈典型的纤维状细胞骨架结构。这一结果表明我们克隆的小鼠Nestin cDNA在转染的哺乳动物细胞中可以表达出活性的中等纤维蛋白，并能整合到细胞骨架中。小鼠Nestin cDNA的克隆为进一步研究该基因的功能及其在神经干细胞研究<WP=4>中的应用打下良好基础。 神经元的生长锥是神经突末端的高度能动结构，介导了神经突的生长和导向作用，主要含有两种细胞骨架成分：肌动蛋白丝(F-actin)和微管。我们通过抗体免疫荧光染色发现Nestin在分化中的P19神经元的神经突及生长锥中分布。在原代培养的小鼠小脑颗粒细胞中，Nestin/MAP2或Nestin/GAP43免疫荧光双标记显示，Nestin在颗粒细胞的神经突以及生长锥的中心区域存在较强的分布。而随着神经元细胞间联系的建立，神经突中Nestin的分布从远端逐渐向胞体消失。这些结果提示Nestin可能参与了神经元轴突延伸时生长锥的导向作用和神经元间神经联系的建立。
汪鑫平[2]2009年在《Survivin及STAT_3蛋白在人脑星形细胞瘤的表达及相关性研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨信号转导与转录激活因子3(STAT3)和生存素(Survivin)在人脑星形细胞瘤组织中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学Elivision方法检测53例脑星形细胞瘤和10例正常脑组织中STAT3、P-STAT3(磷酸化STAT3)及Survivin的表达水平。结果:STAT3、P-STAT3及Survivin在脑星形细胞瘤组织的阳性表达率增高,与正常脑组织相比,统计学有显着差异(X2值分别为8.62、9.29、11.47,P值均﹤0.05)。并且STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白的高表达与星形细胞瘤病理级别有关(P均<0.05),与患者性别、年龄、发生部位无关(P值均﹥0.05)。STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白存在正相关。结论:STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白可以作为判断星形细胞瘤恶性程度的一个重要参考指标。STAT3、P-STAT3与Survivin蛋白可能参与脑星形细胞瘤的形成和发展。
许磊[3]2015年在《利用胚胎干细胞神经分化模型对多溴联苯醚神经发育毒性机制的研究》文中认为研究目的通过建立小鼠胚胎干细胞体外胰岛素-转铁蛋白-硒-纤维连接蛋白(Insulin-Transferrin-Selenium-Fibronectin, ITSFn)神经分化培养模型,观察叁种多溴联苯醚(Pentabromocyclododecenes, PBDEs)的神经发育毒性作用机制,并确定作用的关键环节,为进一步研究PBDEs的神经发育毒性探索新的思路和研究手段。研究方法1.建立五阶段的神经分化模型：阶段一,体外培养未分化的小鼠胚胎干细胞；阶段二,ESCs悬滴培养得到拟胚体,EB培养2天使其贴壁；阶段叁,ITSFn筛选培养基筛选神经前体细胞(Neural precursor cells, NPC) (5-7d);阶段四,对NPC进行扩增和维持；阶段五,NPC分化为多巴胺能神经元和少量神经胶质细胞。2.利用Real Time-PCR检测神经特异性基因表达；利用免疫组织化学方法检测神经特异性蛋白表达；选用MPTP检测神经元的存在。3.采用Real Time-PCR检测PBDEs对相关分化基因表达的影响；利用ELISA及比色法检测细胞毒性、氧化应激的变化；通过流式细胞仪检测凋亡状况；利用免疫荧光法及Image Pro Plus 6.0分析突触延伸和突触联系的变化。4.受试物PBDEs及甲状腺素剂量设置以噻唑蓝法确定的半数抑制率(50% inhibitory concentration, IC50)为依据。结果1.随着神经分化的进行,在神经前体细胞和神经元成熟阶段(阶段模型四、五),分化获得的神经样细胞表达神经元特异性基因、蛋白,并具有分泌神经递质多巴胺的功能,并且细胞对于神经选择性毒物MPTP具有较强的敏感性。2. PBDEs在神经分化起始阶段对ES细胞Nanog、Sox2、Oct4基因表达有促进作用,在神经分化过程中对Basic helix-loop-helix, Netrin-1, Olig2, Nkx6.1基因表达有抑制作用；而加入甲状腺素,可有效的抑制PBDEs对神经发育中标记基因netrin-1和olig2的表达干扰。3. PBDEs显着增加神经分化的ES细胞的氧化负荷如GSH, SH, GSSG, ROS,显着降低抗氧化能力如SOD、GSH-PX和CAT活性,集中影响于神经前体细胞期到神经元成熟期；甲状腺素对于PBDEs的增加氧化负荷效应有抑制作用。PBDEs显着降低神经分化细胞的抗氧化能力如过氧化氢酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、过氧化氢酶(CAT),影响作用集中于神经分化的胚胎期、神经前体细胞及成熟神经元分化增殖期；甲状腺素只对PBDEs对GSH-PX的干扰有抑制作用。4. PBDEs在nesting田胞筛选阶段和神经前体细胞形成期,具有较强的细胞凋亡诱导作用；甲状腺素对于这种凋亡诱导没有抑制作用。5. PBDEs具有神经细胞毒性,显着降低细胞膜的钠钾ATP酶活力和钙镁ATP酶活力,影响集中于神经前体细胞形成阶段；甲状腺素对PBDEs干扰钙镁ATP酶的作用具有抑制作用。6. PBDEs会降低树突、轴突长度,影响集中于神经前体细胞及成熟神经元形成阶段；甲状腺素对此作用有抑制作用。7. PBDEs对神经分化获得神经元的突触前蛋白形成有影响,对突触后蛋白形成的影响较小,甲状腺素对此作用有抑制作用。结论1.小鼠干细胞ITSFn神经分化模型在基因表达、蛋白、功能方面均有效重现了神经发育过程,可以用于神经发育毒性研究。2.叁种PBDEs均具有一定的神经发育毒性作用,且可通过影响分化基因表达,增加氧化负荷,降低抗氧化能力,影响细胞膜ATP酶活力,诱发早期凋亡,影响发育中神经突触的延伸等机制实现。3.PBDEs的神经发育毒性作用的关键阶段集中于神经前体细胞形成阶段和成熟神经元分化阶段。4.甲状腺素对于PBDEs的神经发育毒性的多个作用途径,都具有抑制作用。
邹东华[4]2016年在《RBM8a基因在胚胎神经祖细胞增殖和分化中的重要作用研究》文中研究表明智力障碍(Intellectual Disability,ID)在神经和精神疾病中十分常见,比如在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、自闭症(Autism spectrum disorder,ASD)中十分常见。智力障碍的病人的智商(Intellectual Disability,IQ)往往较正常人低,小孩子伴有智力障碍者在学习语言、社会交往、自理能力方面较正常孩子缓慢。而自闭症是一种以社会交往和沟通能力受损,重复的、刻板的行为学并常常伴有智力和认知功能障碍为特征的神经发育障碍性疾病。无义介导的m RNA降解(Nonsense Mediated m RNA Decay,NMD军控制RNA平衡和保证大量不必要的转录因子快速降解的一个RNA监控机制。这个机制依赖于外显子连接复合物(Exon Junction Complex,EJC)的多个核心因子:真核细胞翻译起始因子4AIII(Eukaryotic Translation Initiation Factor 4AIII,e IF4AIII)、肿瘤易感候选基因3(Barentsz,BTZ)、人类同源果蝇Mago nashi蛋白(human homolog of Drosophila mago nashi protein,MAGOH)和核糖核酸结合基序蛋白8a(RNA-binding motif protein 8A,RBM8a)及其附近的一些因子来区分在正常转录的终止密码子之前的非成熟终止密码子(Premature Stop Codons,PTCs)。最近,研究表明无义介导的m RNA降解因子与神经发育性障碍疾病比如自闭症、精神分裂症(Schizophrenia,SCZ)、智力障碍性疾病有联系。有遗传学研究揭示NMD在神经发育、神经再生、细胞增殖和分化等功能有重要的作用,然而,这些因子是如何控制大脑发育的机制尚不清楚。核糖核酸结合基序蛋白8a(RNA-binding motif protein 8A,RBM8a)是一个在m RNA剪接过程中与RNA结合的核蛋白,RBM8a调节的特异性调控细胞功能尤其在调控神经祖细胞增殖、分化和大脑发育的功能尚未被完全明确。因此,本研究拟在检测RBM8a基因在胚胎神经祖细胞增殖和分化的功能,以明确RBM8a基因在调控大脑发育的作用,为揭示RBM8a在神经发育障碍性疾病的病因学提供理论基础。实验内容包括以下两部分:第一部分:RBM8a基因在胚胎神经祖细胞增殖和分化中的作用目的检测RBM8a在胚鼠不同阶段和成年鼠之间的表达差异,在体外细胞系和胚鼠大脑中神经祖细胞中过表达或沉默RBM8a,观察细胞增殖和分化的改变,以明确RBM8a基因在胚胎神经祖细胞增殖和分化中的作用。方法将不同阶段胚鼠和成年小鼠的大脑皮层组织分离、裂解并收集蛋白,使用western blot进行检测RBM8a的表达。分离14天胚鼠大脑中的神经祖细胞,并在体外诱导其分化,观察RBM8a的变化。收集16天胚鼠大脑并进行固定、冰冻切片,检测胚鼠大脑皮层RBM8a表达。构建沉默RBM8a的sh RNA和过表达的RBM8a质粒,并在CAD细胞系中证实其沉默和过表达的效果。在体外,分别用RBM8a的sh RNA和过表达的RBM8a质粒转染CAD细胞,并使用Brd U标记。在体内,利用子宫内胚胎电转移技术,将sh RNA和过表达RBM8a转移到14天的胚鼠大脑皮层的神经祖细胞内,并用Brd U标记,以观察RBM8a调控神经祖细胞的增殖、分化和调节细胞周期进程。结果1.RBM8a在胚胎早期神经祖细胞增殖的时候,RBM8a的表达水平很高,而当胚鼠逐渐发育,神经祖细胞分化的时候,RBM8a的表达水平亦随之降低。2.在体外,当神经祖细胞分化的时候,RBM8a的水平明显降低。在16天胚鼠大脑皮质的室管膜层和室管膜下层,RBM8a与巢蛋白阳性的神经祖细胞中大量表达,而在双肾上腺皮质激素阳性的迁移神经细胞和不成熟神经元聚集的中间层和皮质外层RBM8a表达明显减少。RBM8a在CAD细胞被沉默后细胞分裂指数明显降低,细胞增殖减少,而过表达RBM8a后,CAD细胞分裂指数明显升高,促进细胞增殖。3.在动物肾RBM8a可见以神经祖细胞为主室管膜层和室管膜下层的细胞减少,而增加了进入分化的神经元所在的中间层和皮质外层;相反,过表达胚鼠大脑皮质中的RBM8a后,转移至中外层的细胞减少而在室管膜层和室管膜下层的细胞增多,表明RBM8a正性调节神经祖细胞的增殖。4.在动物肾RBM8a时,细胞周期退出指数增加32%,导致神经祖细胞的减少,而分化成新生神经元增多;相反,过表达RBM8a后,细胞周期退出指数减少30%,导致神经祖细胞的增殖并抑制神经祖细胞分化成新生的神经元。结论RBM8a基因在调节早期神经发育扮演着重要作用;RBM8a促进胚胎神经祖细胞增殖和抑制神经元的分化;RBM8a在维持神经祖细胞增殖与分化的平衡中起重要作用。第二部分:基于RNA-seq技术对RBM8a调控的基因和信号通路分析目的通过以RNA-seq技术为基础的转录组学分析,识别大脑中RBM8a可能调控的神经精神疾病相关的下游基因和信号传导通路。方法构建过表达RBM8a质粒p TRIPZ-m Cherry-RBM8a和对照质粒p TRIPZm Cherry,将它们包装慢病毒载体,构建过表达RBM8a的SH-SY5Y稳定细胞系,利用强力霉素诱导过表达RBM8a在细胞系中表达,利用TRIzol试剂提取总RNA,使用Ribo Zero试剂盒选择性的去除r RNA。使用Illumina Hi-Seq2500平台,进行高通量RNA测序,使用软件工具分析过表达RBM8a与对照组之间有显着差异性表达的转录因子。将有差异性表达的基因列表与现有的不同的神经精神疾病数据库中高危基因相互对照,识别出他们之间重迭的基因,并进一步使用western blot在CAD细胞中验证RNA-seq有差异表达的基因的蛋白表达是否一致。利用DAVID生物信息分析软件,分析RBM8a下游有差异表达的基因可能参与调控的信号传导通路。最后分析本研究中有差异表达的基因是否导致有差别的选择性剪接,是否有通过NMD调控的靶点基因。结果1.成功构建过表达RBM8a质粒,提取总RNA并取出r RNA后,利用高通量RNA测序和分析,最终过表达RBM8a组和对照组的m RNA测序,超过95%的阅读都被映射到参考基因组。2.通过分析发现,过表达RBM8a后有7.08%的转录因子相对于对照组有差异。过表达RBM8a的众多下游基因与智力障碍、阿尔茨海默病、自闭症、精神分裂症数据库中的高危基因重合。自闭症高危蛋白(NLGN1列,退行性神经疾病蛋白(ATXN1列,神经再生蛋白(REST逐,胚胎发育(TLE4军脉移蛋白(KIF1A军RBM8a过表达CAD细胞中表达与RNA测序结果一致,而沉默RBM8a的CAD细胞中表达与RNA测序结果相反。3.DAVID生物信息工具分析结果提示RBM8a调控了包括丝裂学激促酶/MAP激酶等信号传导通路、生长因子信号传导通路、Rho信号传导通路、包含整合素和胶A倾览丁传导通路中的许多重要基因。4.本研究中371个选择性剪接事件中有101蛋白编码基因有显着性差异,这些选择性剪接的基因中许多与自闭症(Autism spectrum disorder,ASD)的高危基因相重迭,与ASD的发病机制密切相关。5.在有差异表达的1788个基因中有814个基因表明与NMD有关联,它们分别与ASD、SCZ、AD和ID的高危基因重合。结论无偏倚的RNA测序分析揭示了RBM8a调控着与许多退行性神经疾病、精神疾病密切相关的高危基因和早期神经发育的重要过程。
华进联[5]2005年在《人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究》文中进行了进一步梳理原始生殖细胞(PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的共同祖先。在体外适宜的培养条件下,PGCs 大量增殖形成与ESCs 高度类似的多能性细胞,称作EG 细胞。目前,小鼠和其他哺乳动物及人类:EG 细胞的分离培养均取得一些重要的进展,但有关人类PGCs 发育分化、体外分离培养体系及影响因素、无血清培养及检测、人类EGCs 的诱导分化特性等尚未见到系统的研究报道,本研究对上述4 个方面展开研究,以期探索出人类胚胎性腺生殖细胞发育分化规律;建立优化的人类EGCs 无血清分离培养体系;检测人类EGCs 的多向分化潜能,并在人类:EGCs 分离培养的基础上,向hEGCs 转染人类心肌α-actin 启动子,以探索人类心肌α-actin 启动子在人类心肌细胞分化中的作用。1 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究组织学观察人胚胎睾丸和卵巢,Ki67 在10 w 胚胎睾丸表达最强,卵巢则在20 w 强表达。Bcl-2 在11.5 w 胚胎睾丸强表达,而在胚胎卵巢发育中一直表达较弱。在5～12 w 的睾丸,PGCs 强表达AKP、Oct4、SSEA-1;13 w 后,随胎龄增大,Oct4、AKP、SSEAl 表达减少。在5～32 w 的卵巢内,Oct4、AKP、SSEAl 在8 w 内的生殖细胞强表达;但在14 w 以后卵巢,Oct4、AKP、SSEAl 表达逐渐减少。透射电镜观察,早期胚胎的生殖嵴/腺见到大量的PGCs,一般为圆形或椭圆形,细胞核大,核质比高,细胞器较少。在出现性别分化后,雄性可见有间质细胞和支持细胞,细胞器较为丰富。雌性可见较大的卵母细胞和颗粒细胞。2 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立5%～15%NBS 均可以满足HEF、MEF 生长,以8%～10%NBS 为宜。对H=EF 的培养, 以}tDMEM 和α-MEM 效果较好。对MEF 的培养,HDMEM 效果最好。MEF、STO、HEF 等制作好的饲养层细胞维持时间不能超过7 d , 一般为5 ～7 d 。研究了流产胎儿对hEGCs 分离克隆的影响,表明7～12 w 最适于hEGCs 分离克隆, 自雄性胎儿分离hEGCs 的成功率明显高于雌性。筛选了几种细胞因子对hEGCs 生长增殖的最佳剂量,表明RA 和Forskolin 的最佳剂量分别为10-6mol/L 和10 u mol/L;LIF 为5 ng/mL:bFGF 为10 ng/mL;TNFa 为25 ng/mL;TGFB 的添加不利于hEGCs 克隆增殖;进一步将各种细胞因子组合能提高hPGCs 克隆增殖率,以此提出hEGCs 的最优培养基为:HDMEM+15%KSR+0.1 mmol/L 2Me +O.1 mmol/L 非必需氨基酸+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 u/mL 青霉素+100 u/mL 链霉素,
林恒[6]2013年在《Klf4在小鼠成牙本质细胞分化中的作用》文中进行了进一步梳理一、它莫西芬诱导型可逆永生化小鼠牙乳头细胞系的建立和鉴定研究目的：成牙本质细胞是一种可分泌矿化基质的终末分化细胞,在牙髓牙本质复合体中发挥重要作用。小鼠牙乳头细胞(mDPCs)在体外诱导条件下可分化成成牙本质细胞样细胞。但是由于繁琐的原代培养过程和细胞有限的寿命,在实验过程中不易获得稳定的细胞来源。为解决该问题,本研究将传统的基于Cre/LoxP的可逆永生化系统与它莫西芬诱导的Cre重组酶系统相结合,试图建立一个它莫西芬诱导型可逆永生化小鼠牙乳头细胞系,并对其进行鉴定。研究方法：首先使用慢病毒介导的方法将已插入LoxP位点的SV40Tag-TK表达载体转染入原代培养的mDPCs。经过GCV筛选和单克隆筛选获得一个稳定表达SV40Tag并持续增值的克隆-mDPC6T,进而在mDPC6T过表达含有雌激素受体的ERT2CreERT2重组酶。经单克隆筛选SV40Tag和Cre阳性细胞,获得细胞系mDPCET。 mDPCET经过4-羟基它莫西芬(4-OHT)处理后获得逆永生化细胞。通过EdU掺入实验和PDLs计数法检测原代mDPCs、mDPCET和逆永生化细胞的细胞增殖动力学,通过免疫荧光、Real-time RT-PCR和Western Blot检测成牙本质相关标志物,茜素红染色检测细胞在诱导条件下矿化结节的形成。研究结果：与原代细胞相比,mDPCET增殖能力显着上调,寿命延长,但是同时保持了原代mDPCs的大部分生化和功能特性,当mDPCET细胞在4-OHT处理条件下,ERT2Cre ERT2从细胞质转移到细胞核,从而敲除已转入的SV40Tag-TK,使mDPCET发生逆永生化。与mDPCET相比,逆永生细胞的成牙本质相关基因及矿化结节形成能力显着上调,并重新获得可发生复制性衰老的能力。结论：建立并鉴定了一个它莫西芬诱导型可逆永生化小鼠牙乳头细胞系mDPCET。经4-OHT处理后,mDPCET可发生逆永生化,逆永生化细胞呈现低增殖高分化的状态,并重获可衰老的能力,这种状态更加类似分化的成牙本质细胞。二、Klf4通过调控Dmp1促进小鼠牙乳头细胞向成牙本质细胞样细胞分化研究目的：成牙本质细胞来源于牙乳头,是一种具有分泌基质功能的终未分化细胞。在成牙本质细胞分化过程中多种转录因子参与了调控。本课题组过去的研究发现,Kruppel-like factor4(Klf4)特异性表达在极化和延伸期的成牙本质细胞中,但是Klf4在成牙本质细胞分化过程中的作用尚不明确。本研究试图探索Klf4在成牙本质细胞分化过程中的功能,并分析其调控成牙本质细胞分化的分子机制。研究方法：在本研究中,使用矿化诱导液在体外诱导小鼠原代牙乳头细胞(mDPCs)和小鼠牙乳头细胞系即mDPC6T向成牙本质细胞样细胞分化作为研究模型。检测诱导过程中Klf4的mRNA和蛋白质表达水平、碱性磷酸酶活性和成牙本质细胞分化相关基因(Dspp、Dmp1和Alp)的表达：同时通过EdU掺入法检测细胞的增殖能力。在Klf4过表达和抑制条件下检测成牙本质细胞分化相关基因(Dspp、Dmp1和Alp)的表达和碱性磷酸酶活性,同时通过EdU掺入法检测细胞的增殖能力,茜素红染色检测矿化结节的形成。生物信息学预测Klf4潜在的下游基因Dmp1,并通过染色体免疫共沉淀(ChIP)、凝胶电泳迁移实验(EMSA)、双荧光素酶报告实验(DLA)检测Klf4对Dmp1的转录调控。在Klf4抑制条件下过表达Dmp1,检测Dmp1与Klf4间的调控关系。研究结果：Klf4在mDPCs和mDPC6T向成牙本质细胞样细胞分化过程中表达显着上调。过表达Klf4显着上调成牙本质相关基因,如Dmp1、Dspp和Alp,并可促进矿化结节的形成。抑制Klf4表达可下调Dmp1、Dspp和Alp的表达,并抑制矿化结节形成。生物信息学预测Klf4潜在的下游基因Dmp1。通过ChIP、EMSA和DLA的进一步分析,表明Klf4特异性结合于Dmp1启动子区,并转录激活其表达。Dmp1过表达可部分挽救由抑制Klf4表达对成牙本质分化的阻碍作用。结论：Klf4通过结合于Dmp1启动子上特定区域,转录上调Dmp1表达,从而促进成牙本质细胞分化。叁、间充质中条件性敲除Klf4影响牙本质的矿化研究目的：Klf4(Kruppel-like factor4)又称为GKlf或Ezf,是Klf4锌指蛋白转录因子家族中的一员,在器官发育、干细胞干性维持和肿瘤发生发展中发挥重要作用。过去的研究发现Klf4特异性表达在极化和延伸期的成牙本质细胞中。在实验二中,通过体外研究探索了Klf4在成牙本质细胞分化中的作用。但是,体内环境下Klf4对成牙本质细胞分化和牙本质形成的调控作用还未可知。本研究试图探索在牙胚间充质中条件性敲除Klf4对成牙本质细胞分化和牙本质形成的影响。研究方法：将Wnt1-Cre:Klf4f/+小鼠与Klf4f/f小鼠交配就可以得到Wnt1-Cre；Klf4f/f,即在神经嵴来源的细胞中特异的失活Klf4的小鼠。Wnt1-Cre与R26R-LacZ(?)小鼠交配获得Wnt1-cre;R26R-LacZ即神经嵴来源的细胞呈x-gal染色阳性的小鼠。胎龄计算时以查到孕栓的当天中午计为胚胎E0.5天,小鼠出生当天中午计为出生后PN0.5天。按胎龄或出生后日龄获得的小鼠,分离尾鼠织,提取基因组DNA进行基因型鉴定。同一窝小鼠中基因型为Klf4f/+小鼠设为对照组小鼠,将基因型为Wnt1-cre；Klf4f/f小鼠设为实验组小鼠,即条件性敲除小鼠。分离小鼠下颌骨,体式显微镜照相,X-ray检测矿化组织密度,另外一部分组织经过固定,脱水,透明,石蜡包埋,切片用来进行组织学染色分析和免疫组化分析实验。研究结果：Wnt1-cre;R26R-LacZ经X-gal染色确认Cre重组酶在牙胚间充质细胞中被激活。免疫组织化学检测结果显示,在对照组(Klf4f/+)中,KLF4表达在E18.5与PN0.5的牙尖顶端分化的成牙本质细胞和成釉细胞中,在实验组中(Wnt1-cre;Klf4f/f) KLF4仅表达在PN0.5的牙尖顶端分化的成釉细胞中,成牙本质细胞不表达KLF4。HE染色结果显示在PN1W和PN2W的Klf4条件性敲除小鼠标本中,前期牙本质显着增厚。而Azan染色结果也发现Klf4条件性敲除小鼠的牙本质出现淡染。高分辨X-ray显示Klf4条件性敲除小鼠牙本质灰度显着下降,而牙釉质未发现显着的灰度改变。更有意思的是在PN3M时,2/4的Klf4条件性敲除小鼠出现龋损,并累及所有下颌磨牙,而对照小鼠未见龋损发生。结论：牙胚间充质中条件性敲除Klf4影响牙本质的矿化。
赵明涛[7]2010年在《猪皮肤来源前体细胞多能性的分子机制》文中进行了进一步梳理神经嵴细胞起源于背部神经管,然后迁移到不同的组织区域形成各种各样的细胞类型。神经嵴干细胞/前体细胞可以分离自胚胎发育期和成体期的不同组织:神经嵴外植体、坐骨神经、背根节、肠神经节、角膜、骨髓、触须垫、颈动脉体和心脏。皮肤来源前体细胞(skin-derived progenitors, SKP)来自于胚胎期神经嵴干细胞,并且存在于成体期。人、啮齿类和猪的SKP细胞具有多能性,能分化产生神经胚层和中胚层起源的子代细胞。但是,关于SKP多能性的分子机制尚不清楚。本研究首先从第40-50天猪胎儿皮肤组织分离表达绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein, EGFP)的猪皮肤来源前体细胞,证明其多向分化潜能,同时鉴定出关于其多能性和神经嵴起源的多种分子标志。其次,通过高通量基因芯片技术比较了猪SKP细胞和神经干细胞(神经球)的转录表达谱,同时比较了猪SKP细胞和SKP来源的类成纤维细胞(SKP-derived fibroblast-like cells, SFC)的基因表达谱。最后,通过基因功能注解和KEGG通路分析,发现了几种相关的细胞内源调控机制和外源信号通路,它们对调控SKP细胞的多能性起重要作用。一SKP细胞的多能性和特异性标志分子的表达1本研究从第40~50天猪胎儿皮肤组织中分离了表达绿色荧光蛋白的SKP细胞,其在无血清和高浓度EGF和bFGF存在时可以形成悬浮的球形结构。2通过RT-PCR证实了猪SKP细胞共表达多能性相关基因(POU5F1、SOX2、NANOG和STAT3)和神经嵴标志分子(p75NTR、TWIST1、PAX3、SNAI2、SOX9和SOX10),这与胚胎神经嵴干细胞的表达谱类似,说明猪SKP细胞的神经嵴源性。3通过免疫荧光细胞化学染色发现猪SKP球中POU5F1、巢蛋白、纤连蛋白和波形蛋白阳性细胞的比例分别为12.3%、15.1%、67.9%和53.7%,这说明猪SKP球具有异质性。4通过体外诱导分化和免疫荧光细胞化学染色发现,猪SKP细胞分化培养物中存在表达微管蛋白β-III、神经丝蛋白M、GFAP、p75NTR和平滑肌肌动蛋白的阳性细胞。这说明猪SKP细胞可以分化产生神经(神经元和胶质细胞)和中胚层细胞类型(平滑肌细胞和脂肪细胞),证明其具有多向分化能力。5通过使用不同的培养体系和实时定量PCR检测,发现四种转录因子(POU5F1、SNAI2、SOX9和PAX3)的表达水平在生长因子(EGF和bFGF)和FBS存在时有显着性差异。POU5F1、SNAI2、SOX9和PAX3可能是维持SKP细胞体外多能性的关键因子。?二猪SKP细胞和神经干细胞的基因芯片分析1本研究从第40~50天猪胎儿大脑组织中分离了表达绿色荧光蛋白的神经干细胞/神经球(neurospheres),同时从同一个胎儿中分离了皮肤来源的前体细胞。它们在同一种培养液(DMEM/F12+B27+N2+EGF+bFGF)中可形成悬浮的球形结构。2通过体外诱导分化和免疫荧光细胞化学染色发现,猪神经干细胞可分化形成神经和胶质细胞后代,证明其具有多能性;而猪SKP在体外能分化成神经和中胚层来源的子代细胞。3通过RT-PCR对猪神经干细胞和SKP细胞分析发现,它们都表达NANOG、STAT3、TWIST1、p75NTR、巢蛋白、纤连蛋白和波形蛋白。但是,猪神经干细胞表达较高水平的SOX2,而且也表达GFAP。然而,SNAI2只在SKP球中表达。这说明神经干细胞和SKP球有类似的表达谱,但是有各自特异的转录状态。4通过高通量的基因芯片技术比较了猪SKP球和神经球的转录表达谱,发现SKP球高表达254个转录物,而神经干细胞有484个转录物高表达。进一步分析发现,SKP球和神经球共同高表达142个基因,他们分别涉及核糖体功能、紧密连接、间隙连接、细胞通讯、钙离子信号、ErbB信号、JAK-STAT信号以及MAPK信号等。5在1336个筛选出的转录物中,发现在SKP球和神经球中72个转录物的表达水平在统计学上有显着性差异(P<0.05)。这些差异表达的基因主要涉及生理过程、细胞过程、信号刺激反应、发育过程、生物过程的条件和行为。6功能注解聚类分析发现猪SKP球和神经球共同高表达基因主要涉及以下功能:RNA结合、蛋白质的生物合成以及核糖体等。对SKP球和神经球差异表达基因功能分析发现,胶原蛋白异构体和核心蛋白聚糖在细胞通讯、皮肤发育、信号转导以及胞外基质作用等方面发挥作用。7 KEGG通路分析发现,猪SKP球和神经球共表达基因涉及淀粉和蔗糖代谢、糖酵解、紧密连接、间隙连接、嘌呤代谢、谷氨酸盐代谢、细胞通讯、MAPK信号、钙离子信号、ErbB信号和JAK-STAT信号等通路;而它们差异表达基因主要涉及ECM受体和TGF-β信号通路。细胞通讯信号整合ECM-受体相互作用和TGF-β信号通路,可能对于维持猪SKP球和神经球特异的干细胞性质起重要作用。叁猪SKP细胞中胚层潜能的基因芯片分析1猪SKP细胞在悬浮培养中形成球状结构,但是在血清作用下贴壁生长形成类成纤维细胞。通过体外诱导分化和免疫荧光细胞化学染色发现,在SKP细胞分化为SFC过程中,其神经分化能力逐渐丧失而仍保留中胚层分化能力。2通过RT-PCR比较猪SKP球和SFC标志基因的表达,发现它们都表达NANOG和STAT3,以及神经嵴细胞分子标志TWIST1、SNAI2和p75NTR。然而,SOX10只在SKP细胞中表达,可能与SKP的外周神经分化潜能有关。3通过对猪SKP和SFC细胞的转录表达谱分析发现在SKP分化为SFC细胞过程中共有401个基因的表达在统计学上有显着性差异(P<0.05),其中,305个基因表达上调和96个基因表达下调。4通过功能注解聚类分析发现,上调表达基因主要涉及结合功能、细胞过程以及代谢过程;下调表达基因比较重要的GO(gene ontology)功能是磷酸化蛋白和结合活性。5通过KEGG和BIOCARTA通路分析发现,下调表达基因主要涉及突触蛋白、Rac1细胞运动信号通路、Ran对有丝分裂纺锤体的调控、Dicer通路以及蛋白转运到核内等内源性机制;而上调表达基因参与了一些外源性信号通路,例如ErbB通路、MAPK通路、ECM-受体相互作用、Wnt信号、细胞通讯和TGF-β信号通路。这些内源性机制和外源性的信号通路共同调节SKP到SFC的基因转录状态改变。6为了验证基因芯片数据,本研究通过相对标准曲线法对14个差异表达基因进行实时定量qPCR分析。定量PCR使用在制作基因芯片时扩增的cDNA作为模板。实时定量qPCR数据与基因芯片数据的表达谱类似,证明了基因芯片数据的可靠性。
王婷[8]2008年在《柔脑膜细胞具有神经干细胞特性的实验研究》文中进行了进一步梳理长期以来脑膜被视为是仅具有保护作用的非神经组织,在结构和功能上与脑实质有本质的不同,但在上世纪90年代Mercier等应用形态学方法清晰地勾勒出柔脑膜细胞与脑实质内胶质细胞、神经元之间有网状的复杂联系,从而提出柔脑膜细胞参与脑内某些生理或病理过程的可能性,引发了对柔脑膜功能的深入思考。新近的一些研究发现:脑膜中的柔脑膜细胞(leptomeningeal cells)表达和分泌多种细胞因子和生物活性物质,参与中枢的免疫调节和诱导发育神经元的迁移定位,并与小脑功能的完善及脑内酶屏障的构成密切相关。但是,柔脑膜细胞与神经元生长、分化的关系还存在争议。有研究认为柔脑膜细胞分泌的抑制神经突起生长的因子是神经元损伤后修复的障碍;也有研究指出柔脑膜细胞能分泌神经生长因子等多种促神经突起再生的因子,并作为滋养层支持神经干细胞的体外生长。新近的研究还注意到成年大鼠柔脑膜层有神经干细胞标记物Lex/ssea-1的表达。这些结果提示柔脑膜细胞与神经系统损伤修复、尤其与神经干细胞之间可能存在着某种特殊联系,为进一步探索柔脑膜细胞的功能提供了新思路。针对以上问题,我们以柔脑膜细胞为研究对象,设计了五组实验,从在体和体外细胞培养的角度,结合应用柔脑膜铺片、细胞培养、免疫组织化学染色、免疫荧光标记、BrdU掺入实验、Western blot等研究方法,对柔脑膜细胞可能具有的神经干细胞特性做了初步探讨。第一组实验观察了正常成年以及不同生长发育期大鼠脑内柔脑膜细胞是否表达经典的神经干细胞标志巢蛋白(nestin);第二组实验在成功建立单纯柔脑膜细胞培养体系的基础上,检测了柔脑膜细胞能否表现出自我更新以及多向分化等神经干细胞的生物特性;第叁组至第五组实验分别观察了不同调控因素(白细胞介素-6、抗抑郁药物以及机械损伤)对于柔脑膜来源神经干细胞增殖分化的影响。主要结果有:实验一一、正常成年SD大鼠及Balb/c小鼠的柔脑膜层中均可检测到神经干细胞特异性标记物nestin的表达,但表达水平低,主要局限于脑腹侧及大脑镰两侧的脑膜组织。两种动物柔脑膜组织中阳性细胞的形态与分布存在差异。二、不同生长发育期SD大鼠的柔脑膜细胞中nestin蛋白表达水平随生长发育呈进行性降低。柔脑膜铺片中除nestin/Thy1.1双标阳性的柔脑膜细胞外,也有GFAP/nestin阳性细胞存在。以上结果说明,不同生长发育期SD大鼠的柔脑膜细胞均可表达神经干细胞标志nestin,即具有神经前体细胞的增殖潜能,但此潜能随生长发育而进行性减弱。实验二一、比较脑膜组织在不同培养条件下柔脑膜细胞的纯度,发现以DMEM/5%FCS/5%HS培养时,培养体系中除柔脑膜细胞外,还存在约30%的星形胶质细胞和少量神经元;以DMEM/1%FCS/9%HS培养时,柔脑膜细胞纯度达90%以上,几乎没有神经元沾染。后者继续传代可使其纯度达97%以上,仅有极少数星形胶质细胞存活。结果提示改变培养条件及多次传代是建立单纯柔脑膜细胞体系的有效方法。二、检测单纯培养的柔脑膜细胞是否具有神经干细胞的基本生物学特性。发现:给予含生长因子EGF/bFGF的无血清条件性培养基后,柔脑膜细胞可自我增殖形成神经球样结构,其成球性呈bFGF浓度依赖性;再以胎牛血清诱导分化,可见除Thy1.1阳性的柔脑膜细胞外,还可分化为β-tubulin III、GFAP、RIP阳性的神经元及胶质细胞;并且柔脑膜细胞经多次传代仍可形成克隆球及多向分化,但能力逐渐减弱。以上结果说明,间充质来源的柔脑膜细胞经体外分离培养后能够表现出自我更新以及多向分化等神经干细胞的基本生物学特性,并可分化形成神经元。实验叁一、白细胞介素-6(IL-6)可以诱导柔脑膜来源的神经球向神经元及胶质细胞多向分化,并显着提高分化神经元的比例。以多种神经元标记物鉴定分化神经元性质,提示其为5-HT阳性的未成熟神经元。二、免疫细胞化学染色及Western blotting结果均提示,IL-6孵育可显着上调其自身受体(IL-6Rα及gp130)在柔脑膜来源神经球内的表达,为柔脑膜细胞感受IL-6信号并发生应答反应提供了形态学基础。叁、上述体系中,IL-6也引起磷酸化ERK1/2及STAT3分子在柔脑膜来源神经球中的表达。而分别给予其特异性抑制剂PD98059及AG490后,发现ERK1/2通路磷酸化的抑制可影响神经球向神经元及胶质细胞的分化,而STAT3通路磷酸化的抑制则以星形胶质细胞分化的受抑为主。同时, STAT3分子磷酸化提示gp130处于活化状态。以上结果说明,细胞因子IL-6可促进柔脑膜来源神经干细胞向神经元分化,而分化神经元呈5-HT反应阳性。IL-6刺激引起了其自身受体及磷酸化ERK1/2及STAT3信号分子在该细胞体系中的表达,提示上述细胞内分子机制可能参与了柔脑膜细胞向神经元、胶质细胞的分化。实验四一、以抗抑郁药物西酞普兰孵育柔脑膜来源的神经球,发现:西酞普兰能够维持神经球的克隆化生长、促进细胞增殖,并引起细胞内ERK1/2、STAT3信号分子磷酸化;以信号通路抑制剂预处理的结果显示,西酞普兰诱导细胞增殖的效应表现为ERK1/2通路依赖性。二、观察西酞普兰孵育对柔脑膜来源的已贴壁分化的神经干细胞的影响,发现:西酞普兰可促进神经干细胞继续分化,并显着上调分化神经元的比例;同时也引起了分化细胞内磷酸化ERK1/2、STAT3分子的表达。以信号通路抑制剂预处理的结果显示,上述体系中神经元和胶质细胞的分化分别表现为ERK1/2或STAT3通路依赖性。以上结果说明,西酞普兰可以诱导柔脑膜来源神经干细胞的增殖,也可促进其向神经元分化。但是调控细胞增殖分化的机制不同,分别表现为ERK1/2通路或ERK1/2及STAT3通路依赖性。实验五一、建立柔脑膜细胞的体外机械损伤模型,检测机械损伤对细胞增殖及逆分化的影响。结果显示:划伤刺激促进了柔脑膜细胞增殖,但不能诱导其表达nestin蛋白;而含生长因子的无血清条件性培养基可诱导损伤细胞形成神经球,后者在血清存在时向神经元及胶质细胞分化。二、观察损伤的柔脑膜细胞对正常星形胶质细胞增殖及逆分化的影响,发现:损伤的柔脑膜细胞可以诱导正常星形胶质细胞增殖并表达nestin,后者也可形成神经球并向神经元、胶质细胞分化。以上结果说明,机械损伤虽然不能直接诱导柔脑膜细胞分化为神经前体细胞,但可以刺激细胞分泌某些活性物质,诱导与之共培养的星形胶质细胞增殖并逆分化为神经前体细胞。并且,细胞微环境对于细胞能否表现出神经干细胞特性具有重要意义。结论本研究从不同的角度证实:起源于间充质组织的柔脑膜细胞能够表现出神经干细胞的基本特性,自我增殖并在适当条件下分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞;不同性质的刺激(细胞因子、抗抑郁药物以及机械损伤等)可调控其增殖分化;神经系统损伤时,柔脑膜细胞可能分泌活性物质而参与诱导脑内内源性神经干细胞的增殖活化。根据以上结果,我们提出了脑膜细胞可能是脑内潜在的神经干细胞的观点。这些初步发现将为我们更加全面、深入地认识柔脑膜细胞的功能奠定了基础,为神经损伤后的干细胞修复提供了新的思路。
佘春华[9]2009年在《C6胶质瘤细胞诱导神经干细胞分化的实验研究》文中研究说明目的:神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是神经系统发育过程中特殊的细胞群,是能够在适当的微环境中分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的一类多能干细胞。由于神经干细胞具有自我更新和多分化潜能的特性,因此神经干细胞具有重大的医学研究价值和应用前景。本实验研究目的就是在本实验室建立稳定的、标准化的神经干细胞的体外培养方法,探讨C6胶质瘤细胞诱导神经干细胞分化的影响,并对其调控机制进行初步探索。本实验将为神经干细胞的分化及其调控机制奠定实验基础。材料与方法:本研究首先建立大鼠神经干细胞的培养方法:选取孕龄17-18天Wistar大鼠,体式显微镜下,无菌取胎鼠脑纹状体组织,采用机械吹打和胰酶消化方法将组织块制备成单细胞悬液,神经干细胞专用培养基(Neuralbasal medium,NB)(含EGF40ng/ml、2%B27等成分),37℃、5%CO2孵育培养。观察光镜下细胞生长及自然分化特征。并采用免疫荧光检测巢蛋白(Nestin)、β-tubulinⅢ、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及少突胶质细胞标志物(O_4)的表达。C6胶质瘤细胞采用含10%胎牛血清RPMI1640培养,当细胞生长至80%融合度时,培养液更换为无血清的RPMI1640培养液,24小时后获取C6胶质瘤细胞培养上清。将培养的神经干细胞分为两组:①对照组:采用NB/RPMI1640(1:1,无EGF);②处理组:采用NB/C6细胞培养上清(1:1,无EGF)。光镜观察不同时相(1d、3d、5d)神经干细胞的分化,并采用RT-PCR、Western-blotting和免疫荧光法检测细胞微管相关蛋白MAP-2的表达。同时,采用RT-PCR在mRNA水平上检测转录调控因子Neurogenin3(Ngn3)、NeuroD及NeuroD2在神经干细胞不同分化时相的表达水平,对其调控机制进行了初步探索。结果:体外NSCs以神经干细胞球(neurosphere)的形式增殖并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞,并能分化为神经元细胞(β-tubulinⅢ染色阳性细胞)、星形细胞(GFAP染色阳性细胞)和少突胶质细胞(O_4染色阳性细胞)。实验中分别观察第1、3、5天两组NSCs的分化细胞MAP-2的表达情况:与对照组比较,第1天未见明显差别,于第3天MAP-2在mRNA表达水平出现差异,第5天可见mRNA及蛋白表达水平均表现显着差异,且免疫荧光染色可见更多的MAP-2阳性细胞。同时检测发现转录因子Ngn3、NeuroD、NeuroD2的mRNA表达水平的变化趋势与之一致。结论:本研究成功建立大鼠神经干细胞的体外培养体系,可以维持神经干细胞保持高度增殖及不发生自我分化的特性。与神经干细胞的自我分化比较,C6胶质瘤细胞培养上清可诱导神经干细胞向神经元分化,该作用可能是通过上调bHLH家族转录因子Ngn3、NeuroD、NeuroD2叁者的表达实现的。由此推测,C6胶质瘤细胞可分泌某种因子通过bHLH家族转录因子调控机制诱导神经干细胞向神经元分化,为下一步研究神经干细胞的分化调控及其与神经胶质瘤的起源的相关性奠定了实验基础。
贾丽君[10]2010年在《重组人粒细胞集落刺激因子对大鼠脑出血灶周改变影响的实验研究》文中认为本研究通过建立大鼠脑出血模型,对注射重组人粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞的治疗组与对照组在不同时程进行神经功能评分,判定大鼠的神经损伤情况,观察各组各时程病灶周围脑组织的病理改变。应用免疫组化染色方法观察各组各时程病灶周围脑组织Caspase-3、STAT3、Brdu的表达变化,明确脑出血后叁者的表达规律及重组人粒细胞集落刺激因子对骨髓干细胞的动员作用,最后通过RT-PCR方法检测脑组织中Caspase-3、STAT3的mRNA含量变化,初步探讨Caspase-3、STAT3在脑出血后神经损伤中的作用,并进一步探讨重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血后神经损伤的保护及可能作用机制,提出于临床应用重组人粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞治疗脑出血的可能,为今后治疗脑出血提供理论依据及新靶点。
参考文献：
[1]. STAT3与巢蛋白在神经发育过程中的表达与功能研究[D]. 颜晔. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2003
[2]. Survivin及STAT_3蛋白在人脑星形细胞瘤的表达及相关性研究[D]. 汪鑫平. 南昌大学. 2009
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