张艳[1]2008年在《荞麦黄酮代谢合成相关基因的克隆及分析》文中指出荞麦是重要的医食同源作物,随着人们生活水平不断的完善,荞麦的营养价值和药用价值越来越引起人们的注意。荞麦不仅营养丰富,其中还含有大量的黄酮类化合物(flavonoids)。现代医学研究表明,荞麦具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种药理活性,而发挥这些药理活性的物质主要是荞麦中所含有的黄酮类化合物。测定结果发现,荞麦的的根、芽、苗富含黄酮,具有很好的药用价值,是糖尿病人、冠心病人等的最佳食品。随着荞麦药用价值更深层次的发掘研究,荞麦特别是苦荞已成为人们研究关注的焦点。目前研究荞麦黄酮主要集中在通过栽培措施提高黄酮含量,应用基因工程手段研究其分子机理的较少。本实验利用基因工程方法克隆荞麦黄酮合成相关的几个基因,并对目的基因进行了初步的生物信息学分析,旨为进一步研究荞麦黄酮相关酶基因的功能验证及表达调控机理奠定理论基础。本研究采用PCR、RT-PCR方法克隆荞麦黄酮代谢合成相关的3个酶基因,利用生物信息学分析比较,得出如下主要结果:1.采用PCR、RT-PCR方法克隆得到苦荞和甜荞CHS基因DNA、cDNA片段,分别命名为FtCHS、FeCHS、FtrCHS和FerCHS,长度均为1027bp,均包含编码326个氨基酸的阅读框。序列分析表明,这四个基因均与其它植物的CHS蛋白基因有很高的同源性。分析该苦荞和甜荞的CHS基因片段发现,其不含内含子。比较FtCHS、FeCHS发现,苦荞和甜荞的CHS基因有38处单碱基差异,我们推测这个可能是导致苦荞与甜荞黄酮含量差异的原因之一。2.采用RT-PCR方法克隆得到4个苦荞PAL基因的cDNA片段,命名为FtPAL1、FtPAL2、FtPAL3、FtPAL4。其中FtPAL1、FtPAL2、FtPAL3是同一对引物扩增得到的,长度为969bp,它们的核苷酸序列相差很大,分析它们编码的氨基酸序列也有较大的差异,经在线比对分析发现,FtPAL1、FtPAL2、FtPAL3均与其它植物PAL蛋白基因有很高的同源性,我们推测FtPAL1、FtPAL2、FtPAL3是苦荞PAL基因家族的3个成员。FtPAL4是根据FtPAL2与同源性高的植物设计引物扩增得到的,长度为934bp,是FtPAL2的3'段的延伸。拼接FtPAL4与FtPAL2得到一条长为1510bp DNA片段,命名为FtPAL,包含一个编码503个氨基酸残基的阅读框。序列分析表明FtPAL与其它植物PAL基因有很高的同源性,蛋白质基本理化性质的分析推测FtPAL编码蛋白是一个稳定的蛋白。3.采用RT-PCR方法克隆得到苦荞DFR基因的cDNA片段,命名为FtDFR,长度为1120bp,包含一个编码341氨基酸残基的阅读框。与金荞麦DFR基因全长的氨基酸序列比较发现,FtDFR编码的氨基酸与金荞麦DFR基因全长的氨基酸长度相同,且仅有3个氨基酸残基差异。比对分析表明FtDFR与其他植物DFR基因有很高的同源性。分析苦荞DFR蛋白,其理论相对分子质量为38473.1KDa,预测pI值为5.78,理论分子式为C_(1722)H_(2671)N_(455)O_(510)S_(22),不稳定系数为35.05,推测FtDFR编码蛋白是一个稳定的蛋白。
乔中全[2]2012年在《金银花chs、fls、chi基因全长克隆及序列分析》文中研究表明本研究以‘金萃蕾’金银花叶片为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆出查尔酮合成酶(chs)、黄酮醇合成酶(fls)、查尔酮异构酶(chi)叁个基因的全长cDNA序列。为进一步从分子角度研究这些基因与黄酮类化合物合成的关系、揭示黄酮类化合物合成的分子机制,以及今后金银花叶黄酮类化合物的开发利用奠定理论依据。研究结果如下：1、克隆出金银花叶片chs基因全长cDNA序列金银花叶片chs基因cDNA全长为1467bp,其中包含一个完整开放阅读框为1167bp,编码389个氨基酸,分子量42.7kD,等电点7.49；5’非编码区长118bp,3’非编码区长179bp。将金银花叶片chs全长经过BLAST软件比对,结果表明,该序列与毛果杨、莲、海棠同源性比较高,分别为83%、82%、81%；并对其氨基酸序列进行比对发现,金银花叶片的CHS蛋白与毛果杨相似性最高为93%。该基因在GenBank中登录号为JQ627646。2、克隆出金银花叶片fls基因全长cDNA序列根据已知的其它物种黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成酶基因部分cDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列。序列拼接得到完整的1248bp的黄酮醇合成酶基因,已经在GenBank上登录,登录号为JQ627647,根据获得的序列,设计引物扩增获得1001bp的开放阅读框,编码333个氨基酸,分子量约为37.7kD,等电点为5.45；5’非编码区长38bp、3’非编码区长208bp。序列分析显示,金银花黄酮醇合成酶与烟草、马铃薯和桔梗的同源性分别为86%、83%和80%,与其它物种的同源性也在80%左右,这表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性。3、克隆出金银花叶片chi基因cDNA全长金银花叶片chi基因cDNA全长725bp,其中包含一个完整开放阅读框630bp,编码210个氨基酸,分子量22.5kD,等电点6.48；5’非编码区长40bp,3’非编码区长55bp。将金银花叶片chi全长经过BLAST软件比对,结果表明,该序列与草莓、杜鹃、葡萄的同源性比较高,分别为80%、79%和76%。该基因在GenBank中登录号为JQ650259。综上所述,可能在金银花叶黄酮类化合物合成中具有重要的地位的chs、fls、 chi这叁个基因的克隆将有利于金银花叶片黄酮类化合物的进一步开发和利用。
丁天波[3]2014年在《柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的鉴定和表达模式研究》文中指出柑橘全爪螨Panonychus citri (McGregor)是我国柑橘产区的第一大害螨,其大量发生严重影响柑橘的产量和品质,且以化学防治为主的控制措施加之该螨自身的特点(繁殖速度快、体小、活动范围小等),导致其抗性问题日益凸显。目前,对于相橘全爪螨解毒代谢及抗药性机理的报道相对较少,且多集中在生化水平及有限基因的鉴定方面。细胞色素P450酶系作为昆虫(螨)体内一类关键解毒酶系,可代谢多种内源和外源化合物,在昆虫(螨)对杀虫(螨)剂解毒代谢过程中起着十分重要的作用。诸多研究表明,蜱螨P450与拟除虫菊酯类、有机磷类、METIs、季酮酸类、生物源类等多种杀螨剂抗性有关。国内外有关细胞色素P450酶系的研究多针对P450的特性展开,而对于酶系发挥作用的关键因子NADPH-细胞色素P450还原酶(CRP)和细胞色素b5(CYB5)的作用地位涉及相对较少。因此,对细胞色素P450酶系进行整体研究,将有利于全面理解细胞色素P450酶及其相关基因在解毒代谢过程中的作用方式和具体定位,从而为全面解析其解毒代谢及介导的代谢抗性机制奠定理论基础。本学位论文以柑橘全爪螨为研究对象,围绕细胞色素P450对药剂胁迫的响应机制这一科学问题,开展了系统地研究工作。具体内容包括：从柑橘全爪螨田间种群敏感性监测出发,在掌握柑橘全爪螨抗性水平的基础上,在生化水平上比较分析了叁种主要代谢酶的酶学特性,锁定细胞色素P450作为研究重点；建立了柑橘全爪螨全螨态转录组数据库,筛选鉴定出包括细胞色素P450在内的诸多解毒代谢酶基因信息；进一步克隆P450、CPR及CYB5基因的cDNA全长序列,解析这些基因在不同螨态、不同药剂胁迫及诱导条件下的表达模式,初步建立柑橘全爪螨细胞色素P450基因的真核表达体系。研究结果对于全面揭示柑橘全爪螨P450酶系的解毒代谢机制及其介导的抗药性机制具有重要的理论意义,在实践上对于制订柑橘全爪螨抗药性的治理策略亦具有重要的指导意义。本学位论文的主要研究结果总结如下：1柑橘全爪螨抗药性监测及主要解毒酶活性比较1.1柑橘全爪螨4个田间种群的抗药性测定通过改进后的叶碟浸渍法,对采自重庆4个地区(北碚、璧山、忠县、武隆)的柑橘全爪螨对阿维菌素、叁唑锡、哒螨灵和螺螨酯的抗性水平进行了测定。结果表明,四种不用类型杀螨剂相比较,阿维菌素的杀螨活性最强,4个种群对其敏感性水平最高,螺螨酯和哒螨灵次之,叁唑锡的杀螨活性最差,4个种群对其敏感性水平最低。不同种群间相比较发现,柑橘全爪螨璧山种群对阿维菌素最为敏感,忠县和武隆种群对其敏感性最低,LC5o分别是璧山种群的11倍和12倍；忠县种群对叁唑锡的抗性水平最低,璧山种群抗性水平最高,但总体差异不大；对哒螨灵而言,璧山种群对其敏感性最高,武隆种群、忠县种群与璧山种群的LCso十分接近,而北碚种群对哒螨灵的抗性水平最高,与璧山种群相比其相对抗性倍数达4倍；重庆4个柑橘全爪螨种群对螺螨酯的抗性水平差异比较明显,抗性水平由高到底依次为：璧山种群、忠县种群、武隆种群和北碚种群。1.2柑橘全爪螨叁种主要解毒酶活性比较1.2.1不同发育阶段主要解毒酶活性比较通过微量酶标板法对柑橘全爪螨不同螨态P450s、GSTs和CarEs活性进行了测定。比较分析发现,幼螨期P450s比活力最高,分别是成螨、若螨和卵P450s活力的2.66、2.70和16.02倍,且差异显着；柑橘全爪螨若螨和成螨期GSTs活力均显着高于其它发育阶段,卵期GSTs活力最低；柑橘全爪螨幼螨期CarEs比活力最高,其次是成螨和若螨,卵期最低。以上结果也暗示P450s和CarEs可能在幼螨期主要参与对外界化合物的代谢过程,而GSTs则可能主要在成螨和幼螨期行使解毒代谢功能。1.2.2不同种群主要解毒酶活性比较研究表明,P450s、GSTs和CarEs的活力分别在北碚种群、忠县种群、忠县种群最高,但总体来看代谢酶活性变化与抗性水平之间相关程度不高,分析可能与4个地区施药背景不同、杀螨剂类型及作用靶标不同、以及不同种群问的遗传背景存在差异有关。1.2.3不同药剂胁迫下主要解毒酶活性比较在生物测定的基础上,选择5种杀螨剂(阿维菌素、叁唑锡、甲氰菊酯、哒螨灵和螺螨酯)及柑橘次生挥发物(柠檬醛),以LC30浓度对柑橘全爪螨处理,24h后测定叁种代谢酶的活性。结果表明,经不同药剂处理后P450活性均有不同程度的提高,其中经螺螨酯处理后P450的活力最高；对于GSTs而言,除阿维菌素外,其余5种药剂均能显着诱导GSTs活力升高,其中螺螨酯处理后GSTs的活力最高；然而,经螺螨酯处理后,CarEs的活力显着降低,其余5种药剂处理后,其活力无显着变化。综上分析发现,P450s和GSTs对以上6种药剂的胁迫反应比较灵敏,而CarEs则较为迟钝,也暗示P450s和GSTs在一定程度上参与柑橘全爪螨对上述药剂的代谢过程。1.2.4巴比妥酸钠对主要解毒酶的诱导效应柑橘全爪螨经P450酶特异性诱导剂巴比妥酸钠(19.96mg/L)诱导24h后,P450s和GSTs活性显着上升,而CarEs活性则被显着抑制。2柑橘全爪螨转录组分析及解毒酶基因鉴定2.1全螨态转录组数据库建立及数据分析为尽可能全面获得柑橘全爪螨的基因转录本信息,提取获得柑橘全爪螨4个螨态的高质量RNA,并基于Illumina HiseqTM2000平台进行测序,将数据提交至NCBI的SRA数据库,登录号为SRA045743.1。序列分析发现共获得51,214,018条clean reads,经过一系列组装拼接后,得到65,149条Unigene。将所有Unigene提交至nr、Swiss-Prol、KEGG、COG和GO数据库进行BLASTX比对,以E=10-5为阈值,分别有32,535、25,813、22,725、15,412和10,421条Unigene成功得到注释。对nr数据库成功注释的Unigene进行同源性分析,发现柑橘全爪螨Unigene与昆虫纲相关基因的亲缘关系最近,其中9%的Unigene与赤拟谷盗Tribolium castaneum相关基因的同源性最高,其次为印度跳蚁Harpegnathos saltator (6%)和佛罗里达弓背蚁(5%),与蛛形纲的肩突硬蜱Ixodes scapularis同源性亦达1.7%。对柑橘全爪螨Unigene进行GO分类发现,共有10,421个Unigene在GO数据库得到注释,且被划分到生物过程、细胞组分和分子功能3大主要类别的50个功能组中。其中注释基因最多的功能组是细胞组分中的cell,有7,035个Unigene,注释基因最少的是分子功能中的channel regulator activities和细胞组分中的virion,两个功能组均只有2个Unigene。将所有Unigene在COG中比对,有15,412个Unigene被成功注释,并且被划分到25个不同的功能家族,其中注释Unigene最多的功能家族是general function prediction(3,642个),注释Unigene最少的功能家族是nuclear structure(11个)。2.2解毒酶基因筛选及代谢通路分析根据nr数据库比对结果,共筛选鉴定出柑橘全爪螨与解毒代谢相关的P450Unigene79个,且分别有12、9、26和7个Unigene与CYP2、CYP3、CYP4和CYP6家族基因亲缘关系最近,其余25个Unigene与其它家族(CYP9、CYP18、CYP314和线粒体P450)基因的同源性较高。有58个P450Unigene在KEGG数据库得到注释到,共参与16条代谢通路；筛选鉴定出柑橘全爪螨24个GSTs Unigene,分属于7个家族(delta、kappa、mu、omega、sigma、theta和zeta),其中有19个Unigene通过在KEGG数据库注释到10条代谢通路中；筛选鉴定出柑橘全爪螨13个CarE Unigene,根据同源性分析,有4个Unigene归于Clade A,分别有3个和1个Unigene归于Clade B和D；代谢通路分析发现,仅有4个Unigene能够成功注释,且均属于同1条代谢通路。总体来看上述叁种解毒酶所涉及通路大多与外源物质或药剂的代谢有关,从另一角度佐证了解毒酶的主要功能。3柑橘全爪螨P450及其相关基因的克隆与序列分析基于转录组数据库中鉴定出的P450Unigene信息,利用RACE结合RT-PCR技术,从柑橘全爪螨体内分离克隆出了11个P450基因的cDNA全长序列,提交至细胞色素P450命名委员会命名后,登录入至GenBank,其名称和登陆号分别为：CYP4CL2(JQ690089)、CYP384A2(KC201279)、CYP385C7(KJ173877)、CYP385C8(KJ173878)、CYP389D1(KC201278)、CYP392A22(KC201275)、CYP392A23(KC201276)、CYP392A24(KC201277)、CYP392A25(KJ173880)、CYP392B6(KJ173879)和CYP392F1(KC201274)。这11个P450基因的开放阅读框长度范围为1,494-1,758bp,编码氨基酸序列在497-585aa之间。此外,利用ProParaam、 TMHMM等生物信息学软件对P450蛋白组成、理化性质、跨膜区段及信号肽位点进行分析和预测,结果表明这11个P450基因均为微粒体型,也暗示可能与外源化合物的解毒代谢相关。同时,柑橘全爪螨11个P450氨基酸序列中均含有经典血红素结合位点、C螺旋、Ⅰ螺旋、K螺旋和meander等保守区域的特征基序,且CYP4CL2序列中含有CYP4家族特征序列EVDTFMFA/GHDTT。通过对本研究克隆获得的11个及之前本课题组获得的1个柑橘全爪螨P450基因全长序列进行同源性比对,结果发现这12个P450基因核苷酸同源性在36.47%-96.39%之间,氨基酸同源性在16.29%-96.39%之间,且相同家族基因序列的同源性较高。以从二斑叶螨基因组数据库中选取所有的75个P450基因序列作为参照,利用MEGA5.05的最大似然法构建系统发育树,结果发现柑橘全爪螨12个P450基因分属于3个集团(CYP2Clan、CYP3Clan和CYP4Clan),且相同家族基因聚在一起。根据转录组数据库信息,克隆获得了柑橘全爪螨CPR及CYB5基因cDNA全长序列,GenBank登陆号分别为KJ173881和KJ173882。PcCPR和PcCYB5基因完整开放阅读框分别包含2,061和324个碱基,编码686和107个氨基酸。序列多重比对发现,柑橘全爪螨PcCPR与二斑叶螨CPR同源性最高,且在氨基酸序列中发现P450还原酶的保守功能区包括FMN结合区、FAD结合区和NADPH结合区。此外,与其它20个物种进行系统发育分析,发现按照蛛形纲、昆虫纲、哺乳动物纲和双子叶植物纲聚为4大类,PcCPR与二斑叶螨亲缘关系最近,节点自展值达100%。对CYB5进行序列分析后发现,靠近N段的血红素结合区十分保守,且PcCYB5与二斑叶螨相关基因的同源性最高。4柑橘全爪螨P450及其相关基因的表达模式解析4.1细胞色素P450基因表达模式解析4.1.1柑橘全爪螨不同发育阶段P450基因的表达模式运用qPCR技术完成了对柑橘全爪螨12个具有全长序列的P450基因和14个P450Unigene片段在不同发育阶段的表达模式解析。结果发现,26个P450基因的表达伴随柑橘全爪螨的整个生命历程,CYP4CF1、CYP4CL2、CYP392A25和CYP392B6在幼螨阶段表达量均最高,CYP385C7和CYP389D1基因则在若螨特异高表达,此外有10个Unigene也在幼、若螨阶段表达水平较高,说明以上16个基因可能过多参与到幼螨和若螨阶段对内外源物质的代谢过程中；CYP384A2和两个Unigene表达水平随龄期增长而逐渐升高,暗示基因随螨体的生长发育,解毒代谢能力也逐渐增强；此外还发现CYP392A22、CYP392A24及Unigene1146、Unigene27622在卵期高表达,推测可能与卵期抵御外界次生物质胁迫有关；而CYP385C8和CYP392F1则在螨体内呈组成型表达,在整个生长发育过程中均可能行使重要作用。4.1.2柑橘全爪螨P450基因对药剂胁迫的响应表达模式在前期生物测定基础上,完成了阿维菌素、甲氰菊酯、哒螨灵和柠檬醛对柑橘全爪螨不同时间和不同浓度的胁迫处理,进而对26个P450基因进行了表达模式解析。qPCR结果发现,柑橘全爪螨P450对阿维菌素响应幅度最大,CYP385家族基因(CYP385C7和CYP385C8)上调倍数均在25倍以上,而CYP392家族四个基因(CYP392A22、CYP392A23、CYP392A25和CYP392B6)的相对表达量也分别达到了对照的41.46、68.66、25.56和11.34倍。在时间效应方面,本研究中大多数P450基因均在药剂胁迫24h后表达量达到最高,仅两个Unigene在胁迫前期(12h)均发生响应,CYP4CL2和CYP392F1表现出的诱导效应较为滞后；P450基因在特定浓度的高表达呈家族分布,CYP385家族两个基因(CYP385C7和CYP385C8) mRNA水平在低浓度LC10胁迫下达到最高,CYP392家族5个基因(CYP392A22、CYP392A23、CYP392A24、CYP392A25和CYP392F1)均能被亚致死浓度LC30最大程度诱导,致死中浓度胁迫下,CYP4家族基因(CYP4CF1和CYP4CL2)相对表达量达最高峰值。甲氰菊酯胁迫下,大多数P450基因表达均能被诱导上调,CYP4CL2表达量上升倍数最大(4.48倍)。CYP392家族4条基因(CYP392A24、CYP392A25、CYP392B6和CYP392F1)及CYP384A2、CYP389D1均在12h后表达水平最高,CYP4家族基因的最大诱导值出现在24h；经LC30胁迫24h后,CYP4CF1、CYP4CL2、 CYP392A22、CYP392B6和CYP392F1基因表达量均达到最大值,且显着高于对照,CYP385C8能够被甲氰菊酯LCso浓度显着诱导,暗示了以上基因在很大程度上参与了柑橘全爪螨对甲氰菊酯的代谢过程。同上述两种杀螨剂不同,柑橘全爪螨P450基因对哒螨灵的响应数目和幅度都有所降低,CYP385C7、CYP385C8和CYP392A22在哒螨灵胁迫12h后,表达量即达到最大值,说明这叁个基因在哒螨灵胁迫初期发挥主要作用,CYP4CL2和CYP392家族4个基因(CYP392A23、CYP392A24、CYP392A25和CYP392B6)表达最高峰则分别推至24h和36h,暗示其分别在中后期参与对螨体内哒螨灵的解毒过程；低浓度胁迫下,仅CYP4CL2表达量最高,而CYP392家族3个基因和CYP385C8基因均可能参与到柑橘全爪螨对较高剂量哒螨灵的代谢过程中。柠檬醛特定条件胁迫处理下,柑橘全爪螨12个具有全长序列的P450基因表达量均显着上调。绝大多数P450基因表达水平在柠檬醛胁迫24h和36h后达到最高峰值,说明柑橘全爪螨P450对柠檬醛响应模式相对比较滞后；此外定量结果发现高浓度柠檬醛对P450的诱导效果较为明显,LCso浓度处理下,10个P450全长基因和8个Unigene的相对表达量均达到最高峰。总体来看CYP385C7、 CYP385C8、CYP392A23、CYP392B6和CYP384A2上调幅度较大,均超过8倍,相对于其它P450基因而言,可推测上述5个基因在介导柑橘全爪螨对柠檬醛解毒代谢及适应寄主环境过程中发挥主要作用。4.1.3柑橘全爪螨P450基因对巴比妥酸钠诱导响应的表达模式巴比妥酸钠对多数P450基因均表现出显着的诱导效应,且诱导最大值多出现在24h和36h后,此外发现CYP392A23、CYP392A25、CYP392B6、CYP384A2和Unigene9596的表达量同诱导浓度之间呈正相关。4.2PcCPR和PcCYB5基因表达模式解析4.2.1柑橘全爪螨不同发育阶段PcCPR和PcCYB5基因的表达模式PcCPR基因在幼螨和若螨中表达水平均显着高于其它两个发育阶段,在幼螨阶段表达量最高,卵期最低,PcCPR表达模式同P450不同发育阶段酶活性变化-致,也说明了其在幼螨和若螨阶段主要参与了P450的解毒代谢过程,也反映出CPR同P450间的协同作用。PcCYB5基因则在若螨期表达量最高,其次为卵和幼螨、成螨阶段表达水平最低,暗示PcCYB5基因在若螨阶段保持较为活跃的电子传递活动。4.2.2柑橘全爪螨PcCPR和PcCYB5基因对药剂胁迫响应的表达模式在阿维菌素胁迫下,PcCPR基因反应较为迅速,LC10浓度处理12h后表达量均达最大值；低浓度和高浓度的甲氰菊酯均能抑制CPR基因的表达,仅亚致死浓度能显着诱导PcCPR的表达上调；哒螨酮对PcCPR的诱导效应最为强烈,且柠檬醛不同浓度和不同时间胁迫均能使PcPCR基因表达水平升高。上述结果也说明PcCPR在很大程度上参与到P450对外源物质的代谢过程中。对于PcCYB5而言,阿维菌素、甲氰菊酯、哒螨灵和柠檬醛均能够显着诱导其表达水平升高,并且其表达模式同PcCPR基因表达量变化在时间和浓度梯度上呈现一定的互补效应,暗不PcCYB5和PcCPR协同作用保证电子传递的有序进行,共同参与到P450酶系抵御外界环境压力的过程中。4.2.3柑橘全爪螨PcCPR和PcCYB5基因巴比妥酸钠诱导响应的表达模式qPCR结果发现,巴比妥酸钠均能显着诱导PcCPR和PcCYB5基因的表达,且表现出良好的诱导时间效应和浓度效应,二者表达量均随时间和浓度的增加而升高。5柑橘全爪螨P450基因的真核表达运用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,选择柑橘全爪螨2个细胞色素P450基因CYP392A24和CYP392F1,采用双酶切及DNA重组技术,构建了Bacmid-CYP392A24和Bacmid-CYP392F1病毒表达载体,实现对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9细胞的侵染和蛋白表达,后续对表达产物进行P450含量测定时,发现两个蛋白均以失活态存在,说明仍需进一步完善表达及蛋白纯化体系。而真核表达体系的构建将为今后柑橘全爪螨P450基因功能的验证和目的基因的解毒代谢能力研究奠定基础。综上所述,本学位论文研究运用叶碟浸渍法对重庆4个地区柑橘全爪螨田间种群的抗性水平进行了监测,同时完成了对代谢抗性相关的叁大解毒酶活性的比较研究；基于高通量测序平台,构建了柑橘全爪螨全螨态转录组数据库,针对性地筛选鉴定出了包括P450在内的主要解毒酶基因,并进行了代谢通路分析；克隆获得了柑橘全爪螨11个P450基因cDNA全长序列,以及P450酶系重要功能基因CPR和CYB5的cDNA全长序列；运用qPCR技术,系统解析了柑橘全爪螨26个P450基因(12个含有全长序列的P450基因、14个P450Unigene片段)和CPR、CYB5基因在不同发育阶段、不同药剂胁迫及诱导条件下的表达模式,鉴定出一系列与杀螨剂和植物次生物质代谢相关的P450基因；基于Bac-to-Bac系统,建立了柑橘全爪螨P450真核表达体系。研究结果丰富了柑橘全爪螨P450酶系的基础生物学信息,为筛选与柑橘全爪螨抗性相关P450基因提供了基础数据支撑,并对从P450氧化还原作用系统上全面阐述其介导的代谢抗性机制具有重要的理论和实践意义。
王丹阳[4]2014年在《木质素代谢相关酶在梨石细胞合成中的作用》文中提出石细胞是影响梨果实品质的重要因素之一,而木质素是梨石细胞的主要组成成分,木质素的形成既是品种的遗传特性,同时也受外界环境及栽培技术措施的影响。在梨果生产中,果实套袋技术的使用能够避免外界有害物质对梨果的污染并提高果实外观品质,同时也能影响石细胞的形成,此前对套袋作用的研究主要集中在其对果实品质、病虫害防治、石细胞发育及相关酶活性变化等方面,对套袋影响梨果实石细胞形成的作用还不能形成明确共识。本研究以78个梨品种为试材,开展了果肉中石细胞含量及石细胞中木质素含量的测定,并以'砀山酥梨,为试验材料,以石细胞及其主要成分木质素为中心,研究套袋栽培条件下梨果实生长发育过程中石细胞及木质素含量及木质素代谢相关酶活性和基因表达的规律,对梨果实中PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸-4-羟基化酶)、C3'H(对羟基苯乙烯酸3-脱氢酶)、HCT(羟基肉桂酰基转移酶)、CCoAOMT(咖啡酰CoA-O-甲基转移酶)、POD(过氧化物酶)基因进行了克隆和序列分析,并对C4H、POD、CCoAOMT进行了亚细胞定位分析,主要结果如下:一、采用冷冻分离和盐酸处理相结合的方法测定了 78个梨品种成熟果肉中石细胞含量,结果大部分梨品种石细胞含量在0.05%-0.5%,只有少数品种石细胞含量极少或者集中在0.8%以上;石细胞中木质素所占比例大部分在26-38%。二、以15年生'砀山酥梨’品种为试验材料,分析了套袋对‘砀山酥梨’不同发育时期单果重、石细胞含量、木质素含量和木质素代谢相关酶活性的影响。结果表明:随着果实的生长发育,单果重呈"S"型动态曲线增长,果实成熟时,套袋果鲜重略低于对照;果实中石细胞含量与木质素含量在果实发育过程中均呈先升高后降低的趋势,且套袋处理高于对照;套袋处理果实石细胞中木质素含量随着果实的生长逐渐升高并趋于稳定,且始终高于对照;果实发育过程中,套袋使果实中苯丙氨酸解氨酶(PAL)和肉桂醇脱氢酶(CAD)的活性分别受到不同程度的抑制,但使果实中愈创木酚过氧化物酶(G-POD)和丁香醛连氮过氧化物酶(S-POD)的活性上升,其中细胞壁结合过氧化物酶(PODⅡ)活性的变化趋势与石细胞中木质素含量变化趋势相似。相关性分析表明,果肉内石细胞中木质素含量与单果重、果实中PODⅡ活性显着相关,PODⅡ在梨果实木质素代谢中可能有重要的作用。叁、为了了解梨木质素代谢相关基因的时空表达特性,本研究以'砀山酥梨’为试材,结合果实发育过程中石细胞与木质素的含量变化,分析了套袋对不同发育时期果肉中木质素代谢相关基因表达的影响。结果表明:在果肉中石细胞与木质素合成的旺盛时期(盛花后46d内),不同的基因表达模式不同,同一家族的不同基因表达模式也不同;PAL、C4H、4CL1、4CL2、CAD1、HCT3、CCoAOMT、POD1 和 POD2 在木质素合成较旺盛的时期均有较高的表达量,CAD2、和POD4在果实接近成熟时有较高的表达量,而HCT1和HCT4是在木质素合成的高峰期(盛花后46 d)表达量较低,POD3则是在木质素合成前期有较高的表达量,而在盛花后46 d已经检测不到它的表达,而且套袋处理对不同基因不同时期有不同的抑制或者促进。PAL、C4H、4CL2、C3'H、HCT3、CCoAOMT、POD1、POD3更能反映果肉中木质素的变化规律,而CAD、HCT1、HCT4、POD2、POD4与石细胞中木质素变化规律更相似。因此,他们可能在木质素代谢过程中起不同的作用。四、提取了‘砀山酥梨’果肉总RNA,成功克隆到了 PAL(KJ577540)、C4H(KJ577541)C3'H(KJ577546)、HCT(KJ577545)、CCoAOMT(KJ577544)、POD1(KJ577542)和POD2(KJ577543)的基因全长,在蛋白水平上,PAL、C4H、HCT、CCoAOMT、POD1和POD2编码的氨基酸序列分别由720、504、438、247、325和336个氨基酸组成,系统进化分析发现他们与蔷薇科植物亲缘关系最近;C3’H编码的氨基酸序列由512个氨基酸组成,系统进化分析发现其与毛白杨等植物的亲缘关系较远;并分别对它们的蛋白质二级、叁级结构、信号肽、疏水结构域等进行了预测与分析。五、以'砀山酥梨’为试材,为了深入研究梨C4H、POD、CCoAOMT基因功能,利用PCR方法对带酶切位点的C4HORF、POD ORF进行扩增,分别构建了 C4H、POD与绿色荧光蛋白融合的植物表达载体pC4MBIa41302-C4H-GFP、pC4MBI41302-POD-GFP;利用PCR方法对带酶切位点的CCoAOMT ORF进行扩增,构建pBI121-CCoAOMT-GFP植物表达载体。通过荧光显微镜观察C4H、POD、CCoA OMT基因表达产物在洋葱表皮细胞的分布来确定其在细胞中的定位。结果显示,C4H基因的表达产物定位在细胞膜上,POD和CCoAOMT基因的表达产物定位在细胞核中。
孙新菊[5]2012年在《萝卜CMS育性相关基因分离鉴定与表达特征分析》文中进行了进一步梳理萝卜(Raphanus sativus L.)是一种重要的根菜类蔬菜作物,在我国栽培历史悠久,分布广泛。萝卜不仅营养丰富,而且具有较高的药用食疗价值,深受人们喜爱。细胞质雄性不育是一种不能产生正常功能花粉的母性遗传性状,育性由核基因恢复。萝卜的杂种优势明显,利用雄性不育进行杂交种生产是主要的育种方式,因此培育大量优良CMS(cytoplasmic male sterility,细胞质雄性不育)雄性不育系是广泛、高效利用萝卜杂种优势的前提。萝卜雄性不育胞质已成功转育到芸薹属多种作物如油菜、甘蓝、白菜中,是十字花科植物最受关注的不育胞质之一。然而萝卜胞质鉴定的技术体系和分子标记辅助选择候选保持系的技术体系尚未建立,雄性不育产生的机理至今尚未完全阐明。有鉴于此,本研究从形态、细胞、遗传及分子生物学方面对萝卜CMS胞质不育和恢复基因的特征进行研究,以及从基因差异表达水平入手分析花粉发育的特征和分子调控机制,并对相关差异表达基因进行克隆与特征分析。取得的主要研究结果如下：(1)应用鉴定不同胞质类型的特异引物MSF1/R1, LwnomalF/R, LwNWBF/R, KOSF/R和LwDCGMSF/R对80份萝卜自交系与不育系配制的组合以及20个商业品种进行扩增。根据扩增条带,将萝卜胞质分为Ogura, DBRMF1, DBRMF2, NWB, DCGMS,交叉型以及新胞质7种类型。其中大多数材料(65份)是Ogura类型；8份材料是DBRMF1类型；7份材料是DBRMF2类型；10份材料是NWB类型；5份材料是DCGMS类型；3份材料是交叉型,以及2份材料是新胞质类型。细胞学观察发现不同胞质不育系的败育方式相似,在四分体之前不育系小孢子发育没有发生异常,四分体时期绒毡层细胞膨大液泡化,致使后续的花粉发育各过程受阻,最终不能形成花粉而引起败育。(2)萝卜恢复系NAU-RsWR1的Rs-Rfl基因编码687个氨基酸,包含16个PPR重复序列。应用RT-PCR和qRT-PCR分析了恢复系NAU-RsWR1的不同时期、不同器官中Rs-Rf1基因的表达特征,以及分析了在恢复系NAU-RsWR1、不育系NAU-RsWA1、保持系NAU-RsWB1和F1不同发育时期(减数分裂,四分体,小孢子)的花蕾中Rs-Rf1和orf138基因的互作模式。结果显示Rs-Rf1基因在根、茎、叶、花柄、花蕾中都有表达,不过根中表达量较弱；花期各器官的表达量较蕾期的要高。Rs-Rf1基因在恢复系和F1中随着花蕾的发育,表达量逐渐变大,在恢复系中的表达量要高于Fl,而在不育系和保持系中不表达；orf138基因在不育系和F1中随着花蕾的发育,表达量逐渐变大,在不育系中的表达量要高于F1,但在恢复系和保持系中不表达。分别从5个不同的恢复系和保持系中进行恢复基因的分离克隆和测序分析,应用"DNAStar GeneQuest enzyme-restriction map"软件分析发现限制性内切酶SspI在Rs-Rf1和Rs-rf1基因中酶切位点不同,经SspI酶切与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测,若有2个酶切位点(产生3个酶切片段,大小分别为1,538、629、363bp),则表明该自交系携有育性恢复基因；如果仅有1个酶切位点(产生2个酶切片段,大小分别为2,167、363bp),表明该自交系是保持系。本研究开发的利用分子标记辅助选择萝卜候选保持系的方法,可以快速准确地选择出优良候选保持系,从而提高萝卜优良CMS雄性不育系的选育进程,为大规模优良不育系快速培育提供有力技术支撑。(3)在获得稳定的萝卜胞质雄性不育系NAU-RsWA1和保持系NAU-RsWB1材料体系的基础上,采用mRNA差异显示聚合酶链式反应技术(DDRT-PCR)研究两个材料花粉发育减数分裂、四分体和小孢子3个时期基因的表达差异,获得了90条阳性差异转录片段(transcript derived fragments, TDFs);其中在保持系NAU-RsWB1花粉发育3个时期表达增强的特异片段有60条,在不育系NAU-RsWA1花粉发育3个时期表达增强的特异片段有30条。将差异片段回收、克隆、测序,在GenBank数据库中进行同源序列比对和功能预测,差异表达的基因涉及细胞壁合成与调控、花粉发育,防卫与胁迫反应、电子传递和能量途径、普通新陈代谢、蛋白质代谢、信号转导、转录调控和转运通道等方面,其中39%的差异表达基因功能未知或无相似序列。对22条在不育系和保持系花蕾中差异表达的片段进行时空表达模式分析,发现大多数差异片段所代表的基因在不育系和保持系的不同器官(雄蕊,花瓣,叶,茎)和花粉发育的不同时期(减数分裂,四分体,小孢子时期)的表达不尽相同。(4)利用DDRT-PCR筛选得到了花粉发育相关的差异片段所代表的基因(PCP,Bnm, TCTP, Rac),利用同源克隆得到这些基因的DNA和cDNA全长,分别命名为RsPCPl, RsPCP2, RsBnm, RsTCTP和RsRac,并对它们的氨基酸序列和表达特征进行研究。利用RT-PCR分析其在不育系和保持系的雄蕊,花瓣,叶,茎以及花蕾发育的3个时期的表达情况,结果表明,RsPCPl, RsPCP2, RsTCTP和RsBnm基因在保持系花蕾发育的3个时期都表达,但表达强弱不同,在不育系花蕾发育的3个时期都不表达或表达量很弱；这些基因在保持系的雄蕊和茎中表达,除了RsPCP2基因在不育系的雄蕊中检测到较弱的表达外,其它基因在不育系不同组织中都不表达。RsRac基因在不育系3级花蕾中的表达先降低再升高,在保持系3级花蕾中都不表达；该基因在不育系的雄蕊、花瓣、叶、茎中均表达,在保持系不同组织中都不表达。(5)利用DDRT-PCR分析筛选得到了在保持系3级花蕾中微弱表达但在不育系花蕾中高表达的差异片段。采用同源克隆的方法,得到其cDNA全长,命名为RsBHLH。该基因编码336个氨基酸,具有basic helix-loop-helix (bHLH)结构域；进化分析表明,RsBHLH与AtBHLH060同源性很高,是冗余基因AtBHLHs060/048的直系同源基因。RT-PCR和qRT-PCR分析其在不育系和保持系的雄蕊、花瓣、叶、茎以及花蕾发育的3个时期的表达情况,结果显示其在不育系雄蕊、花瓣、叶、茎以及花蕾发育的3个时期都有稳定表达,且在雄蕊中表达量最高。同不育系相比,RsBHLH在保持系雄蕊、花瓣、叶、茎中均不表达,但在花蕾发育的3个时期中有较弱的表达。(6)利用DDRT-PCR分析筛选得到了一个在保持系3级花蕾都稳定表达且表达量很高,但在不育系小孢子时期的花蕾中有微弱表达的差异片段。采用同源克隆的方法,得到其cDNA全长,命名为RsCHS。该基因编码392个氨基酸,具有CHS结构域；进化分析表明,RsCHS与油菜CHS氨基酸序列一致性最高,达到95%,其次与拟南芥CHS的一致性达到93%。RT-PCR和qRT-PCR分析其在不育系和保持系的雄蕊,花瓣,叶,茎以及花蕾发育的3个时期的表达情况,发现该基因在保持系雄蕊、花瓣以及花蕾发育的3个时期都有稳定表达。(7)利用DDRT-PCR分析筛选得到两个与细胞壁合成和调控相关的基因RsPMEI和RsPG.采用同源克隆法得到cDNA全长。RT-PCR和qRT-PCR分析表明RsPMEI基因在保持系花蕾发育的3个时期都表达,且表达量都很高；在不育系花蕾发育的减数分裂时期和四分体时期有少量的表达,但在小孢子时期不表达；RsPMEI基因在保持系雄蕊中表达量最大,在叶中次之,花瓣中表达量最弱,茎中不表达,该基因在不育系雄蕊、花瓣、叶、茎中均不表达。RsPG基因在保持系花蕾发育的3个时期都表达,并且随着发育时期的推进,表达量呈上升趋势,该基因在不育系花蕾发育的3个时期都不表达；RsPG基因在保持系和不育系雄蕊、花瓣、叶、茎中均不表达。
杜昌升[6]2005年在《牙鲆抗病毒及免疫相关基因的克隆鉴定及表达分析》文中研究表明牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一个优良的高效海水养殖品种。目前在国内被广泛养殖,给养殖业创造了良好的经济效益。但是目前的主要养殖方式是室内工厂化,与海上的网箱养殖相比,养殖密度大,水质容易恶化,称为各种疾病的诱因,而且牙鲆具有水底集群的习性,使得疾病传染加剧,虽然利用一些药物取得了一定的防治效果,但是长期的施药不仅会导致水体的污染,也会造成诸多耐药性病原体的产生,为进一步的防治工作变得更为复杂。因此进行牙鲆相关的鱼类免疫学研究是必要和必须的。本文的研究内容和结果主要包括以下几个方面:首先,探索了SMRV 病毒和鱼类培养细胞的相互作用,结果发现,SMRV 病毒感染的CLC 细胞死亡途径主要是细胞凋亡,凋亡的发生基本上不影响子代病毒粒子的复制,而病毒的复制对细胞凋亡的发生则是必须的。其次,以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester),正常对照细胞作为驱赶子(driver),分别提取mRNA,逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR 扩增后,取正向差减的PCR 产物与T 载体连接,构建抑制差减cDNA 文库,随机挑取7400 余个克隆,对其中4200 多个克隆进行PCR 扩增鉴定,发现近4000 个克隆中均含有插入片段,大小在250-1000bps 之间,进一步对含有插入片段的近4000 个克隆进行了斑点杂交筛选,得到近668 个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆。初步的结果表明所建立的差减cDNA 文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因。第叁,构建SMART-cDNA 文库并结合RACE 技术成功克隆到了cystein proteinase, decorin, NDPK, RACK, chemokine 等重要的免疫相关基因,这些基因在牙鲆中都是首次被克隆鉴别,利用对它们的RT-PCR 分析表明,不同的基因在细胞及组织上具有不同的时空分布。最后,对decorin 基因进行了进一步的重组原核表达载体的构建、原核表达、蛋白纯化、抗体制备,对肝、脾、头肾、后肾、皮肤、心、肌肉、脑、肠、鳃、卵巢、精巢等组织中的decorin 表达蛋白进行的western blot 分析表明在检测
鲁延军[7]2008年在《家蚕Bm-lethal基因的克隆、表达及功能研究》文中认为农业害虫60%以上属于鳞翅目。研究和利用鳞翅目害虫的致死基因,制造并向环境释放一定数量的隐性或条件显性致死基因雄虫,能够向害虫种群扩散致死基因,达到长期抑制害虫数量、控制虫害的目的,对于农业害虫的生物防治具有重大意义。家蚕是鳞翅目模式昆虫,也是唯一完成全基因组测序的鳞翅目模式生物,这为鳞翅目害虫的功能基因研究提供了一个便利的平台。本研究基于家蚕WGS数据库、EST数据库、protein数据库,以果蝇、线虫公布的lethal基因为原始数据,运用生物信息学方法,结合RT-PCR、分子克隆、原核表达、RNAi等生物实验技术,第一次大量克隆获得了家蚕lethal同源基因,并对其进行结构分析和功能研究。主要获得以下结果:1家蚕lethal同源基因的电子克隆利用生物信息学方法,以果蝇和线虫中公布的146个lethal基因为原始数据,从家蚕的EST数据库中克隆出7条lethal同源基因,分别命名为Bm-lethal(2()GeneBank登录号:EF157831)、Bm-lethal(3) s1921、Bm-lethal(3) neo18、Bm-lethal(3) 07882、Bm-lethal(3) 02640、Bm-female lethal和Bm-let-2(GeneBank登录号:EU183409)。这是迄今为止报道和登陆鳞翅目昆虫lethal同源基因最多的一次。2家蚕lethal同源基因的cDNA克隆及序列分析从家蚕C108品种5龄幼虫脂肪体转录产物中,克隆、测序验证了Bm-lethal(2)、Bm-lethal(3) s1921、Bm-lethal(3) neo18、Bm-lethal(3) 07882、Bm-lethal(3) 02640和Bm-let-2 6条同源基因,结合RACE技术,获得了Bm-lethal(2)和Bm-let-2的全长mRNA序列。生物信息学分析表明,Bm-lethal(2)的氨基酸包含一个DAO(D-amino acid oxidase)蛋白家族功能域,具有1个甘油-3-磷酸脱氢酶保守区和2个Ca2+结合区域,属于FAD-依赖性氧化还原酶;Bm-lethal(3) s1921的氨基酸包含6个EZ-HEAT重复片段,与其它物种的脱氧辅蛋白羟化酶具有50%以上的同源性,可能是脱氧辅蛋白羟化酶;Bm-lethal(3) neo18在家蚕体内存在2个mRNA转录体,编码同一蛋白质,与其它物种的泛醌1β子复合体5蛋白质的C端有40%-60%的同源性,可能为泛醌的一个子复合体亚基,参与氧化还原反应;Bm-lethal(3) 07882的氨基酸包含一个Nop14(nucleolar protein 14)蛋白质家族功能域,与人、鼠等物种的Nop14具有40%-50%的同源性,推测其为Nop14蛋白基因。Bm-lethal(3) 02640的氨基酸包含一个胆色素原脱氨酶的保守区,又是dipyromethane辅助因子的绑定区域,与其它物种的胆色素原脱氨酶的蛋白质N端部分有60%-70%的同源性,推测其为胆色素原脱氨酶基因。Bm-let-2的蛋白质与按蚊、蜜蜂、人等物种的type IV collagenα1(IV)链有较高的同源性,其C端包含2个重迭的type IV collagen保守区和9个collagen蛋白家族功能域,说明其为type IV collagen蛋白质基因。利用家蚕dbWGS,结合RT-PCR等生物实验,拼接完成了Bm-lethal(2)和Bm-let-2的全基因序列。并利用MAGE3分别对其进行同源进化树分析,显示其均与蜜蜂、果蝇等昆虫的进化距离较近,而与人、牛等哺乳动物的进化距离较远,与传统理论的进化关系相一致。3 Bm-lethal(2)基因的原核表达、时空表达分析及RNAi研究原核表达实验,证明Bm-lethal(2)能够在原核细胞中大量诱导表达。时空表达研究证明,Bm-lethal(2)基因在血液中的表达量较少,而在生殖腺、脂肪体、丝腺和中肠中没有发现明显的组织表达特异性;Bm-lethal(2)基因在5龄幼虫阶段的表达量逐渐上升,在蛹期显着下降,而在处女蛾卵期的表达量却最高,之后下降。在产卵后72 h、及盐酸活化处理1 h时几乎没有表达。RNAi研究显示,注射Bm-lethal(2)dsRNA后,Bm-lethal(2)的表达量明显下降,但家蚕的生命力没有发生明显变化,在注射后9 d,Bm-lethal(2) RNAi组家蚕的体重明显高于阴性和阳性对照组。Bm-lethal(2)基因被抑制后,可能有其它基因代替执行其相应的功能。
钟涛[8]2008年在《草地螟触角气味结合蛋白基因克隆及表达》文中指出草地螟是我国北方地区严重发生的一类重要的农牧业害虫。近年来,对草地螟的行为学研究比较多,但对草地螟嗅觉识别的分子机制研究,国内外尚未见报道。从分子生物学角度来研究草地螟在产卵和取食过程中对其寄主植物选择性识别机制,可以为开发防控草地螟为害的技术提供新思路。有研究表明,昆虫触角气味结合蛋白在昆虫感知外界信息物质中起作用,并且该类蛋白广泛地存在于昆虫触角嗅觉感受器中。本论文通过基因克隆及原核表达技术对草地螟触角气味结合蛋白进行了研究。已取得的主要结果如下:(1)利用RT-PCR结合RACE技术克隆了草地螟触角普通气味结合蛋白Ⅰ(GOBP1)基因(GenBank登录号为EU413989)。序列分析表明:LstiGOBP1含有完整的蛋白编码区序列,并具有真核生物分泌蛋白的信号肽特征;蛋白呈酸性,有4个亲脂性区域;该蛋白拥有气味结合蛋白的典型结构特征,即序列中含有6个完全保守的半胱氨酸残基,联结形成3个二硫键;与鳞翅目昆虫的同源性在58.2%左右。根据已知的基因序列,构建了LstiGOBP1的原核表达载体,并在大肠杆菌中成功进行了诱导表达,表达产物经Western印迹实验证明与预测蛋白大小一致。(2)利用RACE技术克隆了草地螟触角普通气味结合蛋白Ⅱ(GOBP2)基因(GenBank登录号为EU239360)。序列分析表明:雌雄虫触角中的LstiGOBP2的核苷酸序列没有差别;LstiGOBP2含有完整的蛋白编码区序列,并具有真核生物分泌蛋白的信号肽特征;蛋白呈酸性,有4个亲脂性区域;该蛋白拥有气味结合蛋白的典型结构特征,即序列中含有6个完全保守的半胱氨酸残基,联结形成2个二硫键;与鳞翅目昆虫的同源性在81%左右。根据已知的基因序列,构建了LstiGOBP2的原核表达载体,并在大肠杆菌中成功进行了诱导表达,表达产物经Western印迹实验证明与预测蛋白大小一致。(3)利用RT-PCR结合RACE技术克隆了草地螟触角信息素结合蛋白(PBP)基因(GenBank登录号为EU545482)。序列分析表明:LstiPBP序列含有完整的蛋白编码区序列,并具有真核生物分泌蛋白的信号肽特征;蛋白呈酸性,有4个亲脂性区域;该蛋白拥有气味结合蛋白的典型结构特征,即序列中含有6个完全保守的半胱氨酸残基,联结形成2个二硫键;与鳞翅目昆虫的同源性在64%左右。根据已知的基因序列,成功构建了LstiPBP的原核表达载体。(4)利用RACE技术克隆了草地螟雌虫触角信息素结合蛋白FM1(PBPFM1)基因(GenBank登录号为EU638330)。序列分析表明:LstiPBPFM1含有一段编码138个氨基酸的编码区序列,第18、19个氨基酸残基之间可能存在切割位点;蛋白呈酸性,拥有气味结合蛋白的典型结构特征,序列中含有6个完全保守的半胱氨酸残基,联结形成3个二硫键;与鳞翅目昆虫的同源性在57.2%左右。(5)利用RACE技术克隆了草地螟雌虫触角信息素结合蛋白FM2(PBPFM2)基因(GenBank登录号为EU638331)。序列分析表明:PBPFM2含有一段编码69个氨基酸的编码区序列;蛋白呈酸性,有1个明显的亲脂性区域;该蛋白拥有气味结合蛋白的典型结构特征,即序列中含有3个完全保守的半胱氨酸残基;与鳞翅目昆虫的同源性在51.2%左右。(6)利用RACE技术克隆了草地螟核糖体蛋白L24(Rp L24)基因(GenBank登录号为EU339126)。序列分析表明:LstiRpL24含有完整的蛋白编码区序列;蛋白呈碱性。与鳞翅目昆虫的同源性在94.4%左右。
刘海泉[9]2008年在《嗜热毛壳菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与性质研究》文中进行了进一步梳理几丁质是地球上含量仅次于纤维素、位居第二的碳水化合物,而真菌所分泌的几丁质酶可将几丁质水解,最终产物为N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(N-Acetyl-β-D-Glucosamine,NAG)。由于采用传统化学方法降解几丁质耗时、难度大、成本高、污染严重,而采用生物降解不仅有效克服了上述问题,还可提高资源利用、增加经济效益,因此被广泛应用在农业、医药、化工、食品、环境等诸多领域。尽管已经分离了许多种几丁质酶,相关的基因也已克隆和表达,但有关热稳定性几丁质酶的研究却很少。目前仅从极端耐热古细菌Thermococcus chitonophagus、Thermococcus kodakaraensis KOD1以及细菌Bacillus BG-11、Streptomyces OPC520等中分离到热稳定几丁质酶基因,而真菌中除了本实验室报道的来源于嗜热真菌疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的热稳定几丁质酶基因外,未见其它报道。嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)广泛分布,生长上限温度较高,从该真菌中已分离得到多种嗜热酶,但未见嗜热几丁质酶的报道。本研究中C. thermophilum在以胶状几丁质为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了胞内几丁质酶。根据真菌几丁质酶的氨基酸同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了嗜热毛壳菌C. thermophilum热稳定几丁质酶chit基因,cDNA序列全长为1209bp,包含一个开放阅读框,编码402个氨基酸。该基因已在Genbank中注册,登录号为EU697741。同时提取出嗜热毛壳菌C. thermophilum基因组DNA,克隆了该酶的部分DNA序列,获得的序列长1263bp,包含一个内含子区域。该基因在GenBank中注册号为EU697742。由核苷酸序列推测的相应氨基酸序列结构包括催化区,无N端信号肽序列、几丁质结合区和富含丝苏氨酸区。比较几丁质酶的催化区序列,发现与18家族几丁质酶的催化区同源性很高,其中两个基序S-GGW和DG-D-DWE非常保守,这两保守基序与糖基水解酶(glycosylhydrolases)18家族催化活性有关,其中不变氨基酸残基Asp和Glu为几丁质酶的催化活性位点,因此该酶应属于几丁质酶18家族。还利用在线软件预测了该蛋白质的糖基化位点和叁级结构。并对该基因的系统发育作了初步分析。将chit基因与酵母表达载体pPIC9K经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,体外连接构建了酵母分泌型表达载体pPIC9K/chit,将重组表达质粒pPIC9K/chit和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶SacⅠ(位于5’AOX1区内)线性化后,采用电击法转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的几丁质酶的工程菌株。经过检测与筛选获得了转酵母工程菌株GS-CH-4,检测遗传稳定性,并测定了几丁质酶CHIT的酶学性质。酵母工程菌株GS-CH-4在YPD平板上划线,连续传代8次后,PCR检测呈阳性,重组几丁质酶的表达量基本保持稳定。表达几丁质酶CHIT的最适反应温度和pH分别为60℃和5.5,该酶在50℃以下稳定;65℃的半衰期为40min,由此可见该表达几丁质酶具有热稳定性,且在pH值为2.0～6.0之间表达几丁质酶保持稳定的酶活性;Ba2+、Fe2+对酶有激活作用,一些重金属离子Ag+、Hg2+对酶有显着的抑制作用。C. thermophilum几丁质酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白,而且表达产物具有优良特性,这就预示了表达几丁质酶在几丁质工业和生物学领域的广阔应用前景。因此,期望能对该基因进行改造,或进一步优化表达条件,获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。
何青[10]2013年在《中国大鲵Sox2和Sox19基因cDNA全长克隆及其组织表达分析》文中提出中国大鲵是地球上生存至今体形最大的两栖动物,是我国独有的稀有物种,已经被列入国家二级保护动物名录中,还被列入CITES公约附录Ⅰ中。中国大鲵在药用、科研、食用、观赏等方面具有重要的开发和研究价值。Sox基因家族是参与个体发育与分化的基因家族,是进化过程中高度保守的基因家族。对Sox基因家族进行研究可以揭示动物性别决定与分化的分子机制、胚胎发育的调控及多种组织器官发生发育过程的调控机制,也可以为一些疾病的诊断和治疗提供分子依据。本实验对中国大鲵Sox2和Sox19基因进行克隆,对其生物学特性进行初步分析,并研究其组织表达情况,为后续的进一步了解中国大鲵Sox2和Sox19基因的结构和功能打下基础,也为用分子生物学方法揭示中国大鲵系统进化、性别决定与分化的分子机制和胚胎发育的调控等打下基础。本论文利用RACE技术,扩增得到了中国大鲵Sox2基因的cDNA全长,全长为2233bp,开放阅读框共963bp,编码320个氨基酸。对中国大鲵Sox2基因的cDNA全长在NCBI上的BLAST在线分析结果表明：其与红腹蝾螈(Cynops pyrrhogaster)和东美螈(Notophthalmus viridescens)的相似度较高分别为89%和88%,与非洲爪蟾(Xenopus laevis)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)、马(Equus caballus)、猫(Felis catus)、水牛(Bubalus bubalis)、原鸡(Gallus gallus)的相似度在76%-82%之间,与鱼类的相似度较低在20%-40%之间。将Sox2基因所编码的蛋白质用相同方法进行分析,结果显示其与红腹蝾螈I(Cynops pyrrhogaster)相似度最高为92%,与小鼠(Mus musculus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、大西洋鲑(Salmo salar)、黄腊鲹(Trachinotus blochii)、人(Homo sapiens)、马(Equus caballus)、原鸡(Gallus gallus)等物种的相似度在69%-80之间。本论文还选取不同物种Sox2基因蛋白质序列,基于本研究中所克隆中国大鲵Sox2基因的蛋白质序列,利用MEGA5.0软件,采用邻接法(Neighbor-joining method)重复10000次构建系统发育树,结果显示：中国大鲵与东美蝾和红腹蝾螈聚成一支；鱼类自成一大支；非洲爪蟾和热带爪蟾与哺乳类和鸟类共在一个大支,但是处于不同的分支。表明其与东美蝾和红腹蝾螈的进化关系更为接近,基本符合物种进化的历程。本论文利用RACE技术,扩增得到了中国大鲵Sox19基因的cDNA全长,全长为1290bp,开放阅读框共858bp,编码285个氨基酸。中国大鲵Sox19基因的cDNA全长在NCBI上的BLAST在线分析结果表明,其与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)相似度为85%,与比目鱼(Hippoglossus)相似度为87%；用DNAMAN与小家鼠(M.musculus)进行比对相似度为8%。将中国大鲵Sox19基因所编码的蛋白质用相同方法进行分析,结果显示其与红鳍东方纯(Takifugu rubripes)相似度为55%,与斑马鱼(Danio rerio)相似度为58%,与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)相似度为64%：与小家鼠(M.musculus)相似度为12%。分析结果显示中国大鲵与其他物种的Sox19基因相似度比较低,且蛋白质序列的相似度并没有高于核苷酸序列的相似度,但是,通过比对发现Sox19基因的HMG盒在各物种之间还是很保守的。选取不同物种Sox19基因蛋白质序列,基于本研究中所克隆中国大鲵Sox19基因的蛋白质序列,利用MEGA5.0软件,采用邻接法重复10000次构建系统发育树,结果显示,中国大鲵单独聚成一支；鱼类自成一大支；小家鼠单独成一支。分析结果得知：中国大鲵与鱼类的进化关系相对哺乳类更为接近,基本符合物种进化的历程。本论文还基于中国大鲵Sox2和Sox19基因的cDNA序列,对中国大鲵的心脏、肾脏、卵巢和肠道组织做了表达谱分析。结果表明,中国大鲵Sox2基因在卵巢中的表达量最高,肾脏中次之,在肠道中表达极低；中国大鲵Sox19基因在心脏中的表达量最高,卵巢中次之,在肾脏和肠道中的表达量相近,在肾脏中的表达量略高于肠道。
参考文献：
[1]. 荞麦黄酮代谢合成相关基因的克隆及分析[D]. 张艳. 西北农林科技大学. 2008
[2]. 金银花chs、fls、chi基因全长克隆及序列分析[D]. 乔中全. 中南林业科技大学. 2012
[3]. 柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的鉴定和表达模式研究[D]. 丁天波. 西南大学. 2014
[4]. 木质素代谢相关酶在梨石细胞合成中的作用[D]. 王丹阳. 南京农业大学. 2014
[5]. 萝卜CMS育性相关基因分离鉴定与表达特征分析[D]. 孙新菊. 南京农业大学. 2012
[6]. 牙鲆抗病毒及免疫相关基因的克隆鉴定及表达分析[D]. 杜昌升. 中国科学院研究生院（水生生物研究所）. 2005
[7]. 家蚕Bm-lethal基因的克隆、表达及功能研究[D]. 鲁延军. 苏州大学. 2008
[8]. 草地螟触角气味结合蛋白基因克隆及表达[D]. 钟涛. 西南大学. 2008
[9]. 嗜热毛壳菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与性质研究[D]. 刘海泉. 山东农业大学. 2008
[10]. 中国大鲵Sox2和Sox19基因cDNA全长克隆及其组织表达分析[D]. 何青. 四川农业大学. 2013