大兴安岭地区粮油检验监测站
摘要：采用现代化的免疫亲和柱的有效前处理方法，构建出乙醇、水以及乙的三元流动相类型体系来完成对黄曲霉素的分离，并保证这三项的相应比例为二十八比五十五比十七，为了能最大限度的保证分析准确性，在分析中采用了高效液相色谱这一优秀的分析技。通过这一方法的使用能在二十分钟之内完成黄曲霉素这种物质的检定，同时检定结果的线性关数值大于零点九九九九。实验分析样品在不同水平下进行加标回收的过程中相应的回收率能在百分之七十九到百分之一百零八之间，实验分析结果的相对标准偏差在百分之二点二到百分之九点五之间，这种实验分析方式在实际的试验中具有分析速度快、检验灵敏度高、操作相对简单、实验分析在再现性良好的特点。
关键词：稻谷；黄曲霉素；高效液相
黄曲霉素这种物质是由黄曲霉菌或者寄生曲霉菌等类型的产毒菌株所产生的产物，在目前的研究之中，黄曲霉素这种物质是自然界中已发现的最为稳定的一种美军毒素。这种物质的在物理性方面表现为在水中溶解度较小，并且比较容易溶解于油脂溶剂、甲醇溶剂、丙酮溶剂、氯仿溶剂等类型的有机溶剂，但这种不会石油醚物质、乙烷物质相容，同时这种物质具有较强的毒性，还能引起发生癌变、基因突变。可见黄曲霉素这种物质对于人体健康影响极大，所以为了能有效避免黄曲霉素影响到人们的身体健康，所以目前世界上正在积极展开对于黄曲霉素这种物质的各方面研究，并且在目前阶段取得了良好的研究成果，进而在目前的黄曲霉素物质检验的过程中出现了薄层色谱类型的检测方法、酶联免疫类型的吸附方法、以及高效液相色谱类型的检测方法，但在实际检验过程中薄层类型的色谱分析技术以及酶联免疫类型的吸附方式存灵敏度不足以及重复性不足的问题。为了能从根本上提升对于黄曲霉素这种物质的检测质量，在本次实验之中采用了免疫亲和柱类型的前处理方式，并在实验中构建出乙醇、水以及乙的三元流动相类型体系来完成对黄曲霉素的分离，以期通过这种新方式进一步提升对于黄曲霉素这种物质的检测。
1.实验材料以及方法
1.1材料分析
P黄曲霉毒素免疫亲和柱:德国R－Biopharm公司;甲醇、乙腈:色谱纯，中国国药集团;黄曲霉素G2、G1、B2和B1标准品:德国R-Biopharm公司;玻璃纤维滤纸:美国维康公司;比色管、玻璃测试管:上海天玻。黄曲霉素G2，G1，B2和B1的混合标准储备溶液:6mL质量浓度为1．0×10-3mg/mL的黄曲霉毒素总量，其中黄曲霉素G2，G1，B2和B1质量浓度分别为2．5×10-4mg/mL。黄曲霉素B1，B2，G1和G2的混合标准工作溶液:准确移取上述标准储备溶液，用甲醇/水(体积比为50∶50)稀释，配置质量浓度分别为0．0、5×10-7、1．0×10-6、2．5×10-6、5．0×10-6、1．0×10-5、2．0×10-5mg/mL的混合标准溶液。
1.2样品前处理
1.2.1样品制备
取代表性样品500～1000g，粉碎至80%以上过20目筛，筛上物和筛下物混匀。
1.2.2样品提取
称取25．0g粉碎样品，5．0g氯化钠，至于搅拌杯中，再加入125mL甲醇/水(体积比为60∶40)，盖上搅拌杯的盖子，高速搅拌2min，静置1～2min，取下盖子，将提取物用玻璃纤维滤纸过滤于150mL比色管中。
1.2.3净化
移取20mL滤液于50mL比色管中，加入20mL超纯水稀释滤液，混匀。再将上述稀释后的滤液用玻璃纤维滤纸再次过滤，收集于50mL比色管中。移取澄清滤液10mL(10mL相当于1．0g样品)以1～2滴/s的流速全部通过AFLAPREP免疫亲和柱，直至空气完全进入到免疫亲和柱中。加10mL超纯水以约2滴/s的流速淋洗免疫亲和柱，直至空气完全通过免疫亲和柱，重复用10mL超纯水淋洗免疫亲和柱。准确加入1．0mL色谱纯的甲醇，调节流速以1～2滴/s淋洗免疫亲和柱并收集全部样品洗脱液(1．0mL)于玻璃测试管中，供HPLC测定。
1.3仪器条件
色谱柱:AgilentC18(5μm，4．6mm×250mm);流动相:甲醇∶乙腈∶水(体积比为28∶17∶55);流速:1．0mL/min;进样量:20μL;柱温:25℃;检测器:荧光检测器;检测波长:Ex360nm，Em440nm。
2.实验结果以及讨论
2.1实验条件分析
在本次实验过程中采用了黄曲霉素物质免疫亲和类型的柱基单克隆抗体技术，并且这种亲和柱之中含有能和凝胶物质发生共价结合的相应单克隆类型抗体。
此抗体对黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1具有特异性。样品提取液通过亲和柱后，样品中的黄曲霉毒素会和凝胶中的抗体结合。再通过加入甲醇溶液洗脱结合在抗体上的黄曲霉毒素。洗脱液被收集于试管中用于高效液相色谱检测。采用免疫亲和柱净化技术具有高度特异性、高灵敏度、高回收率等特性，且分析快速、易操作，是分析检测黄曲霉毒素样品的理想净化方法。
同时因为黄曲霉毒素免疫亲和柱中含有的单克隆抗体是有一定量的，所以一旦通过免疫亲和柱的样品量过大，就无法保证样品提取液中黄曲霉毒素完全被吸附，从而造成回收率较低。因此在日常检测样品时应根据黄曲霉毒素的大致含量进行适当的稀释，可使试验得到较高的回收率。
流动相和流速的优化分别以甲醇/水(体积比为45∶55)、甲醇/水(体积比为70∶30)和甲醇/乙腈/水(体积比为28∶17∶55)为流动相对样品中的黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1进行分离。试验结果显示，以甲醇/乙腈/水(体积比为28∶17∶55)为流动相时，其色谱峰的峰形优于其它流动相的峰形，且各成分之间分离效果最好，无拖尾现象。同时随着流动相的流速增大，保留时间相应缩短，但峰形集中，柱前压较大，影响分离柱的使用寿命，1．0mL/min的流速完全能保证黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1的分离
2．2结果讨论
方法的线性范围与方法的检出限在规定的色谱条件下，测定系列黄曲霉素G2、G1、B2和B1的混合标准溶液，用峰面积对混合标准溶液中各组分的质量浓度进行定量作图。黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1在质量浓度为0．5～20．0μg/L的范围内有良好的线性关系，相关系数均大于0．999。线性方程及相关系数见下表1。
表1黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1标准溶液的线性范围和线性方程
3.结论
采用免疫亲和柱净化、光化学衍生在线衍生、高效液相色谱－荧光法检测稻谷籽粒样品中黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1，方法的检出限均小于0．40μg/kg，尤其是黄曲霉毒素B1的检出限为0．20μg/kg，相对标准偏差2．2%～9．5%，回收率在79%～108%之间。该方法简便快速、准确可靠、灵敏度高、重现性好，衍生条件具有无污染、反应快速稳定、操作简单等优点，是检测稻谷籽粒样品中黄曲霉毒素可靠有效的方法。免疫亲和－柱后光化学衍生的高效液相色谱法大大提高了检测灵敏度，且回收率高，重复性好，衍生条件简单、快速稳定、干扰少，非常适用于稻谷及稻谷籽粒中黄曲霉毒素的检测。
参考文献
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