一株新的高效尼古丁降解菌的分离鉴定、降解条件优化及代谢机制研究

论文摘要

尼古丁（Nicotine）具有高毒性,可透过生物膜,化学结构稳定,并且是致癌物质烟草特有亚硝胺（TSNAs）的重要前体物,存在于环境中不易降解,严重污染环境。由于其特殊的水溶性,能够与水以任意比例互溶,对人类生活及生态环境是一个极大的威胁。针对降解高毒、高危害的尼古丁微生物种类较少的实际情况,筛选出一株新的具有高尼古丁降解活性的菌株,探究其降解特性;研究了该菌的降解过程,对其降解条件进行中心响应面优化;通过全基因组测序,分析并确定尼古丁相关基因簇,初步构建ZUC-3尼古丁代谢途径,并对降解关键基因进行功能鉴定。旨在为尼古丁的生物降解相关领域及降解机制的研究提供新的微生物资源和理论依据,研究结果表明:从烟草种植大田土壤分离纯化得到一株具有高尼古丁降解能力的菌株,对其形态学、生理生化特征、16S rRNA基因序列同源性进行了分析鉴定,探究了不同条件下尼古丁降解特性并对其动态降解过程进行了HPLC分析。经鉴定命名为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3,单因素试验结果显示其适宜的降解条件为:温度30℃、起始pH 7.0、接种量10%、培养转速180 r/min,此条件下尼古丁降解率可达到91.53%,HPLC分析显示ZUC-3降解尼古丁过程的动态变化及其高效性。在寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3降解尼古丁的Box-Behnken中心响应面优化试验中,添加适量的蛋白胨和NH4NO3作为氮源,补充少量的葡萄糖和无机盐,通过PB（Plackett-Burman）试验筛选出对尼古丁降解率影响最显著的三个因素是:温度、时间和搅拌转速。在PB试验结果的基础上,下一步进行最陡爬坡试验设计,由PB试验结果设定爬坡方向与步长,逼近最优区域,得到中心点为:温度37℃,时间32 h,搅拌转速150 r/min,以此为中心点设计Box-Benhnken响应面优化试验,构建优化模型得到最佳条件为:温度30.13℃,时间35.41 h、搅拌转速183.32 r/min,尼古丁降解率理论值为98.34%,并以此条件进行实际降解试验,得到实际尼古丁降解率为99.13%,拟合度达到99.20%,相比优化前尼古丁降解率显著提高。对高效尼古丁降解菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3进行全基因组测序及分析,基因组组装共获得90个Contigs,ZUC-3基因组大小为6.08 Mb,共得到5519条CDS序列,tRNA数量为74。通过与已知尼古丁降解相关基因的BLAST比对,预测ZUC-3尼古丁降解相关基因的功能,ZUC-3尼古丁相关基因主要位于Contig3上,绘制出ZUC-3尼古丁降解基因簇,初步构建ZUC-3菌株尼古丁代谢途径。通过qRT-PCR测定ZUC-3降解途径上9个降解基因的表达水平,结果表明,当尼古丁存在时,9个降解基因的表达均显著上调。对ZUC-3中降解关键基因hspB进行分子克隆和功能验证,通过PCR扩增获得hspB基因,以pET 22b为载体,构建重组质粒pET 22b-hspB,转化大肠杆菌BL 21（DE3）进行异源表达,采用SDS-PAGE进行表达验证和检测,并对Hsp-B酶活进行测定。构建得到重组质粒pET22b-hspB并成功表达HspB蛋白,其分子量为43.97 kDa,通过试验检测其表达形式为包涵体,酶促反应结果表明HspB蛋白具有较高的6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶活性,明确了HspB的生物学功能和活性。

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摘要

Abstract

1 引言

1.1 尼古丁的理化性质

1.2 尼古丁的危害及毒性

1.3 尼古丁的污染及影响

1.4 尼古丁降解微生物的研究进展

1.4.1 生物降解尼古丁的研究现状

1.4.2 尼古丁降解微生物的种类及功能

1.4.3 微生物降解尼古丁的发展趋势

1.5 尼古丁降解微生物的代谢通路及关键分子机制

1.5.1 吡啶途径

1.5.2 吡咯途径

1.5.3 吡啶-吡咯混合途径

1.5.4 脱甲基途径

2 一株新的尼古丁降解菌的分离鉴定及降解特性

2.1 试验材料、试剂及仪器

2.1.1 实验材料

2.1.2 培养基

2.2 试验方法

2.2.1 尼古丁降解菌的筛选与分离

2.2.2 菌种鉴定

2.2.3 菌株ZUC-3的降解特性试验

2.2.4 ZUC-3降解尼古丁的HPLC检测

2.2.5 测定指标及方法

2.3 结果与分析

2.3.1 尼古丁降解菌ZUC-3的分离及对尼古丁降解作用

2.3.2 ZUC-3菌种鉴定

2.3.2.1 形态学特征

2.3.2.2 生理生化特征

2.3.2.3 16SrRNA基因序列同源性分析

2.3.3 Stenotrophomonas sp.ZUC-3的降解特性

2.3.3.1 寡养单胞菌ZUC-3生长与尼古丁降解的关系

2.3.3.2 温度对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响

2.3.3.3 pH对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响

2.3.3.4 接种量对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响

2.3.3.5 发酵方式对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响

2.3.3.6 初始尼古丁浓度对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响

2.3.4 寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的HPLC分析

2.4 讨论

3 ZUC-3降解尼古丁的响应面优化

3.1 试验材料、试剂及仪器

3.1.1 试验材料

3.1.2 培养基

3.1.3 试验试剂

3.1.4 试验仪器

3.2 试验方法

3.2.1 种子液的制备

3.2.2 Plackett-Burman试验设计

3.2.3 最陡爬坡试验设计

3.2.4 Box-Benhnken响应面试验设计

3.3 结果与分析

3.3.1 Plackett-Burma（PB）试验

3.3.1.1 PB试验方案及响应值

3.3.1.2 PB试验各因素效应分析

3.3.1.3 PB试验方差分析

3.3.2 最陡爬坡试验

3.3.3 Box-Benhnken响应面优化

3.3.3.1 Box-Benhnken响应面试验设计及响应值

3.3.3.2 二次回归模型拟合及方差分析

3.3.3.3 响应面分析及最佳发酵条件的确定

3.3.3.4 模型验证

3.4 讨论

4 ZUC-3尼古丁代谢机制及关键降解基因的功能

4.1 试验材料、试剂及仪器

4.1.1 试验材料

4.1.2 培养基

4.1.3 试验仪器

4.1.4 试验仪器

4.2 试验方法

4.2.1 ZUC-3全基因组测序及分析

4.2.2 ZUC-3尼古丁降解关键基因在转录水平的表达差异

4.2.3 ZUC-3尼古丁关键降解基因hspB的分子克隆及功能鉴定

4.2.3.1 引物设计、PCR扩增与目的片段的纯化回收

4.2.3.2 重组质粒pET22b-hspB的构建

4.2.3.3 HspB蛋白的表达纯化与SDS-PAGE分析

4.2.4 HspB蛋白的同源性及功能分析

4.2.5 HspB酶活性的测定

4.3 结果与分析

4.3.1 寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3尼古丁降解基因分析

4.3.2 ZUC-3尼古丁关键降解基因的表达水平差异

4.3.3 ZUC-3尼古丁关键降解基因hspB的分子克隆及功能鉴定

4.3.3.1 hspB基因的克隆与重组质粒pET22b-hspB的构建

4.3.3.2 Hsp蛋白的表达与纯化

4.3.4 HspB蛋白的同源性及其功能分析

4.3.5 HspB蛋白酶活性测定

4.4 讨论

5 结论与展望

参考文献

个人简历与研究成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈辰

导师: 朱大恒

关键词: 尼古丁,寡养单胞菌,降解特性,优化,降解基因簇,尼古丁代谢通路,蛋白

来源: 郑州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 郑州大学

分类号: X592;X172

总页数: 74

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