甲型和乙型流感病毒的型特异性启动子序列影响型间病毒复制机制的研究

论文摘要

甲型和乙型流感病毒是威胁人类健康的主要病原体,其基因组结构及编码的蛋白都非常相似。甲型和乙型流感病毒分别能够在型内或谱系间发生重配,但不能发生型间重配。甲型和乙型流感病毒的启动子序列高度保守,但它们在核苷酸构成上存在明显差异,这些差异元素的生物学意义尚不清楚。因此,本研究拟从甲型和乙型流感病毒启动子的差异元素入手,探索它们在型间病毒复制中的生物学意义。本研究中,我们分别对甲型和乙型流感病毒各基因片段的启动子序列进行了大规模的生物信息学分析,全面展示了甲型和乙型流感病毒启动子区的序列特征,发现了型特异性启动子元素的存在,分别为甲型流感病毒vRNA启动子中的5U、6’A和乙型流感病毒vRNA启动子中的5C、6’U。我们建立了甲型（A/WSN）和乙型（B/Yam）流感病毒的小型复制子系统,并比较了甲型和乙型流感病毒聚合酶对同型和异型vRNA模板的偏好性,结果表明,在小型复制子系统中,甲型和乙型流感病毒聚合酶都更偏好同型模板。随后,我们利用该系统,深入地研究了型特异性启动子元素互换对甲型和乙型流感病毒RNA合成和蛋白表达的影响,通过这些实验,我们首次发现型特异性启动子元素——vRNA启动子3’端第5个核苷酸是关键的启动子元素,它能够特异性地识别甲型和乙型流感病毒聚合酶。另外,我们通过体内、体外聚合酶活性试验,深入地探索了甲型和乙型流感病毒vRNA启动子3’端第5个核苷酸的特性在调节体内、体外聚合酶活性中的作用,结果表明,甲型和乙型流感病毒型特异性的启动子元素——vRNA启动子3’端第5个核苷酸的特性直接决定了聚合酶活性,它能够在RNA合成的起始和延伸的多个环节起作用。随后,我们利用反向遗传学技术,研究了这些启动子元素突变对病毒复制的影响。我们在病毒感染水平上确认了甲型和乙型流感病毒vRNA启动子3’端第5个核苷酸是调节型特异性的关键位点。有趣的是,甲型和乙型流感病毒对型特异性启动子元素互换突变的表现不同,其中在甲型流感病毒A/WSN中,将甲型特异性U5替代为乙型特异性C5,传代2-3次后,该位点能迅速地发生回复突变,而在乙型流感病毒B/Yam中,将乙型特异性C5替代为甲型特异性U5,经连续传代后,仍然能够保留该突变,但明显降低了病毒的复制效率。这些结果强调了甲型和乙型流感病毒对核苷酸突变的容忍度及其聚合酶的纠错能力存在明显差异。总之,本研究首次发现并揭示了甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素3’端第5个核苷酸是决定型特异性的关键位点。这表明甲型和乙型流感病毒启动子的变化会引起核糖核蛋白复合物的不匹配,对进一步阐明甲型和乙型流感病毒不能发生型间重配的机制具有重要的指导意义,也丰富了我们对流感病毒型特异性以及启动子生物学意义的认识。本课题还揭示了甲型和乙型流感病毒聚合酶在转录机制上存在的细微差异,这些功能差异将为甲型和乙型流感病毒聚合酶结构的研究提供重要素材。

论文目录

摘要

Abstract

英文缩略表

第一章前言

1.1 流感病毒

1.1.1 流感病毒及其基因组结构

1.1.2 流感病毒的生命周期

1.1.3 流感病毒的聚合酶

1.1.4 流感病毒的启动子

1.1.5 核糖核蛋白复合物（RNP）的功能

1.1.6 宿主细胞对于流感病毒感染的免疫应答

1.1.7 对抗流感病毒感染的主要策略

1.1.8 流感病毒的反向遗传学技术及其应用

1.2 片段匹配性在流感病毒进化过程中的作用

1.2.1 抗原漂移和抗原转变

1.2.2 流感病毒的基因重配

1.2.3 片段匹配性在基因重配中的作用

第二章甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素调节病毒RNA合成与蛋白表达研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 细胞和质粒

2.2.2 主要的实验试剂

2.2.3 质粒构建

2.2.4 甲型和乙型流感病毒启动子序列的生物信息学分析

2.2.5 甲型和乙型流感病毒小型复制子系统的建立

2.2.6 Primer extension和Western blot分析

2.2.7 病毒拯救

2.2.8 病毒生长曲线的绘制

2.2.9 病毒滴度的测定

2.2.10 病毒RNA序列测定

2.2.11 甲型和乙型流感病毒聚合酶蛋白复合物的纯化

2.2.12 ApG-primed transcription

2.2.13 二核苷酸复制起始试验

2.3 结果

2.3.1 生物信息学分析确认甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素的存在

2.3.2 甲型和乙型流感病毒聚合酶对不同型别RNA模板的偏好性

2.3.3 甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素在识别二者聚合酶中的作用

2.3.4 甲型和乙型流感病毒启动子3'端第5个核苷酸的特性在调节体内聚合酶活性中的作用

2.3.5 甲型和乙型流感病毒启动子3'端第5个核苷酸的特性在调节体外聚合酶活性中的作用

2.3.6 甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素突变对病毒复制的影响

2.4 讨论

第三章全文总结

3.1 全文总结

3.2 研究中的不足和有待进一步解决的问题

3.3 前景与展望

参考文献

文章情况

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 高菽蔓

导师: 邓涛

关键词: 流感病毒,启动子元素,型特异性,聚合酶

来源: 北京协和医学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 北京协和医学院

分类号: R373.13

DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000296

总页数: 110

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甲型和乙型流感病毒的型特异性启动子序列影响型间病毒复制机制的研究

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