家蟋蟀翅二型的分子机理研究

论文摘要

翅二型是昆虫种内形态分化的常见现象,广泛存在于双翅目、半翅目、鞘翅目以及直翅目等昆虫类群中,主要包括“天生型翅二型”和“落翅型翅二型”两类。翅型分化是昆虫适应环境变化而产生的生存应对策略,这种形态发育可塑性一直是众多昆虫学者关注的焦点,探究昆虫翅型分化的分子生物学机制可为理解昆虫适应性进化提供科学解释。现有研究多集中在飞虱、蚜虫等“天生型翅二型”的少数昆虫种类中,对于直翅目和“落翅型翅二型”昆虫的研究相对较少,尤其是对“落翅型翅二型”分化的分子调控机制尚无明确解释。家蟋蟀（Acheta domesticus Linnaeus 1758）是直翅目蟋蟀科中的常见鸣虫,属于“落翅型翅二型”,性状明显易观察,是研究落翅型昆虫翅二型分化的理想材料。本文利用转录组测序、基因共表达网络分析以及RNA干扰等方法对家蟋蟀翅二型分化的分子调控机理展开研究,结果如下:1.家蟋蟀翅二型属“落翅型翅二型”,且存在落翅规律。家蟋蟀羽化成虫初期,雌雄虫体的前后翅均发育完全,均表现为有后翅的“长翅型”。羽化成虫后群体内部分个体出现后翅脱落现象。在本文研究中的饲养条件下,家蟋蟀成虫后约20天,群体内落翅个体数达到高峰,而成虫36天后不再落翅,雌雄家蟋蟀的落翅规律基本一致,无明显差异。落翅后的个体,与后翅直接相连接的肌肉组织形态无明显变化。2.家蟋蟀八个生命时期的转录组测序结果。以家蟋蟀落翅高峰期为取样时间依据,选择家蟋蟀1龄若虫（时期I）,3龄若虫（时期II）,5龄若虫（时期III）,羽化成虫初期（时期IV）,羽化成虫后第10天（时期V）、20天（时期VI）、30天（时期VII）、40天（时期VIII）共八个时期的家蟋蟀样本,完成转录组测序。共获得135.23Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到5.0Gb,Q30碱基百分比在91.35%及以上;De novo组装后共获得141,456条Unigenes,其中长度在1kb以上的Unigenes有18,771条;对Unigenes进行功能注释,包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对,共获得32,508条Unigenes的注释结果。3.家蟋蟀翅二型分化即落翅高峰期前、中、后三个阶段的差异表达基因分析结果。两两比较家蟋蟀落翅高峰前（时期IV+V）、中（时期VI）、后（时期VII+VIII）三个阶段的差异表达基因（DEGs）。Volcano plot,MA-plot,Heatmap结果显示:在家蟋蟀落翅高峰期时DEGs上调,且表达量越高的基因差异越显著;通过GO,COG,KEGG等数据库对DEGs聚类分析发现,DEGs主要富集在“Amino acid transport and metabolism”、“ribosome,purine metabolism”和“protein processing in endoplasmic reticulum”等通路中,说明这些DEGs主要参与家蟋蟀生长发育过程中的蛋白合成与互作。上述分析结果说明家蟋蟀的落翅型翅二型分化很可能是基因调控的结果。4.利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选调控家蟋蟀翅二型分化即落翅的候选基因。以家蟋蟀8个时期的转录组数据获得的21,922个差异基因为数据集,进行基因的表达模式聚类,获得18个模块（用不同颜色表示,详见4.2.2）。将18个模块与家蟋蟀落翅规律关联分析,筛选出表达模式与家蟋蟀落翅规律正相关系数最高的模块为红色模块。在红色模块内选择表达模式与家蟋蟀落翅规律最为相近的profile 9作为关键profile,并以0.45为阈值筛选出具有功能注释信息的23个基因。利用Cytoscape建立基因共表达网络图,选择MCODE值排名前三的基因作为候选基因,分别为:AdomHSP40（Heat shock protein 40）、AdomCFDP（Craniofacial development protein）、AdomDIS3L（DIS3 Like 3’-5’Exoribonuclease）。此外,profile 9内Nylanderia fulva virus（RNA病毒）在家蟋蟀落翅高峰期的表达量远高于其他基因,推测家蟋蟀可能由于感染该病毒发生落翅现象,因此该基因也被作为候选基因。综上,借助WGCNA的方法,共筛选出四个可能调控家蟋蟀翅二型分化即落翅的候选基因。5.RNAi候选基因后统计落翅率发现:（1）胰岛素受体基因与家蟋蟀翅二型分化即落翅现象无直接调控关系。现有研究表明,胰岛素受体可调控飞虱的翅型分化,本文借助家蟋蟀的转录组数据,筛家蟋蟀中的胰岛素受体（AdomInR:Insulin receptor）作为候选基因之一,经RNA干扰AdomInR后,与野生型组的落翅率相比统计发现,落翅率无显著差异,说明AdomInR不参与调控家蟋蟀的翅二型分化即落翅。本文中家蟋蟀与飞虱翅二型发生的本质存在区别,所以二者翅型分化的分子调控机理可能存在差异。（2）AdomHSP40参与调控家蟋蟀翅二型分化即落翅现象。成功RNA干扰五个候选基因（AdomCFDP、AdomDIS3-L、AdomHSP40、AdomInR和Nylanderia fulva virus）,统计注射dsRNA后为期40天内不同处理组家蟋蟀的落翅率,发现仅ds AdomHSP40注射组,与野生型和dsGFP注射组相比,落翅率显著降低;AdomHSP40在家蟋蟀落翅高峰期表达量上调,促进家蟋蟀落翅,而通过RNA干扰AdomHSP40,降低其表达量后,家蟋蟀的落翅率降低,说明AdomHSP40参与调控家蟋蟀翅二型分化即落翅现象。荧光原位杂交（FISH）结果显示AdomHSP40基因在家蟋蟀翅基部有表达,且在落翅高峰期的已落翅家蟋蟀个体中表达量高于落翅高峰期前、后,FISH结果进一步证明了AdomHSP40参与调控家蟋蟀落翅型翅二型分化,并初步对其作用组织进行了定位分析。6.家蟋蟀落翅前后鸣声及生殖器官形态差异比较结果。比较家蟋蟀落翅前后雄虫鸣声发现:落翅前后家蟋蟀鸣声的单脉冲持续时长与单脉冲间隔时间存在显著差异,说明后翅脱落对家蟋蟀前翅的振动发音有显著影响;比较家蟋蟀落翅前后雌雄虫的生殖器官形态,结果显示落翅前后精巢与卵巢形态上均无明显变化,推测落翅对家蟋蟀生殖器官形态无明显影响。综上,本文以“落翅型翅二型”的直翅目昆虫家蟋蟀为研究对象,利用分子生物学和生物信息学等方法研究发现AdomHSP40参与调控家蟋蟀翅二型分化即落翅现象,首次对昆虫落翅的分子机理完成基础研究,可为理解昆虫翅型分化提供科学参考依据。

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摘要

Abstract

第一章引言

1.1 研究背景与进展

1.1.1 家蟋蟀

1.1.2 昆虫的翅型分化

1.1.3 现代生物学技术在昆虫翅型分化中的应用

1.2 研究目的与意义

第二章家蟋蟀翅二型分化规律研究

2.1 材料与方法

2.1.1 实验昆虫

2.1.2 实验器材

2.1.3 实验方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 家蟋蟀的最优饲养密度

2.2.2 家蟋蟀的翅二型分化规律

2.2.3 家蟋蟀落翅前后翅基部的肌肉形态比较结果

第三章家蟋蟀转录组测序研究

3.1 材料与方法

3.1.1 家蟋蟀样本的取样时期

3.1.2 家蟋蟀样本的RNA提取

3.1.3 家蟋蟀样本的转录组测序

3.2 结果与讨论

3.2.1 家蟋蟀样本的RNA提取结果

3.2.2 家蟋蟀样本的RNA测序结果

3.2.3 不同时期家蟋蟀样本的差异表达基因分析结果

第四章调控家蟋蟀翅二型分化候选基因的筛选

4.1 材料与方法

4.1.1 胰岛素受体基因筛选

4.1.2 调控家蟋蟀翅二型分化候选基因筛选

4.2 结果与讨论

4.2.1 家蟋蟀胰岛素受体基因筛选结果

4.2.2 WGCNA筛选调控家蟋蟀翅二型分化的候选基因结果

第五章调控家蟋蟀翅二型分化基因的功能验证

5.1 材料与方法

5.1.1 候选基因的RNA干扰

5.1.2 dsRNA注射后RT-q PCR测定RNAi效果

5.1.3功能基因的荧光原位杂交实验

5.2 结果与讨论

5.2.1 dsRNA合成结果

5.2.2 RNAi后RT-qPCR结果

5.2.3 RNAi后家蟋蟀落翅率统计结果

5.2.4 Adom HSP40 在家蟋蟀中的荧光原位杂交实验结果

第六章家蟋蟀落翅前后鸣声及生殖器官形态差异研究

6.1 材料与方法

6.1.1 家蟋蟀落翅前后雄虫的鸣声采集

6.1.2 家蟋蟀落翅前后生殖器官的形态观察

6.2 结果与讨论

6.2.1 家蟋蟀落翅前后雄虫鸣声差异分析

6.2.2 家蟋蟀落翅前后生殖器官形态差异分析

第七章结论

7.1 家蟋蟀的落翅型翅二型分化

7.2 胰岛素受体与家蟋蟀翅二型分化无直接关系

7.3 家蟋蟀落翅高峰期存在差异基因表达上调

7.4 Adom HSP40 参与调控家蟋蟀的翅二型分化

7.5 家蟋蟀落翅前后雄虫鸣声与生殖器官形态差异分析

7.6 创新点

7.7 展望

参考文献

附录

致谢

在学期间发表论文情况

文章来源

类型: 博士论文

作者: 陈琪

导师: 任炳忠

关键词: 翅二型,落翅

来源: 东北师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 东北师范大学

分类号: Q969

DOI: 10.27011/d.cnki.gdbsu.2019.000158

总页数: 114

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