导读:本文包含了扩展青霉脂肪酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:脂肪,突变,阴离子,酵母,载体,扁桃,聚乙烯醇。
扩展青霉脂肪酶论文文献综述
张向领[1]（2018）在《扩展青霉脂肪酶氧阴离子洞结构突变株的表达及性质鉴定》一文中研究指出为探究氧阴离子洞结构对扩展青霉脂肪酶的底物选择性的影响,本研究采用体外构建高拷贝重组载体的方法,将实验室课题组已经筛选出来的氧阴离子洞结构突变体进行重组载体的构建、转化及表达,最后检测分析了突变体脂肪酶在催化活性方面的变化。研究内容包括以下几点:1.脂肪酶突变体基因的扩增设计L133M、L133A、H131E/L133A,3种突变体脂肪酶的引物,进行质粒PCR,并转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3),挑选转化子进行测序验证。2.多拷贝重组载体的构建将PEL与载体pA0815连接并转化,获得单拷贝重组表达载体pA0815-m-PEL。酶切获得单拷贝表达盒,并将其与单拷贝重组载体进行连接及转化。获得两拷贝表达载体pA0815-m-2PEL。同理得到pA0815-m-3PEL，pA0815-m-4PEL重组质粒载体。3.脂肪酶突变体在毕赤酵母中的表达及其酶学性质的研究将四拷贝重组质粒表达载体pA0815-m-4PEL,转化到毕赤酵母感受态细胞GS115。经过初筛、复筛鉴定,得到多拷贝酵母工程菌GS-pA0815-m-4PEL。将筛选获得的酵母转化子进行发酵表达,并检测分析突变型脂肪酶在催化活性及底物选择性等方面性质的变化。(1)检测野生型脂肪酶(WT)与突变体L133M、L133A、H131E/L133A对5种不同链长底物(4-硝基苯基丁酸酯、4-硝基苯基已酸酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯、4-硝基苯基棕榈酸酯)的比活力。测定结果显示:脂肪酶突变体L133M、L133A、H131E/L133A对4-硝基苯基丁酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.75倍、2.61倍、2.25倍;对4-硝基苯基已酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.72倍、2.27倍、1.93倍;对4-硝基苯基辛酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.45倍、1.51倍、0.96倍;对4-硝基苯基月桂酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.84倍、3.93倍、5.53倍;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.59倍、9.42倍、8.82倍。(2)检测野生型脂肪酶(WT)与突变体L133M、L133A、H131E/L133A对手性化合物(R,S)-扁桃酸乙酯的底物选择性及催化活性。测定结果显示:脂肪酶突变体L133M、L133A、H131E/L133A对R-扁桃酸乙酯的比活力分别是野生型脂肪酶的1.89倍、11.1倍、13.2倍。对S-扁桃酸乙酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.68倍、0.70倍、0.62倍。与野生型脂肪酶相比,突变体L133A、H131E/L133A表现出“新”的底物选择性,对手性化合物(R,S)-扁桃酸乙酯表现出较好的对映选择性。(本文来源于《福建师范大学》期刊2018-06-01）
谢盛[2]（2017）在《扩展青霉脂肪酶的定向进化及稳定性的提高》一文中研究指出为了提高扩展青霉脂肪酶的稳定性,本研究采用了定点饱和突变的方法对影响酶稳定性的关键位点进行饱和突变,筛选出脂肪酶稳定性得到提高的突变菌株,并对其酶学性质进行测定和分析,主要有以下几个方面的内容。一、突变体文库的构建和高稳定性突变体的筛选对脂肪酶的83位点、92位点和151位点进行定点饱和突变,然后转化大肠杆菌感受态细胞。并筛选出稳定性比野生型提高的5个突变株:E83N、E83P、E83P、D92N 和 D151Y。二、多拷贝基因工程菌的构建扩展青霉脂肪酶PEL基因片段PCR扩增后,经EcoRⅠ酶切,异丙醇沉淀回收、与线性化后,并与去磷酸化的pA0815连接。转化Top10感受态细胞后,长出的转化子使用新设计的pAO-PEL引物进行菌液PCR鉴定,得到连接方向正确的单拷贝表达载体pA0815-lip.用BglII和BamHI双酶切pA0815-lip得到含5'(BglII)-AO X-lip-TT-3'(BamHI)的表达框,表达框经异丙醇沉淀回收、后与BamHI单酶切并去磷酸化的pA0815-lip连接,转化Top10感受态细胞。对长出的转化子用BglII和Ba mHI双酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定连接方向是否正确,得到正确连接的2拷贝表达载体pAO815-21ip。同理得到pA0815-3lip,pA0815-4lip表达载体。将得到的多拷贝表达载体pA0815-xlip经SalI酶线性化后,电转化毕赤酵母GS115,最后用YPOM平板鉴定得到的多拷贝基因工程菌GS-pA0815-xlip。叁、多拷贝基因工程菌的表达及酶学性质的研究将上述得到的多个突变体毕赤酵母基因工程菌分别摇瓶发酵,并对收集到的脂肪酶的酶学性质进行了比较研究。(1)在37 ℃下测定E83V、E83P、E83N、D92N、D151Y等脂肪酶突变体对pNPB的比活力。其比活力分别为野生型脂肪酶的2.1倍,0.9倍,2.6倍,3.0倍,1.2倍。(2)野生型PEL(WT)和D151Y的Tm值大约为40.7℃,E83N 的 Tm 值约为 39.2℃(比野生型 Tm值低了 1.5℃)。D92N、E83P、E83V等突变体的Tm值分别为44.6℃,45.9℃,46.3℃.(分别比野生型Tm值提高了 3.9 ℃,5.2 ℃,5.6 ℃)。(3)用 10%乙醇处理 24h 后,E83N、D151Y 和 WT残留酶活分别为22.9%,36.3%和34.2%,而E83P残留酶活有70%(明显高于野生型),E83V和D92N残余的酶活也比野生型高。(4)在40 ℃条件处理下,WT的半衰期(T1/2)约为1h,而突变体E83N、E83P、E83V、D92N、D151Y的半衰期分别约为0.9h,2.0h,2.8h,2.0h,1.1h.分别是WT的0.9倍,2.0倍,2.8倍,2.0倍,1.1倍。(5)在10%不同有机溶剂处理24h下,五种突变体表现出不同的耐受性。经过甲醇处理后,WT相对残余酶活为24%,而E83V、D92N和D151Y相对残余酶活分别为56%,45%,43%(较WT有较大提高)。经过乙醇处理后,WT相对残余酶活只有31%,而E83P、E83V和D92N相对残余活分别为66%,71%,82%(较WT有明显提高)。经过二甲基亚砜处理后,WT和E83N相对残余酶活都为43%,E83V、D151Y相对残余酶活分别为62%,55%(较WT有较小幅度提高),E83P和D92N较WT反而下降。经过丙酮处理后,WT、E83N和E83P相对残余酶活都为33%左右,而E83V、D92N和D151Y相对残余酶活分别为61%,54%,62%(较WT有较大提高)。经过乙腈处理后,WT的相对残余酶活为32%,E83P、D92N较WT相对残余酶活反而下降,而E83N、E83V和D151Y有较小幅度提高。(本文来源于《福建师范大学》期刊2017-06-01）
晏君哲[3]（2016）在《扩展青霉脂肪酶oxyanion hole的重塑》一文中研究指出为了探究氧阴离子洞对扩展青霉脂肪酶催化活性的影响,本论文利用同源置换手段和定点饱和突变技术对扩展青霉脂肪酶氧阴离子洞可能的构成位点进行改造,并对脂肪酶突变体的催化活性进行了测定分析,主要内容包括以下两个方面:一、氧阴离子洞构成位点的同源置换和脂肪酶突变体的性质研究通过十几种同源性较高的微生物脂肪酶序列的比对,确定对131和133位点进行同源置换,共有5种置换方案。在大肠杆菌表达系统中表达脂肪酶突变体,对脂肪酶突变体进行催化活性测定,结果显示:脂肪酶突变体对叁丁酸甘油酯的催化活性下降,但L 133 A/H 131 E、L 133 A两种突变对R-扁桃酸乙酯较野生型高的活性,而且表现出一定的对映体选择性。二、氧阴离子洞构成位点的定点饱和突变和突变体的性质研究对扩展青霉脂肪酶131和133位点进行定点饱和突变,构建突变文库,在大肠杆菌表达系统中表达。根据同源置换的结果,选用扁桃酸甲酯作为底物对突变文库进行筛选,最终得到6株对扁桃酸甲酯催化活性高于野生型的突变株,分别是:H 131 Y;H 131N;L133M;L133A;H131L/L133V;H 131 I/L133N。结果显示:改变氧阴离子洞的构成位点,可以明显改变脂肪酶的底物特异性。(本文来源于《福建师范大学》期刊2016-06-05）
张文煌[4]（2016）在《扩展青霉脂肪酶的静电网络影响酶的性质》一文中研究指出为了探究扩展青霉脂肪酶(PEL)静电网络对其自身催化特性的影响,本文利用定点突变技术,对PEL特定位点的氨基酸残基进行变换,并测定分析了脂肪酶突变体的酶学性质,主要内容包括:一、选点选取扩展青霉脂肪酶基因的16个位点:Asp44、Asp70、Asp74、Asp76、Glu83、Glul13、Glu127、Glu207、Arg63、Arg97、Arg101、Arg182、Lys16、Lys202、Lys219和Lys226。这16个位点,其中8个位点编码的氨基酸带负电荷(Asp和Glu),另外8个位点带正电荷(Arg和Lys),是PEL静电网络的重要组成部分。此外,所选的这16个位点都比较靠近PEL的盖子结构(67-75)或者活性中心(132Ser-241His-188Asp)。二、构建重组质粒PET-47b(+)-PEL-X(突变型)并预筛为了探究上述16个位点对PEL自身催化特性的影响,我们利用定点突变技术,逆转了其带电性质:将带负电荷的位点突变成带正电荷的Lys,将带正电荷的位点突变成带负电荷的Asp。成功构建突变体后,我们在E.coli.BL21(DE3)表达了脂肪酶突变体,结果表明,7个脂肪酶突变体表现了不同程度的活力,它们是Asp44Lys、Asp76Lys、Glu83Lys、Arg97Asp、Argl0lAsp、Lys202Asp 和 Lys219Asp,其余 9个脂肪酶突变体在叁丁酸甘油酯鉴定板上几乎没有活力。随后,我们再次利用定点突变技术,对这9个没有活力的位点进行同性置换,即Asp(?)Glu或者Arg(?)Lys,在叁丁酸甘油酯鉴定板上又获得了 3个有活力的脂肪酶突变体,即Lys16Arg、Glu113Asp和Lys226Arg。至此,总共获得10个有活力的脂肪酶突变体。叁、有活力的脂肪酶突变体的真核表达及酶学性质探究将预筛获得的10个有活力的脂肪酶突变体,利用同样的定点突变技术构建相应的重组质粒pPIC3.5K-PEL-X(突变型),电转至毕赤酵母GS115,筛选获得其中5个突变体的高拷贝菌株。然后通过发酵获得较纯的酶液,测定分析各个脂肪酶突变体的酶学性质,结果如下:(1)Asp44Lys脂肪酶突变体Asp44Lys的表达量为0.06 mg/mL,只有野生型的30%;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为96 U/mg,是野生型的2.67倍;最适作用温度为32℃;最适作用pH为8.0,与野生型一样;不同pH处理后,在pH7.0达到最稳定状态;偏好短链的底物分子;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别是0%,29%和58%(野生型的分别为1%,32%和26%)。与野生型相比,其对乙醇有较好的耐受性。(2)Glu83Lys脂肪酶突变体Glu83Lys的表达量为0.11 mg/mL,只有野生型的55%;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为2928 U/mg,是野生型的81.33倍;最适作用温度为32℃;45℃处理10 min后的相对残余活力39%,是野生型的13倍;最适作用pH为8.0;耐受pH5.0-11.0,不同pH处理后,相对残余活力均保持70%以上,在对照中处于最稳定状态;嗜好长链的底物,对4-硝基苯基月桂酸酯(C12)和4-硝基苯基棕榈酸酯(C16)都有较好的活力;经乙腈处理后基本失活;经丙酮和乙醇处理和后,相对残余活力分别是对照的5.42倍和3.94倍,对二者的耐受性极好。(3)Arg97Asp脂肪酶突变体Arg97Asp的表达量为0.09 mg/mL,只有野生型的45%;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为63 U/mg,是野生型的1.75倍;最适作用温度为32℃;最适作用pH为7.0;不同pH处理后,在pH7.0达到最稳定状态;偏好短链的底物分子;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别为0%,67%和33%,对丙酮的耐受性较好。(4)Arg101Asp脂肪酶突变体Arg101Asp的表达量为0.24 mg/mL是野生型的1.2倍。对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为27U/mg,只有野生型的75%;最适作用温度为36℃;最适作用pH为7.0;不同pH处理后,在pH7.0达到最稳定状态;偏好短链的底物分子;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别为40%,60%和20%,对丙酮的耐受性较好。(5)Lys226Arg脂肪酶突变体Lys226Arg的表达量为0.32 mg/mL是野生型的1.6倍;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为21 U/mg,只有野生型的58.33%;最适作用温度为32℃;最适作用pH为8.0,与野生型一样;可以耐受pH5.0-11.0,在对照中处于最稳定的状态;偏好短链的底物,对4-硝基苯基月桂酸酯(C12)也略有偏爱;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别为6%,21%和31%,对乙醇的耐受性较好。(本文来源于《福建师范大学》期刊2016-06-05）
张会会[5]（2015）在《扩展青霉脂肪酶的定向进化及其稳定性的提高》一文中研究指出天然扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase, PEL)的催化特性有其自身的特色,但其在热稳定性、有机溶剂耐受性等方面,还不能很好地满足实际应用的需求。本文利用定点饱和突变技术对PEL的特定位点进行改造,筛选得到PEL突变体,借助毕赤酵母表达系统进行表达,并对其酶学性质进一步分析与鉴定,旨在提高酶的热稳定性和有机溶剂耐受性,为其进一步应用提供更好的酶源。具体研究内容和主要结果如下：1、突变体库建立和高活性突变株筛选设计简并引物,对扩展青霉脂肪酶的92位点进行定点饱和突变,PCR扩增后在原核表达系统中表达,并用叁丁酸甘油酯乳化液平板筛选突变株,初步得到1株稳定性高高于野生型脂肪酶的突变株：D92E。同时,根据筛选的结果和半理性设计的方法,设计了叁个定点突变实验,得到叁个突变株：T66E、N73Q和D151E。2、突变体的表达及其酶学性质分析将筛选得到的脂肪酶突变体连接到表达载体pPIC3.5k上,得到四个重组质粒pPIC3.5k-PEL-D92E、pPIC3.5k-PEL-T66E、pPIC3.5k-PEL-N73Q和pPIC3.5k-PEL-D151E。用Sal线性化这四个重组质粒,并电转至毕赤酵母GS5,甲醇诱导表达。然后对其热稳定性及有机溶剂稳定性进行了分析与鉴定。主要结果如下：(1)与野生型脂肪酶相比,突变体D92E热稳定性得到较明显的提高,在50℃处理10min后,野生型脂肪酶的残余酶活只有31.72%,而突变体D92E脂肪酶的残余酶活为70.28%；突变体D151E比野生型脂肪酶的热稳定性稍有提高,提高不明显；突变体T66E和N73Q比野生型脂肪酶的热稳定性均下降明显。(2)突变体D92E和D151E比野生型脂肪酶的乙醇耐受性均有所提高,加入乙醇37℃孵育10 min后,突变体D92E脂肪酶的残余酶活为88.32%,突变体D151E脂肪酶的残余酶活为95.47%,野生型脂肪酶的残余酶活为62.06%；突变体T66E和N73Q比野生型脂肪酶的乙醇耐受性均下降明显。(本文来源于《福建师范大学》期刊2015-06-01）
朱心强,周琼,唐良华[6]（2014）在《扩展青霉TS414脂肪酶的克隆与原核表达》一文中研究指出提取了扩展青霉Penicillium expansumTS414菌体的总RNA,并以反转录得到的cDNA为模板,成功扩增得到了脂肪酶基因;在此基础上,构建了重组表达载体pGEX-4T-1-PEL,并在大肠杆菌DH5α中实现了扩展青霉脂肪酶的表达;进一步采用低IPTG诱导浓度、低温、长时间的发酵策略等,使扩展青霉脂肪酶得以有活性的表达;同时,通过反复冻融细胞破碎法使其较好地从菌体细胞中分离出来,提取得到的酶液的活力达到0.49 U/mL。以上结果为后续脂肪酶分子进化等研究奠定了坚实的基础,亦可转化为高校或中学生物学实验教学的项目。(本文来源于《实验室科学》期刊2014年04期）
刘骏[7]（2014）在《扩展青霉脂肪酶及其固定化在碳酸酯衍生化反应中的应用》一文中研究指出自第一次工业革命以来,为了满足人们不断增长的需求,越来越多的催化剂被设计出来并运用于催化反应,从而生产出具有不同功能和用途的高附加值产品。然而,催化剂的运用在提高生产效率的同时也导致了越来越多的环保问题,尤其是含有重金属元素的催化剂。如今,随着全民环境保护意识的增强,减少和消除催化剂设计金属成分的不良影响成为较为紧迫的的任务。为了实现“绿色”催化这个目标的重要策略之一就是生物酶催化剂的使用。相比于传统的化学催化剂,生物酶催化剂本身的特点具有很多优势。首先,生物酶具有很高的催化效率；而且生物酶催化的反应一般反应条件温和,对反应温度、压力以及pH环境要求不高,尤其是对于那些在传统化学催化剂下只能在极端的反应条件下才能进行的反应。“环境友好”的生物酶已被广泛应用于各种有机合成反应中来,如：酯交换反应、水解、酯化、酰胺化、聚酯的合成,氧化还原反应,甲基等基团的转移反应。在本文中,将酶促反应的范围进一步扩展,分别为：催化碳酸乙烯酯(EC)与甲醇合成碳酸二甲酯(DMC)以及催化碳酸乙烯酯(EC)与正丁胺合成1,3-二取代脲。生物酶催化剂相对昂贵的价格促使人们开始关注其回收利用性,从而使酶促反应更具工业应用价值。然而,优良的回收利用需要优越的稳定性做保障。因此,通过生物酶的固定化来提高其稳定是一个合适、有效的方法。然而,虽然目前有数量众多的酶固定化方法,但是探索能够提高酶稳定性的方法依然是一个令人兴奋的研究目标。作为工业催化剂,理想的固定化过程应该能够尽量减少有毒或对环境有害的有机试剂的使用,并且过程非常简单且能够提高生物酶活性,更重要的是提高催化剂的分离效率。我们的研究兴趣主要集中在固定化载体(包括磁性载体)的合成及其在DMC与1,3-二取代脲的合成中的应用研究,本论文可分为六个部分：第一章：综述了游离酶与固定化酶的概念、起源、性质以及发展情况。系统分析了不同的固定化酶方法,尤其是针对磁性载体。第二章：首次将生物酶催化剂引入到碳酸乙烯酯与甲醇酯交换合成碳酸二甲酯的反应中来。即使是在低温和常压条件下,扩展青霉脂肪酶(PEL)催化碳酸乙烯酯与甲醇的酯交换反应中也表现出了良好的催化活性。通过对反应条件的优化,当反应温度为60℃,反应时间为96h,加入的PEL为4.45%(与EC的重量比),EC／甲醇的摩尔比为1：16时,EC的转化率达到90%,DMC的产率也能够达到87%。第叁章：将扩展青霉脂肪酶通过包埋法固定在了天然高分子材料中。选择羧甲基纤维素与聚乙烯醇的复合载体来固定扩展青霉脂肪酶。相比于游离脂肪酶催化碳酸乙烯酯与甲醇的酯交换反应,固定化酶表现出更高的催化效率与催化活性,反应时间缩短至48h,EC的转化率提高到94%,DMC产率提高到93%,DMC的选择性提高到99%；而且,固定化酶显着提高了酶的稳定性及重复利用性。第四章：采用室温下溶胶-凝胶转相法制备出了纤维素微球,利用原位合成法在纤维素微球上合成了Fe304纳米粒子从而制备得到磁性纤维素微球,通过加入环氧氯丙烷对磁性纤维素微球进行活化,成功的将扩展青霉脂肪酶负载于磁性纤维素微球上。磁性纤维素微球的多孔结构以及载体与酶分子间的多共价键结合,使固定化酶的稳定性得到了显着提高并且在催化碳酸乙烯酯与甲醇的酯交换反应中表现出了很好的催化活性。反应结束后,在外来磁场的作用下,催化剂极易分离。第五章：创造性的将氨基-环氧基复合功能基团应用到磁性纳米颗粒负载酶,极大地提高了载体吸附酶的速度；并且所合成载体的中空结构以及表面丰富的环氧基团都极大的提高了固载酶的稳定性,制备得到的固定化酶作为催化剂催化碳酸乙烯酯与正丁胺反应合成1,3-二取代脲的反应,取得了优良的催化效果,而针对该反应,之前很少有生物酶作为催化剂的报道；反应完成后,催化剂在外加磁性的作用下极易分离,并且在重复利用十次后依然保持其最初活性的94.8%。第六章：通过硫酸处理法制备纤维素纳米晶体,利用原位合成法在纤维素纳米晶体上合成了Fe304纳米粒子从而制备磁性纤维素微球。然后,通过环氧氯丙烷对该磁性纤维素微球进行功能化,使微球具备大量的功能化基团(环氧基),通过环氧基与PEL上的活化基团(羟基、氨基、羧基、硫醇基等)共价结合,从而达到固定化酶的目的。(本文来源于《武汉大学》期刊2014-04-01）
蔡少丽,邹有土,黄建忠,林琳[8]（2013）在《定点突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的改善》一文中研究指出利用重迭延伸PCR方法对扩展青霉脂肪酶基因进行体外定点突变,构建了K115R与随机突变体ep8双突变的重组质粒pAO815-ep8-K115R.将该质粒电转化到毕赤酵母GS115中进行异源表达,获得双突变体脂肪酶PEL-ep8-K115R-GS.与野生型脂肪酶PEL-GS和随机突变体脂肪酶PEL-ep8-GS进行比较,发现双突变体脂肪酶PEL-ep8-K115R-GS在40℃温浴30 min后残余酶活为89%,比野生型脂肪酶PEL-GS和随机突变体脂肪酶PEL-ep8-GS分别提高54%和27%;双突变体脂肪酶PEL-ep8-K115R-GS的Tm值为42.2℃,比野生型脂肪酶PEL-GS提高3.5℃,比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS提高2.0℃.研究结果表明对扩展青霉脂肪酶的分子改造能提高其热稳定性.(本文来源于《应用与环境生物学报》期刊2013年01期）
孙肖明,吴涵,卜秀娟,韩颖,张浩东[9]（2012）在《重组毕赤酵母发酵生产扩展青霉碱性脂肪酶的优化》一文中研究指出通过毕赤酵母工程菌表达碱性脂肪酶,对表达条件进行了优化。先进行单因素实验,筛选出对碱性脂肪酶表达影响较大的4个因素:诱导时间、初始pH、甲醇添加量和接种量;在单因素实验的基础上设计四元线性回归实验,利用SPSS18数据处理软件进行数据优化,结果表明,诱导时间为96h、初始pH为6.0、甲醇添加量为0.5%、接种量为150mL时有最佳的表达效果,碱性脂肪酶活力为242.7U/mL。(本文来源于《食品科技》期刊2012年11期）
王慧玲,赵燕,李建科[10]（2012）在《戊二醛交联法固定扩展青霉脂肪酶的研究》一文中研究指出以海藻酸钠为载体,戊二醛为交联剂,采用交联吸附法固定扩展青霉脂肪酶。通过单因素试验和正交试验考察固定化主要因素对固定化酶活力的影响,优化固定化条件。结果表明,海藻酸钠浓度为3%、氯化钙为1%、戊二醛浓度为2.5%的条件下,酶浓度为0.03g/mL,pH为10.0,固定温度为40℃,固定时间为30min,该条件下固定化酶活最高为22895u/g,酶活回收率达到67.57%。在有机体系中,固定化脂肪酶的酯化能力明显高于游离态脂肪酶。在重复利用9次后,固定化脂肪酶的酶活降为初始状态的50%。(本文来源于《食品科技》期刊2012年06期）
扩展青霉脂肪酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为了提高扩展青霉脂肪酶的稳定性,本研究采用了定点饱和突变的方法对影响酶稳定性的关键位点进行饱和突变,筛选出脂肪酶稳定性得到提高的突变菌株,并对其酶学性质进行测定和分析,主要有以下几个方面的内容。一、突变体文库的构建和高稳定性突变体的筛选对脂肪酶的83位点、92位点和151位点进行定点饱和突变,然后转化大肠杆菌感受态细胞。并筛选出稳定性比野生型提高的5个突变株:E83N、E83P、E83P、D92N 和 D151Y。二、多拷贝基因工程菌的构建扩展青霉脂肪酶PEL基因片段PCR扩增后,经EcoRⅠ酶切,异丙醇沉淀回收、与线性化后,并与去磷酸化的pA0815连接。转化Top10感受态细胞后,长出的转化子使用新设计的pAO-PEL引物进行菌液PCR鉴定,得到连接方向正确的单拷贝表达载体pA0815-lip.用BglII和BamHI双酶切pA0815-lip得到含5'(BglII)-AO X-lip-TT-3'(BamHI)的表达框,表达框经异丙醇沉淀回收、后与BamHI单酶切并去磷酸化的pA0815-lip连接,转化Top10感受态细胞。对长出的转化子用BglII和Ba mHI双酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定连接方向是否正确,得到正确连接的2拷贝表达载体pAO815-21ip。同理得到pA0815-3lip,pA0815-4lip表达载体。将得到的多拷贝表达载体pA0815-xlip经SalI酶线性化后,电转化毕赤酵母GS115,最后用YPOM平板鉴定得到的多拷贝基因工程菌GS-pA0815-xlip。叁、多拷贝基因工程菌的表达及酶学性质的研究将上述得到的多个突变体毕赤酵母基因工程菌分别摇瓶发酵,并对收集到的脂肪酶的酶学性质进行了比较研究。(1)在37 ℃下测定E83V、E83P、E83N、D92N、D151Y等脂肪酶突变体对pNPB的比活力。其比活力分别为野生型脂肪酶的2.1倍,0.9倍,2.6倍,3.0倍,1.2倍。(2)野生型PEL(WT)和D151Y的Tm值大约为40.7℃,E83N 的 Tm 值约为 39.2℃(比野生型 Tm值低了 1.5℃)。D92N、E83P、E83V等突变体的Tm值分别为44.6℃,45.9℃,46.3℃.(分别比野生型Tm值提高了 3.9 ℃,5.2 ℃,5.6 ℃)。(3)用 10%乙醇处理 24h 后,E83N、D151Y 和 WT残留酶活分别为22.9%,36.3%和34.2%,而E83P残留酶活有70%(明显高于野生型),E83V和D92N残余的酶活也比野生型高。(4)在40 ℃条件处理下,WT的半衰期(T1/2)约为1h,而突变体E83N、E83P、E83V、D92N、D151Y的半衰期分别约为0.9h,2.0h,2.8h,2.0h,1.1h.分别是WT的0.9倍,2.0倍,2.8倍,2.0倍,1.1倍。(5)在10%不同有机溶剂处理24h下,五种突变体表现出不同的耐受性。经过甲醇处理后,WT相对残余酶活为24%,而E83V、D92N和D151Y相对残余酶活分别为56%,45%,43%(较WT有较大提高)。经过乙醇处理后,WT相对残余酶活只有31%,而E83P、E83V和D92N相对残余活分别为66%,71%,82%(较WT有明显提高)。经过二甲基亚砜处理后,WT和E83N相对残余酶活都为43%,E83V、D151Y相对残余酶活分别为62%,55%(较WT有较小幅度提高),E83P和D92N较WT反而下降。经过丙酮处理后,WT、E83N和E83P相对残余酶活都为33%左右,而E83V、D92N和D151Y相对残余酶活分别为61%,54%,62%(较WT有较大提高)。经过乙腈处理后,WT的相对残余酶活为32%,E83P、D92N较WT相对残余酶活反而下降,而E83N、E83V和D151Y有较小幅度提高。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
扩展青霉脂肪酶论文参考文献
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