高通量单细胞分泌蛋白分析器件与方法

论文摘要

细胞作为生命体的基本单位,一直都是人们研究的热点。传统的细胞分析一般是基于大量细胞的平均化结果,会掩盖细胞间的差异,从而丢失一些关键信息。细胞间异质性是普遍存在的生物学现象,获得大量单细胞的详细数据并进行统计分析,有助于理解从免疫学到肿瘤学等多个领域内的生物学过程。蛋白是重要的生命活动执行者之一,在单细胞水平上进行蛋白分析,可以深入解析和阐明细胞对药物或其他内在、外在刺激响应异质性的机理。单细胞蛋白分析的技术挑战在于:(1)如何高效地从群体细胞中获取单细胞。实验室常用的无限稀释法或显微毛细管挑取法通量低、试剂消耗量大、成本高,难以进行高通量单细胞分析。(2)如何对痕量蛋白进行高灵敏检测。单细胞内蛋白丰度低、易降解,需要高灵敏度的方法对单细胞蛋白进行捕获的同时快速输出蛋白信号。基于以上技术挑战,本论文就单细胞高效捕获平台的建立及分泌蛋白检测展开研究,具体如下:本文在课题组已提出的基于流体力学流阻原理进行单细胞高效捕获的基础上,对微流控芯片的微通道结构设计进行了修改,并结合免疫分析技术,实现了高通量单细胞分泌蛋白的分析,进一步拓展了微流控单细胞分析平台的应用范围。本平台使用夹具进行封装,基于流阻原理实现了高效的单细胞捕获;采用泵阀结构进行流体的精确控制实现单细胞孵育单元的生成;以细胞培养气体为隔离相,并采用双层疏水化修饰、水溶液预饱和技术,确保孵育单元的稳定及细胞的存活;基于免疫亲和原理实现了分泌蛋白高特异、高灵敏的分析。综上,我们搭建了微流控单细胞分泌蛋白分析平台并实现了单细胞的高效捕获和单细胞分泌蛋白的高灵敏度分析。该方法克服了包裹单细胞的微液滴在正常孵育温度条件下无法长时间保存的问题,同时确保细胞较高的存活率,为后续分泌蛋白的检测奠定了基础。运用本平台我们实现了巨噬细胞与U87细胞的长时间孵育(4 h)和分泌蛋白的快速、高灵敏检测。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 单细胞研究

1.2 微流控技术的发展

1.2.1 基于液滴微流控的单细胞捕获方法及其运用

1.2.2 基于微孔阵列的单细胞捕获方法及其运用

1.2.3 基于流体力学单细胞捕获方法及其运用

1.3 单细胞蛋白检测技术

1.3.1 质谱单细胞蛋白检测

1.3.2 酶联免疫吸附法检测

1.4 本论文拟开展的研究内容

第二章单细胞捕获与孵育平台的搭建

2.1 引言

2.2 实验方案

2.2.1 平台概况

2.2.2 单细胞捕获原理

2.2.3 单细胞高效捕获的数值模拟

2.3 实验部分

2.3.1 实验试剂、材料

2.3.2 隔离阀层的设计与硅片模板制作

2.3.3 隔离阀层PDMS芯片的制作

2.3.4 单细胞捕获与孵育层的设计与硅片模板的制作

2.3.5 单细胞捕获与孵育层PDMS薄层的制作

2.3.6 单细胞捕获与孵育芯片制作

2.3.7 平台隔膜厚度优化

2.3.8 平台夹具

2.3.9 PDMS芯片修饰

2.3.10 平台孵育时间及隔离相选择

2.4 结果与讨论

2.4.1 孵育单元体积的计算

2.4.2 单细胞捕获效率

2.4.3 单细胞存活性验证

2.5 本章小结

第三章单细胞分泌蛋白的检测

3.1 引言

3.2 实验方案

3.3 实验部分

3.3.1 实验器材与试剂

3.3.2 捕获抗体阵列修饰芯片的设计与芯片制作

3.3.3 捕获抗体阵列修饰平台

3.3.4 捕获抗体阵列的修饰

3.3.5 巨噬细胞的分化

3.3.6 单细胞分泌蛋白分析平台的组装

3.3.7 平台的单细胞捕获

3.3.8 单细胞分泌蛋白信号输出

3.4 结果与讨论

3.4.1 捕获抗体阵列修饰均匀性验证

3.4.2 捕获抗体交叉反应验证

3.4.3 抗体标准工作曲线

3.4.4 巨噬细胞分泌蛋白分析

3.4.5 U87细胞分泌蛋白分析

3.5 本章小结

结论与展望

参考文献

作者攻读硕士期间发表论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄培烽

导师: 杨朝勇

关键词: 单细胞,分泌蛋白,微流控芯片

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q26

DOI: 10.27424/d.cnki.gxmdu.2019.000047

总页数: 93

文件大小: 8632K

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