根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解基因agnD和agnH的克隆表达及agnH基因的功能分析

论文摘要

尼古丁（1-methyl-2-[3-pyridyl-pyrrolidine]）是一种存在于茄科植物中的生物碱,也是一种有毒的杂环化合物,对人体、动物和环境危害严重。由于其化学结构稳定、不易自然降解,利用微生物降解尼古丁是效率高、成本低且对环境友好的方法。本实验室前期从湖北省襄阳市烟草种植地土壤中分离筛选了一株具有较高尼古丁降解能力的菌株,经菌种鉴定为根癌土壤杆菌,命名为SCUEC1菌株。本研究对根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解代谢途径中相关的两个基因agnD和agnH进行克隆表达,并对agnH基因的生物学功能及其酶学特性进行研究。本论文的主要研究结果如下:（1）以根癌土壤杆菌SCUEC1菌株的总DNA为模板,通过PCR扩增获得agnD基因和agnH基因的DNA片段,经序列测定可知agnD和agnH基因全长分别为1176和585 bp。通过氨基酸序列分析,预测AgnD蛋白是亲水性非分泌蛋白,具有6-羟基-3-琥珀酰基吡啶氧化酶的功能;预测AgnH蛋白是疏水性非分泌蛋白,具有马来酸顺反异构酶的功能。（2）将agnD基因和agnH基因分别与质粒pET28a（+）连接,构建重组质粒pET28a（+）-agnD和pET28a（+）-agnH,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株进行异源表达,研究不同的浓度IPTG、诱导温度和诱导时间对重组蛋白AgnD和AgnH表达量的影响,SDS-PAGE检测结果表明:AgnD蛋白的大小为44.0 kDa,AgnH蛋白的大小为28.0 kDa,与预测结果一致;AgnD和AgnH蛋白表达的较适IPTG浓度为0.4 mmol/L;AgnD和AgnH蛋白表达较适温度为25℃;AgnD和AgnH蛋白表达较适时间为25 h;对重组蛋白AgnD和AgnH进行可溶性分析,并纯化AgnH蛋白,SDS-PAGE检测结果表明:AgnD和AgnH蛋白大部分分布在沉淀中;在250 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱下,得到浓度较高的较纯的AgnH蛋白。（3）马来酸和富马酸在210 nm处有特异吸收峰,采用高效液相色谱法检测马来酸标准品的保留时间为3.98 min,富马酸标准品的保留时间为5.46 min。以马来酸为反应底物,进行AgnH蛋白体外酶促反应,采用高效液相色谱法对不同酶促反应时间的产物进行检测分析,检测结果表明:酶促反应时间为0 min时,马来酸峰面积为9048.85 mAU·s,富马酸峰面积为0 mAU·s;酶促反应进行30 min时,马来酸峰面积减少到3256.05 mAU·s,富马酸峰面积增加到4771.82 mAU·s。在AgnH蛋白的催化下,随反应时间的增加,马来酸峰面积逐渐减少,富马酸峰面积逐渐增多,表明AgnH蛋白具有马来酸顺反异构酶活性。（4）以马来酸为底物,探究不同温度、pH和金属离子对AgnH蛋白酶反应的影响,并探究AgnH蛋白的热稳定性,采用高效液相色谱法对反应产物进行检测分析。结果表明:AgnH蛋白较适反应温度为37℃;AgnH蛋白较适的反应pH值为8.0;Mg2+对AgnH蛋白酶活有促进作用,Ca2+、Zn2+、Fe2+、Li+、Mn2+、Cu2+、Ni2+对AgnH蛋白酶活有抑制作用,其中Cu2+对AgnH蛋白酶活抑制作用较明显;AgnH蛋白在0℃水浴120 min后酶活力无明显影响,在55、65℃水浴120 min后,其相对酶活分别逐渐降低到24.79%和8.53%。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 姚家成

导师: 李晓华

关键词: 根癌土壤杆菌,基因,基因克隆与表达,功能分析

来源: 中南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,环境科学与资源利用

单位: 中南民族大学

分类号: X172;Q78

总页数: 88

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