博落回中血根碱和白屈菜红碱生物合成基因挖掘及功能解析

论文摘要

博落回是罂粟科博落回属的多年生草本植物,作为一种传统的抗菌药物其用法在唐代早期的《本草拾遗》中有详细记载。博落回中含有苄基异喹啉类生物碱（Benzylisoquinoline alkaloids,BIAs）血根碱（sanguinarine,SAN）和白屈菜红碱（chelerythrine,CHE）具有抗炎、调控肠道菌群和促进动物生长的作用,且不含吗啡、可待因等成瘾性的BIAs。因此,M cordata已成为饲用抗生素的良好替代品在全世界许多国家的养殖业中广泛使用。随着越来越多的国家限用和禁用饲用抗生素,对博落回的市场需求将呈爆发式增长,致使野生资源蕴藏量急剧减少。通过分子育种提高博落回中SAN和CHE含量以及利用代谢工程技术在工业微生物中异源生产SAN和CHE具有极大的意义,但是前提是找到博落回中SAN和CHE的合成基因。SAN和CHE属于苄基异喹啉生物碱,其合成途径复杂,涉及众多合成基因的参与。本研究通过对博落回进行全基因组测序,并结合转录组测序与SAN与CHE代谢轮廓数据挖掘参与合成的功能基因,再将候选基因在酿酒酵母中进行异源表达和前体饲喂最终确定候选基因功能,主要结果如下。1.本研究完成了博落回全基因组测序,这也是罂粟科植物中首个完成全基因组测序的物种。通过19-Kmer分析表明博落回基因组大小为540.5Mb,杂合率为0.92%,预测22,328个蛋白质编码基因。将博落回全基因组数据与大红罂粟、日本黄连、加州罂粟和鸦片罂粟中SAN和CHE合成基因进行同源比对筛选到39个候选基因,再根据不同部位转录组、代谢组数据,推导出博落回中SAN和CHE的合成可能具有组织器官特异性,即SAN和CHE的前体物质原阿片碱（PRO）和别隐品碱（ALL）在根中合成,而SAN和CHE在果荚中合成。根据该规律从39个候选基因中筛选到16个基因。包括6个甲基转移酶基因,4个黄素蛋白氧化酶基因和6个细胞色素P450酶基因以及1个细胞色素P450还原酶基因。所有候选基因被转入酿酒酵母中进行异源表达验证,最终解析了从norcoclaurine至SAN和CHE合成中的14步合成路径的基因。其中Mco2833基因负责催化从norcoclaurine到SAN和CHE合成的第1步,将norcoclaurine甲基化生成coclaurine;2个甲基转移酶基因Mco8567和Mco769催化第2步;细胞色素P450氧化酶基因Mco2661在第3步催化N-methylcoclaurine的3’-羟基化形成3’-hydroxy-N-methylcoclaurine;Mco2833基因还能在第4步将甲基转移至3’-hydroxy-N-methylcoclaurine 的 4’-羟基形成 reticuline;第 5 步由黄素蛋白氧化酶基因 Mco20113 催化reticuline形成scoulerine;之后往SAN合成分支的第1步由细胞色素P450氧化酶基因Mco217完成;第2步反应中催化scoulerine生成cheilanthifoline的基因未能找到;第3步由2个甲基转移酶基因Mco830和Mco830催化stylopine转化成N-methylstylopine;第4步催化N-methylstylopine生成protopine的基因未能找到;2个细胞色素P450氧化酶基因Mcol 1229和Mcol 1218都能完成第5步反应中催化PRO生成6’-羟基原阿片碱并经过自发反应生成二氢血根碱（DHSAN）;最后有2个黄素蛋白氧化酶基因Mco6407和Mco6408均能催化DHSAN生成SAN;而从scoulerine往CHE合成的第1步由甲基转移酶基因Mco9487完成;第2步反应催化tetrahydrocolumbamine生成canadine的细胞色素P450氧化酶基因是Mco9485;第3步反应也是由2个甲基转移酶基因Mco830和Mco830完成;第4步反应的基因未找到;Mco11229和Mco11218都能完成第5步催化别隐品碱生成6’-羟基别隐品碱并经过自发反应生成二氢白屈菜红碱（DHCHE）的反应;Mco6407和Mco64082个基因在最后1步均能催化DHCHE生成CHE。2.本研究首次证实Battersby提出的SAN和CHE重要合成中间体reticuline合成路径的正确性,即 Mco2833 催化 norlaudanosoline 生成 6’-O-methylnorlaudanosoline 后再催化该化合物生成norreticuline,然后两个基因Mco769和Mco8567都能催化norreticuline生成reticuline。该路径被证实后为高等植物中reticuline的生物合成提供了新的解释,并且为SAN和CHE合成通路重编辑改造提供了新路线。3.本研究发现博落回中的甲基转移酶Mco2833在SAN和CHE合成途径中参与了4 步反应,催化 norlaudanosoline、6’-O-methylnorlaudanosoline、norcoclaurine 和 3’-hydroxy-N-methylcoclaurine 这 4 个不同的底物分别生成 6’-O-methylnorlaudanosoline、norreticuline、coclaurine和reticuline。。该成果为在工业微生物体内构建高效合成SAN和CHE路径提供基因。4.本研究探索了博落回中可能存在的N-methylstylopine合成旁路,发现Mco830和Mco833基因均能接受scoulerine和cheilanthifoline作为甲基化的底物分别生成N-methylscoulerin 和 N-methylcheilanthifoline,而 Mco217 不能催化 N-methylscoulerin 生成 N-methylcheilanthifoline,罂粟中的 PsSPS 基因也不能催化 N-methylcheilanthifoline生成N-methylstylopine。该成果找到了博落回中Mco830和Mco833的新催化底物并且为SAN和CHE的中间化合物的合成提供新思路和新证据。本论文的发现不仅有利于未来的博落回分子辅助育种,并且为未来利用代谢工程技术通过工业微生物实现SAN和CHE的工业化生产奠定了研究基础。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第1章绪论

1.1 概述

1.2 节基异喹琳类生物碱

1.3 博落回资源的开发与应用

1.3.1 在动物健康领域的应用

1.3.2 在人类健康领域的应用

1.4 SAN和CHE的促生长机制研究

1.5 SAN和CHE的生物合成研究

1.5.1 SAN和CHE的合成机制研究

1.5.2 SAN和CHE的生物合成基因

1.5.3 SAN和CHE的调控机制研究

1.6 血根碱的合成生物学研究进展

1.6.1 微生物代谢工程

1.6.2 植物代谢工程

1.7 研究意义与内容

第2章博落回全基因组、转录组测序及SAN与CHE生物合成基因筛选

引言

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 试剂和溶液配制

2.2 方法

2.2.1 博落回核型分析

2.2.2 博落回全基因组DNA提取

2.2.3 博落回全基因组测序策略

2.2.4 Survey分析

2.2.5 基因组组装

2.2.6 候选基因比对序列信息的获得

2.2.7 博落回转录组取材与总RNA提取

2.2.8 转录组测序和制作候选基因热图

2.2.9 生物信息学分析

2.3 实验结果

2.3.1 博落回核型分析

2.3.2 博落回全基因组和转录组测序

2.3.3 博落回不同组织中代谢轮廓分析

2.3.4 生物信息学分析

2.4 总结与讨论

第3章 SAN与CHE生物合成中的甲基转移酶基因验证

引言

3.1 材料

3.1.1 实验菌株与载体

3.1.2 PCR引物设计

3.1.3 培养基配制

3.1.4 试剂和溶液配制

3.1.5 酵母前体饲喂实验中的中间体化合物

3.2 方法

3.2.1 博落回总RNA的提取与反转录为cDNA

3.2.2 提取载体质粒

3.2.3 Qubit? 2.0 Fluorometer测定含量

3.2.4 目的基因扩增

3.2.5 目的片段胶回收和测序验证

3.2.6 制备线性载体

3.2.7 线性载体胶回收

3.2.8 酵母表达载体构建

3.2.9 大肠杆菌转化

3.2.10 菌落PCR

3.2.11 酿酒酵母转化

3.2.12 前体饲喂酿酒酵母进行基因功能验证

3.2.13 LC-Q/TOFMS分析生物碱

3.2.14 数据分析

3.2.15 荧光定量PCR

3.3 实验结果

3.3.1 基因的扩增

3.3.2 重组基因的菌落PCR鉴定与测序

3.3.3 酿酒酵母转化

3.3.4 样品中生物碱的LC-MS检测分析结果

3.3.5 荧光定量PCR分析

3.4 小结与讨论

第4章酿酒酵母异源表达验证参与SAN与CHE生物合成基因中的P450酶基因

引言

4.1 材料

4.1.1 实验菌株与载体

4.1.2 PCR引物设计

4.1.3 培养基

4.1.4 主要使用试剂

4.1.5 酵母前体饲喂实验中的中间体化合物

4.2 方法

4.2.1 博落回总RNA的提取与反转录为cDNA

4.2.2 提取载体质粒

4.2.3 目的基因克隆

4.2.4 目的片段胶回收和测序验证

4.2.5 制备线性载体

4.2.6 酵母表达载体构建

4.2.7 大肠杆菌转化与菌落PCR

4.2.8 酿酒酵母转化

4.2.9 前体饲喂酿酒酵母进行基因功能验证

4.2.10 LC-Q/TOFMS分析生物碱

4.2.11 荧光定量PCR

4.3 实验结果

4.3.1 基因的扩增

4.3.2 重组基因的菌落PCR鉴定与测序

4.3.3 酿酒酵母转化

4.3.4 样品中生物碱的LC-MS检测分析结果

4.3.5 荧光量PCR分析

4.4 小结与讨论

第5章酿酒酵母异源表达验证参与SAN与CHE生物合成基因中的黄素蛋白氧化酶

引言

5.1 材料

5.1.1 实验菌株与载体

5.1.2 PCR引物设计

5.1.3 培养基

5.1.4 主要使用试剂与仪器

5.1.5 酵母前体饲喂实验中的中间体化合物

5.2 方法

5.2.1 博落回总RNA的提取与反转录为cDNA

5.2.2 提取载体质粒

5.2.3 目的基因克隆

5.2.4 目的片段胶回收和测序验证

5.2.5 制备线性载体

5.2.6 酵母表达载体构建

5.2.7 大肠杆菌转化与菌落PCR

5.2.8 酿酒酵母转化

5.2.9 前体饲喂酿酒酵母进行基因功能验证

5.2.10 LC-Q/TOFMS分析生物碱

5.2.11 荧光定量PCR

5.3 实验结果

5.3.1 基因的扩增

5.3.2 重组基因的菌落PCR鉴定与测序

5.3.3 酿酒酵母转化

5.3.4 样品中生物碱的LC-MS检测分析结果

5.3.5 荧光定量PCR分析

5.4 小结与讨论

第6章博落回中网脉番荔枝碱的合成旁路验证

引言

6.1 材料

6.1.1 实验菌株与载体

6.1.2 PCR引物设计

6.1.3 培养基

6.1.4 主要使用试剂与仪器

6.1.5 酵母前体饲喂实验中的中间体化合物

6.2 方法

6.2.1 博落回总RNA的提取与反转录为cDNA

6.2.2 提取载体质粒

6.2.3 目的基因克隆

6.2.4 目的片段胶回收和测序验证

6.2.5 制备线性载体

6.2.6 酵母表达载体构建

6.2.7 大肠杆菌转化与菌落PCR

6.2.8 酿酒酵母转化

6.2.9 前体饲喂酿酒酵母进行基因功能验证

6.2.10 LC-Q/TOFMS分析生物碱

6.3 实验结果

6.4 小结与讨论

第7章博落回中N-甲基刺罂粟碱的合成旁路

前言

7.1 材料

7.1.1 实验菌株与载体

7.1.2 PCR引物设计

7.1.3 培养基

7.1.4 主要使用试剂与仪器

7.1.5 酵母前体饲喂实验中的中间体化合物

7.2 方法

7.2.1 博落回总RNA的提取与反转录为cDNA

7.2.2 提取载体质粒

7.2.3 目的基因克隆

7.2.4 目的片段胶回收和测序验证

7.2.5 制备线性载体

7.2.6 酵母表达载体构建

7.2.7 大肠杆菌转化与菌落PCR

7.2.8 酿酒酵母转化

7.2.9 前体饲喂酿酒酵母进行基因功能验证

7.2.10 LC-Q/TOFMS分析生物碱

7.3 实验结果

7.4 小结与讨论

第8章总结与展望

8.1 全文总结

8.2 本文创新点

8.3 展望

参考文献

缩略词表

附录

1.甲基转移酶基因序列

2.细胞色素P450基因序列

3.黄素蛋白氧化酶基因序列

作者简历

博士在读期间科研成果

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 黄鹏

导师: 曾建国

关键词: 博落回,基因组学,苄基异喹啉类生物碱,功能研究

来源: 湖南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 湖南农业大学

基金: 相关科研项目基金

分类号: Q943.2;S567.239

DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000786

总页数: 151

文件大小: 16923k

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