孙淑红[1]2003年在《中国传染性法氏囊病病毒野毒株致病性的流行病学研究》文中研究说明传染性法氏囊病(IBD)是一种危害幼龄鸡的一种急性、高度接触传染性疫病，其病原传染性法氏囊病病毒(IBDV)是一种双股RNA病毒。为了弄清我国各地流行的IBDV毒力程度，在3—7周龄SPF鸡进行人工感染的致病性试验，以此比较研究了1997—2001年期间从我国不同地区分离到的31个IBDV野毒株。结果表明，这些野毒株的毒力差异甚大。致病性最强的GX8／99可在易感年龄的SPF鸡引起70-92％的死亡率，是典型的超强毒。而人工接种YN2／99株的SPF鸡的死亡率几乎为零。其余毒株对SPF鸡的致死率则介于6—77％之间，但是所有毒株都能造成法氏囊和胸腺的显着萎缩。对具有不同致死率毒株的比较表明，近几年中，我国多数IBDV流行毒株的毒力都已远远超过标准毒IBDV，而接近超强毒。选择致病性最强的来自广西的GX8／99株，在对法氏囊悬液中病毒用鸡胚半数致死量(ELD_(50))定量测定后，在不同年龄的SPF鸡和商品代蛋用型坞多次重复地比较研究了该毒株的致病性。随鸡的日龄和接种剂量的不同，其致死率也有很大差异。对28-30日龄SPF鸡，病毒接种量为200个ELD_(50)时，感染后7日内死亡率最高可达60-90.5％(18／30和19／21)，感染量为20个ELD_(50)时死亡率亦可达53-92％(8／15和23／25)。以500个ELD_(50)感染28-104日龄期间SPF鸡，死亡率均在55.1％-67.2％。直至113-120日龄时，感染后仍有10-15％致死率。但在128日龄接种时，既不引起死亡也不表现任何症状，但都产生了抗IBDV抗体。人工种发病死亡鸡法氏囊出血程度随感染量和年龄而异。50日龄鸡接种2000个ELD_(50)后死亡的鸡，100％(12／12)的法氏囊严重出血，而在40日龄感染200个ELD_(50)后死亡鸡中，仅17％(3／18)发生出血。在2、3、4周龄带有母源抗 山东农业大学硕士学位论义（2003）体的商品代蛋鸡，u 2000个ELD50病毒接种后只引起 10o（2／20）、35O （7／20）和35o（7／20）的死亡率，但在5周龄时，随着母源抗体的消失，仅接触感染的致死率就可达 61．3％（98／1 60）。而在 4和 5周龄商品代蛋鸡人工接种200个ELD50病毒后，死亡率分别是sl．6－94．3％（62／76－33／35）和 93．9－94O（31／33－47／50）。通过在 1900多羽鸡的试验表明，GX－8／99株确实是一个超强毒IBDV毒株，表现为高死亡率（最高可达94％），易感年龄延长至4月龄，中枢性免疫器官法氏囊出血严重和胸腺明显萎缩。此外，GX－8／99株在 SPF鸡胚上增殖 2代的鸡胚毒（GX－8／99／HZ），每 0．lml含 ELD。。可达 10b，对鸡胚的致死率大大提高，但对 SPF鸡的致病力较囊毒显着降低。 为研究病毒的核酸分子结构与其致病性的关系，本研究选取了在致死率上不同的4个IBDV野毒株，比较了它们的VPZ基因高变区共494个碱基序列。结果表明，4个毒株对SPF鸡的致病性存在较大差异（G－94％之间），但VPZ基因高变区的变异较小。SD－l／97、SD－3／98、JS－30／99相互之间及其与＿IBDV参考株HK46间均具有相当高的同源性，结果似乎说明IBDV毒株的致病性与VPZ基因高变区变异的关系不大。 在SPF鸡分别比较研究了两个中等毒力IBDV疫苗接种后对法氏囊和胸腺的影响，以及对超强毒GX－8／99攻毒后的免疫保护力。结果表明，用于试验的两个中等毒力疫苗虽然在SPF鸡可引起法氏囊和胸腺不同程度的萎缩，但确实能够 100％保护己经免疫的 SPF鸡免于该超强毒 IBDV人工感染造成的死亡。而且，还能减轻该株病毒感染后诱发的法氏囊的炎症、出血和变性。这表明，在不受母源抗体干扰条件下，中等毒力的IBDV弱毒疫苗仍能诱发对IBDV超强毒株GX－8／99的有效的免疫保护作用。 通过对 24日龄 SPF鸡人工感染传染性贫血病病毒（CAV）、36日龄 一3 我国传染。性法氏囊病病毒野每株致病性的流行病学研究SPF鸡人工感染网状内皮增生病病毒（REV）、52日龄SPF鸡分别人工感染马立克氏病病毒（MDV）、CAV、REV、MDV＋REV＋CAV后不同天数，再用传染性法氏囊病病毒（IBDV）SD－3／98株做人工攻毒。结果表明，不同日龄的 SPF鸡在感染 MDV、CAV、REV、MDV＋REV＋CAV后对 IBDV强毒攻毒抵抗力下降。主要表现为在其它毒株共感染的作用下胸腺和法氏囊的萎缩程度更为严重，而引起死亡率的差异不甚明显。 这只是对几种病毒共感染对IBDV致病性的影响进行了初步探讨。关于 IR龄肉鸡感染其它免疫抑制病毒如 REV。J－ALV、REV＋J－ALV与IBDV共感染的试验正在进行之中。并且有待于在不同年龄不同间隔做更加深入的比较研究。
崔言顺[2]2005年在《传染性法氏囊病病毒野毒株的致弱与分子机理研究》文中研究指明传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害3～6周龄雏鸡和青年鸡,除直接引起鸡死亡和生产性能下降外,还可导致感染鸡免疫抑制。IBDV属于双RNA病毒科(Birnaviridae)、禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)。IBDV是一种小的、无囊膜病毒,为双节段、双链RNA基因组,二十面体对称结构。基因组分为A节段和B节段,A节段编码VP2、VP3、VP4、VP5 4种蛋白,B节段编码VP1。VP2、VP3是病毒的主要结构蛋白,共同构成病毒的主要保护性抗原。其中VP2携带宿主保护性抗原决定簇,可以诱导产生保护性中和抗体,并且具有血清学特异性,其核苷酸和氨基酸的序列多变性与病毒特性密切相关,因此成为研究IBDV抗原性和致病性的主要目标。自20 世纪80 年代中后期,世界上先后出现了IBDV 变异株、超强毒株IBDV(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)。目前,IBDV 标准毒株、超强毒株、变异株在我国并存,给免疫防制带来了极大的困难。只有对IBDV 野毒株致病性和分子生物学特性进行测定,才能针对特定的发病情况使用特定的疫苗,做到有的放矢。雏鸡母源抗体的存在也是制定免疫程序时必须考虑的一个重要因素,免疫前,有必要对IBDV母源抗体的滴度进行准确的测定。已报道我国有多处养鸡场发生vvIBDV 感染。能否有效地将vvIBDV 致弱并且获得有较高免疫原性、无免疫抑制的弱毒株,是摆在IBDV 研究者面前的一个亟待解决的问题。vvIBDV 致弱的分子机理的研究,特别是对VP2 高变区的研究,将对vvIBDV 的发生、IBDV 毒力标记的确定、野毒株和疫苗株的有效鉴别以及加速野毒株的致弱进程等方面的研究起到极大的推动作用。针对近年来山东省的IBD 流行情况,本课题主要进行了以下研究:1.对山东省暴发IBD 的现状进行了系统地分析。从山东省几个地市发生重大IBD疫情的鸡场采集病料,根据病鸡发病的流行病学和临床症状,结合病毒分离、组织病理学观察、电镜观察、琼脂免疫扩散试验、间接荧光抗体试验等结果,确定几个鸡场的疫情均是由感染IBDV 野毒引起,分离鉴定出4 个野毒株分别命名为IBDV SD0210、SD0208、SD0110 和SD0106;进一步测定不同滴度的病毒液对3～6 周龄SPF 鸡的致病性,结果表明分离的4 个野毒株都具有很高的致病性,可以称为vvIBDV;对VP2 高变区基因的序列分析表明,4 个野毒株均具有目前所认定的超强毒株的特征。这表明近几年来山东省一些鸡场严重的IBD 疫情是由vvIBDV 的出现造成的。2.对MTT 比色法用于检测病料中IBDV 在细胞培养物中的增殖情况进行了研究,并首次将MTT 比色法用于IBDV 的分离鉴定。IBDV 野毒株在CEF 细胞中初次增殖时通常无可见细胞病变。本研究用MTT 比色法检测病料在细胞培养物中是否有IBDV 增
朱向东[3]2013年在《传染性法氏囊病病毒自然重配超强毒株的分离及其VP2和VP3基因的克隆表达》文中提出传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的以侵害雏鸡淋巴组织尤其是中枢免疫器官—法氏囊为主要特征的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害机体免疫器官,造成免疫抑制,致使疫苗免疫接种失败。2004年以来,在华东地区商品代蛋鸡场和肉鸡场发生了多起IBD疫情,在流行病学与临床症状方面表现为IBD疫苗免疫失败、发病快、死亡率高。本实验室从具有该流行病学特征的病鸡法氏囊组织中分离到了两株IBDV自然重配超强毒株,分别命名为QL和ZZ-11,并对其致病力特性、全基因组序列特征进行了研究,最后对其主要结构蛋白基因VP2和VP3进行了克隆表达,并建立了IBDV抗体间接ELISA检测方法。试验内容包括：实验一：传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离鉴定从接种过IBDV B87疫苗的发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11。用该原始病鸡法氏囊悬液连续3次人工感染SPF鸡后,再取其法氏囊制备悬液,-70℃保存。经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚,测定鸡胚的半数致死量(ELD50)。鸡的日龄和接种剂量不同,其致死率有很大差异。对23-51日龄的SPF鸡分别接种20、200、2000个ELD50剂量的QL株和ZZ-11株病毒后,1周内死亡率均在55%以上,最高可达100%;对3-7周龄SPF鸡致死率均较高,在90%左右；对13-15周龄的SPF鸡致死率也在50%左右。死亡鸡法氏囊肿大出血,呈“紫葡萄”样外观,胸肌腿肌呈条带状出血,法氏囊／体重比较正常对照显着下降。QL和ZZ-11株的VP2基因符合vvIBDV的氨基酸特征,包括222A、256I、279D、284A、294I、299S和位于326~332位七肽基序(SWSASGS)。致死率、病理变化、组织切片分析、VP2基因特征分析都说明QL和ZZ-11是超强毒株,并且具有致死率高、直接致死鸡胚等特性。实验二：传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94%和86%。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,两个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp。病毒演化分析结果显示两个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的超强毒株核苷酸序列的同源性为96.8%～98.1%和96.9%～98.4%,处在IBDV超强毒株分支上；而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%～90.4%和90.0%～90.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、2941和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777-782位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnI酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ-11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。实验叁：传染性法氏囊病病毒自然重配超强毒株VP2和VP3基因的克隆表达从IBDV自然重配超强毒株QL株的法氏囊组织中扩增出VP2和VP3结构蛋白基因,VP2具有wIBDV所特有的222A、253Q、256I、279D、284A、294I、299S和位于326～332位的七肽基序SWSASGS,并具有其它超强毒株和弱毒株都没有的127A、324R和370S氨基酸残基；VP3基因与其它超强毒株和弱毒株的核苷酸与氨基酸同源性都很高,均在97.3%以上,但也有799A、849G、931V、976D四个特异的氨基酸残基。将该VP2和VP3基因分别定向克隆入原核表达载体pET32a中,构建了原核表达质粒pET32a-VP2弄口pET32a-VP3,并转化E.coli BL21(DE3);经IPTG诱导后用SDS-PAGE分析,重组VP2融合蛋白的分子质量为67kDa,表达量约占菌体总蛋白量的30%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体中;重组VP3融合蛋白的分子质量为57kDa,表达量约占菌体总蛋白量的40%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体中；用Western blot分析,重组VP2蛋白和重组VP3蛋白均与IBDV阳性血清发生特异性的反应;以纯化的重组VP2蛋白和重组VP3蛋白为抗原建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。
梅永杰[4]2016年在《传染性法氏囊病病毒流行株的分离与检测方法的建立》文中提出传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雏鸡传染病,IBDV感染雏鸡后引起法氏囊萎缩,最终导致死亡。给世界商业化养鸡行业造成巨大损失。因此对IBD的流行病学调查及研制快速、准确的IBDV检测方法至关重要。本研究对华东区域传染性法氏囊病病毒流行株进行分离及生物学性状分析,结合单克隆抗体技术建立了IBDV双抗体夹心ELISA和胶体金试纸条检测方法,为今后IBD的综合防治提供帮助。试验一:华东区域传染性法氏囊病病毒流行株的分离及其生物学特性分析为了解华东区域近年来IBDV的遗传变异现状,从该地区近叁年来IBD疫苗免疫失败鸡群中分离到7株IBDV,命名为J3、A4、S8、S9、A11、S14和J17。7株IBDV均能直接适应于鸡胚培养,但对CEF、DF-1以及DF-EGFP-miR-9叁种细胞的适应性和细胞培养中的病毒滴度有显着差异,较易适应于DF-EGFP-miR-9细胞,A11毒株在DF-EGFP-miR-9细胞中的滴度高达1011TCID50/0.1ml。用第3代鸡胚毒分别感染6周龄SPF雏鸡,均表现出临床症状和死亡,发病率为100%,死亡率在500%～700%,而用第20代细胞毒感染的SPF雏鸡,均未出现临床症状和死亡。将7株IBDV分离毒vp2基因全长序列进行同源性分析,核苷酸和编码氨基酸序列的同源性分别为97.4%～99.6%和98.7%～99.8%。遗传进化分析,7株IBDV分离毒均属于血清Ⅰ型,分布在叁个相对独立的超强毒力IBDV(vvIBDV)分枝中,特征性氨基酸位点表现出IBDV强毒株特性。在vp2第一亲水区,J17毒株有212N,S14毒株有222L,不同于其它强毒株或弱毒株。本研究结果表明,近年来,在华东区域IBD免疫失败的鸡群中流行着超强毒力wIBDV,毒株的生物学特性有明显差异,毒株的来源比较复杂,IBD的防控面临着新挑战。试验二:分泌传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立分别用纯化的传染性法氏囊病病毒和昆虫细胞表达的重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,利用单克隆抗体技术,制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过筛选和克隆化,获得2株能稳定分泌传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4G8和2C9,抗体亚类分别为IgG2a和IgM。间接ELISA检测表明,2株单克隆抗体均只与IBDV VP2蛋白反应,而与其他4种禽类病毒及CEF细胞均无交叉反应,腹水效价分别为107和108。间接免疫荧光试验(IFA)证明,2株单抗均与传染性法氏囊病病毒细胞适应毒和重组VP2蛋白发生特异性反应;western blot分析表明,只有4G8能特异性识别传染性法氏囊病病毒和重组VP2蛋白的线性表位;病毒中和实验分析表明,单抗4G8腹水中和效价为107,单抗2C9无中和活性。试验叁:传染性法氏囊病病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立本实验以mAb-2C9为捕获抗体,以HRP-4G8为标记抗体,经过条件优化,建立检测传染性法氏囊病病毒的单克隆抗体夹心ELISA方法。特异性试验证明,单克隆抗体夹心ELISA方法与实验室保存的四种禽病毒(NDV、AIVH9N2、IBV、EDSV)、CEF细胞和正常SPF鸡组织均无交叉反应;敏感性实验表明,应用所建立的方法对传染性法氏囊病病毒细胞适应毒的最低检出量为102.8TCID50;重复性试验表明,夹心ELISA方法同一批次内及不同批次间检测相同样品的变异系数均小于10%。实验结果表明,所建立的夹心ELISA方法特异性好、敏感性高、与其他方法符合率高,可用于传染性法氏囊病的临床诊断和流行病学调查。试验四:传染性法氏囊病病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的制备用mAb-4G8作为金标记抗体,mAb-2C9作为检测抗体,根据建立的夹心ELISA方法制备传染性法氏囊病病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条。经过比较优化,确定胶体金溶液最适颗粒直径大小为20～30nm,最适pH为8.0,最适mAb-4G8工作浓度为18μg/mL,mAb-2C9最佳包被浓度为1.5mg/mL,质控抗体最佳包被浓度为1.0mg/mL。优化后的试纸条可特异性的与IBDV发生反应,敏感性实验表明,制备的胶体金可检测的最低病毒量为1039TCID50,重复性和稳定性较好,临床样品检测结果与夹心ELISA方法一致。本方法适用于传染性法氏囊病的现场检测。
朱瑞良[5]2003年在《鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株细胞克隆化毒在回鸡过程中致病性与VP2基因变异比较》文中进行了进一步梳理传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害雏鸡中枢免疫器官中的法氏囊为主要特征的传染病。1957年该病首次在美国特拉华州的甘布罗镇(Gumboro)的肉鸡群中发生。最初分离到的病毒发病率高，但致死率通常在2—5％，偶尔20—30％，这种病毒株称之为标准毒IBDV(vIBDV)。二十世纪80年代后期，美国出现了与标准毒在抗原性上有明显差异的变异株。欧洲国家首先报道了致死率高达90—100％的超强毒(vvIBDV)，90年代初传至中国及亚洲其它地区。vvIBDV感染现已遍布于全球主要养禽地区，在工业化养鸡业发达的国家尤为严重，鸡群感染vvIBDV后，除直接引起死亡外，还可使雏鸡产生免疫抑制，导致机体的免疫防御能力降低和多种疫苗免疫失败，给养鸡业造成了巨大的经济损失。 随着分子病毒学技术的普及，包括中国在内的世界上许多国家不同实验室都对vIBDV、vvIBDV及变异株IBDV的VP2基因的高变区的核苷酸序列和氨基酸序列做了比较。最初发现所有的vvIBDV都有一些可能与致病性相关的氨基酸变异，但近年来也有学者认为，vvIBDV相关的VP2高变区的氨基酸有规律变异只是病毒演化过程中的一种普通的遗传标志，而不是与致病性相关的遗传标志。由此看来仅靠未经纯化克隆的由同种病毒不同亚群(quanspecies)组成的不同野毒株分离物的VP2基因的比较，无法回答这个问题。本课题试图将一个vvIBDV中国株在细胞培养上克隆化后，再返回SPF鸡连续传代，通过比较若干病毒克隆返鸡后不同代次的传代毒致病性与VP2基因变异，来从另一个角度验证VP2高变区变异是否与致病性有关。 在实施国家自然基金重大项目的过程中，本人所在实验室从全国30个省市已经收集了72株IBDV株，在对其中40株IBDV株进行毒力、血清学以及致病性检测的基础上，选择一个毒力最强的、致死率高达90％的vvIBDVGX8／99株作为本课题研究的起点。将vvIBDV GX8／99株通过传代，研究从原始毒(鸡源囊毒)→鸡胚毒→细胞适应毒→细胞克隆化毒→回传SPF鸡传代b’扬州人学博十学位论文毒(鸡源毒)个轮回过程中系列毒株致病性的变化规律及其与核普酸、氨基酸变异之间的关系。初步掌握了vvIBDV在整个传代循环过程中的致病特点，研究了vvIBDv从未经克隆的病毒的“群体致病性”到克隆化病毒的“个体致病性”的变化规律。引进这一方法将有助于揭示vvIBDV的演变规律和毒力改变的分子基础，有助十解决超强毒毒力如何增强?超强毒能否致弱?致弱过程中核普酸和氨基酸序列发生了怎样的变化?这种变化与病毒生物学特性有着怎样的关系?弱毒株的生物学特性如何等急需解决的问题。本课题主要研究内容及其研究结果包括如下几个方面:1.鸡传染性法氏囊病病毒超强毒GX8199株传代培养及病毒的克隆化:本研究将vvIBDV Gx8/99株首先在SPF鸡胚上传10代，然后在鸡胚成纤维细胞 (CEF)上日传22代，开始适应CEF，并引起细胞病变(CPE)，表现为细胞聚缩、拉成纤丝状，最后变圆、脱落。再经无限稀释法进行2次病毒的克隆化，筛选得到了4株克隆化病毒。以克隆化病毒为起点，再将这4株克隆化病毒分别连续回归3一5周龄SPF鸡连传15代。各传代毒通过免疫胶体金试纸膜检测，除CEF适应之前的细胞毒检测不到IBDV外，其余各传代毒均可检测到IBDv。vvIBDV GX8/99株不同代次传代毒的获得，为研究该病毒从原始毒(鸡源囊毒)一鸡胚毒一细胞适应毒一细胞克隆化毒~回传SPF鸡传代毒(鸡源毒)一个轮回系列毒株致病性的变化规律及其与核营酸、氨基酸之间的关系，更好地掌握vvIBDV在整个传代循环的过程中的致病特点，vvIBDV从“群体致病性”到“个体致病性”的变化规律建立了新的技术平台。2.鸡传染性法氏囊病病毒超强毒GX8/99株原始囊毒及其传代毒的致病性试验:IBDV GXS/99株系1 999年从广一西一自然发病鸡群采集到的法氏囊组织中分离到，经动物实验证明为超强毒。即用原始病鸡法氏囊悬液在SPF鸡连续二二次人工感染后，再取法氏囊制备恳液分装在一700c保存，并用8日龄sPF鸡胚经卵黄囊接种测定其鸡胚半数致死量(ELDS。)后，再经接种SPF鸡的致病性试验表明，随鸡的l:1龄和接种剂量的不同，其致死率有很大差异。对28一30日龄SPF鸡，病毒接种量为200个ELDS。时，感染后7日内死亡率高达60一90.5% (18/30和19/21);感染量为20个ELDS。日寸，死亡率亦可达53一92%(8/15不[]23/25)。再用此vvIBov Gxs/99株的sPF鸡胚传代毒、4株克隆化细胞毒及其分别连续回归3一5周龄SPF鸡的传代毒，进行了SPF鸡胚及SPF鸡的致 朱瑞良vvIBDV细胞克隆化毒在回鸡过程中致病性与VPZ基因变异比较病性试验，结果表明，对8日龄SPF鸡胚卵黄囊接种后，GXS/99株原始囊毒在鸡胚中传代的过程中病毒滴度即ELDS。值在逐渐增大;但适应鸡胚的病毒在适应细胞后，获得的4株在细胞培养上纯化的克隆化病毒，在重新接种鸡胚时，病毒滴度却显着降低;然而，在再回传SPF鸡的过程中，其在鸡胚上产生的病毒滴度即ELDS。值又逐渐升高。由此可见，鸡胚毒对SPF鸡胚的致病性强，而细胞克隆化毒对鸡胚致病性弱，回传SPF鸡后又增强。各?
张宇耕[6]2012年在《河南省部分地区传染性法氏囊病病毒分离株的分子流行病学研究》文中指出传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的急性接触性传染病,该病毒IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官一法氏囊,导致淋巴细胞凋亡,引起鸡只长期的免疫抑制。该病是危害世界养禽业的主要传染病之一。目前国内外防治该病的主要方法是使用弱毒苗和灭活苗免疫鸡群。近年来IBDV变异株与超强毒株的出现,导致免疫失败常有发生。由IBDV侵染家禽所引起的传染性疾病长期影响着河南养鸡业的经济增长。而有关河南省内的IDBV分子流行病学调查一直都是空白。因此,分离与鉴定IBDV河南流行株,从分子水平了解病毒毒力的变异情况,有助于追踪IBDV的遗传进化,帮助临床上止确地使用疫苗,建立有效的防治措施。为了解IBD在河南省区流行情况,本研究从河南郑州、南阳、焦作等不同地区采集71份疑似病料,通过接种9-11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜(chorio-allantoic membrane, CAM),盲传数带后,收集病变尿囊膜并经琼脂免疫扩散试验、SPF鸡回归试验等实验方式初步筛选并分离了6株IBDV病毒株。为了进一步对这6株IBDV病毒株分子特征研究,分别采用逆转录酶-聚合酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)扩增了这5株病毒株的VP2基因并对其进行分析,并对其中一株IDBV病毒株进行了全基因组扩增分析,序列分析表明IBDV-HN-04株cu-1同源性达99%,病毒具有弱毒株特征氨基酸,与中国其他分离株同源性在94-99%之间,对比氨基酸序列得出HN-04共含有76(G)、271(T)、331(R)、408(C)、542(V)、555(G)、703(R)、900(G)和974(E)等9个特征氨基酸。通过对病毒的序列分析指出,目前在河南省流行的IBDV毒株同时存在经典株,变异株,超强株,以超强株为主,与日本毒株同源性较高,与欧洲株以及美洲株同源性较低,同时,病毒流行情况十分复杂,出现了不同毒力的毒株间的重组。这些结果为这些结果为河南传染性法氏囊炎病毒的分子流行情况、鉴别诊断及防治提供技术依据,为了解和防治该病提供了一定的基础。
李银聚[7]2005年在《河南省传染性法氏囊病分子流行病学调查及其防制》文中进行了进一步梳理针对近年来鸡传染性法氏囊病(IBD)的流行日益复杂，免疫失败经常发生的现状，为做好本地区传染性法氏囊病的防制工作，对2002～2004年间河南省15个地区鸡群传染性法氏囊病的流行情况及分子流行病学进行了调查，并针对性的提出了防制措施。 1．河南省传染性法氏囊病流行情况调查 对2002～2004年间河南省15个地区鸡群传染性法氏囊病的流行情况进行了调查。发现传染性法氏囊病的发病季节有全年化趋势，但每年仍以6～9月份为发病高峰期；发病鸡的日龄范围扩大；病变以法氏囊呈胶冻样水肿和肾脏尿酸盐沉积为主要特征，二者出现率分别占67.2％和73.11％；其它病变多不典型；发病鸡群中免疫鸡群占78.17％，二次发病鸡群约占16.98％；宿主和易感家禽的范围扩大。对出现上述情况的原因进行了初步的分析。 2．河南省传染性法氏囊病分子流行病学调查 为探究IBD流行呈现新特点的原因，对2002～2004年间收集的河南省15个地区具有代表性的39株IBDV病料进行了分离鉴定、VP2基因的克隆和序列分析。结果发现，有30株地方流行株属于IBDV超强毒株，但各毒株间也有一定的差异；有9个分离株，既不符合超强毒的特征，也不完全符合弱毒株的特征，是基因已经发生变异的弱毒株。同一鸡群再次发病可能是由同一毒株引起的，但基因已经发生了一定的变化。在系统发育进化树上，分离于各地区的IBDV毒株呈分散分布，但也呈现部分的地区特点。 3．IBDV超强毒和弱毒株VP2基因同义密码子使用的偏爱性研究 对河南省2002～2004年间收集并鉴定的30株IBDV超强毒株和9株弱毒株VP2基因cDNA序列进行了比较分析，研究了IBDV超强毒株和弱毒株的VP2高变区基因不同位点同义密码子的使用情况，发现超强毒和弱毒株除特征性氨基酸变化外，许多位点的氨基酸在同义密码子的使用上也有明显的偏爱性。这预示着同义密码子的使用与VP2基因表达及其表达产物的空间结构有一定的关系，进而可能影响到IBDV的
刘星火[8]2007年在《传染性法氏囊病病毒野毒株的分离鉴定及其致病性研究》文中提出传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病。疫苗的防制曾使该病得到很好地控制。但是自20世纪80年代中后期,世界上先后出现了IBDV变异株、超强毒株IBDV(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV),导致免疫过IBDV疫苗的鸡群发病的情况经常发生,IBD的流行病学规律也从此发生改变。目前,IBDV标准毒株、超强毒株、变异株在我国并存,给免疫防制带来了极大的困难。只有掌握了IBDV流行毒株的抗原性和致病性,才能做到在免疫时有的放矢。针对近年来山东地区IBDV的流行情况,本课题主要进行了以下研究:1.从山东地区采集已免疫过IBDV疫苗但又表现出IBD临床症状的病鸡病料,根据病鸡发病的流行特点和临床症状,结合病毒分离、组织病理学观察、琼脂免疫扩散试验等结果,确定几个鸡场的疫情均是由感染IBDV野毒引起。分离鉴定了3个野毒株,并分别命名为IBDV SD01、IBDV SD02和IBDV SD03。2.为进一步了解分离毒株的抗原性,对VP2高变区基因进行了克隆和序列分析。结果表明,IBDV SD01、IBDV SD02和IBDV SD03 3个野毒株均具有目前所认定的超强毒株的特征。这表明近几年来山东部分地区的流行毒株在经典毒株疫苗的免疫选择压下部分向超强毒株转变,一些免疫过IBDV疫苗的鸡发生IBD很可能由vvIBDV的出现造成的。3.测定了不同滴度的病毒液对3～6周龄SPF鸡的致病性,结果表明分离的3个野毒株都具有较高的致病性。选择合适的剂量可引起SPF鸡90%以上的死亡率,3个野毒株都可以称为vvIBDV。vvIBDV感染导致低等毒力疫苗免疫达不到到应有的保护作用,导致部分免疫过的鸡群发病。
郑江涛[9]2006年在《传染性法氏囊病病毒浙江分离株（TL2004）全基因组的克隆及生物信息学分析》文中研究指明传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的急性接触性传染病，是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官一法氏囊，导致免疫抑制。用弱毒苗和灭活苗免疫鸡群是目前防治IBD的主要方法，但随着IBDV变异株与超强毒株的出现，免疫失败常有发生。从浙江省杭州某IBDV疫苗免疫后鸡场暴发疑似传染性法氏囊病的鸡群中采集法氏囊病料，分离病毒，经琼脂免疫扩散试验、间接ELISA、鸡胚回归试验和电镜观察等证实所分离的这株(TL2004)野毒是传染性法氏囊病病毒，该毒株在抗原性和毒力上都表现出一些新特征，需要进一步在分子水平进行研究。以传染IBDV TL2004株(野毒株)基因组dsRNA为模板，采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增了病毒的基因组A节段和B节段的全长cDNA。A节段全长3260nt，包括5’、3’端的非编码区(NCR)和2个部分重迭的开放阅读框(ORFA1和ORFA2)。B节段全长2827nt，包括5’、3’端的非编码区(NCR)和1个开放性的阅读框(ORF)。二级结构预测表明，A节段和B节段的5’、3’端非编码区均存在一个大型的发夹环结构。ORFA1和ORFA2分别编码1012个氨基酸的VP2-VP4-VP3和145个氨基酸VP5，B节段ORF编码一个879个氨基酸的VP1。在氨基酸水平上，VP1、VP2、VP3、VP4和VP5与参比Ⅰ毒株的同源性分别为94.4％～99.3％、93.4％～99.6％、94.2％～99.2％、95.9％～99.6％、94.5％～99.3％。TL2004共有36个氨基酸的替代，其中大部分位于VP2和VP1。VP2的第2个小的亲水区内279位S替代了N、290位M替代了L，这两个突变可能与IBDV的抗原性漂变有关。VP1具有超强毒株所特有8个氨基酸，并且518位的R和525位的D为该毒株所独有。同源性分析提示，TL2004的基因组A节段与欧洲的CEF94、中国的JD1、HZ2和NB亲缘关系较近，基因组B节段却与超强毒株BD3/99和UK661的亲缘关系较近。以上分析提示，TL2004可能是由于IBDV超强毒株的基因组B节段和弱毒株的基因组A节段在自然界中进行基因重配后产生的新毒株。本研究用一步法直接从鸡胚尿囊液中快速克隆了IBDV浙江分离株(TL2004)基因组全长cDNA，对其基因组结构、抗原、毒力变异的分子基础进行分析，这为全面了解我省IBDV毒株的分子特征，进行大规模的分子流行病学调查等具有意义。
于雷[10]2012年在《传染性法氏囊病病毒VP2基因高变区和BC6/85株全基因组序列分析及亚单位疫苗的研究》文中研究表明传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病,除直接引起鸡死亡和生产性能下降外,还可导致感染鸡免疫抑制。本实验对IBDV不同毒株VP2基因高变区和BC6/85株基因组进行序列分析,并利用原核表达载体制备亚单位疫苗,获得了以下的结果：(1)以实验室保存的IBDV超强毒株、经典毒株及弱毒株为研究对象,对其VP2高变区进行序列分析,发现不同类型的毒株VP2氨基酸序列有规律的变化。根据VP2高变区核苷酸序列(435bp)构建遗传进化树,结果表明：所有的血清I型均由同一祖先序列演化而来；除BC6/85等4毒株外,其余毒株分为叁个大进化群,第一进化群包括弱毒株和变异毒株,第二进化群为经典毒株,第叁进化群为vvIBDV。(2)首次克隆了IBDV标准攻毒株(BC6/85株)的全基因组,并进行了序列分析,发现在A、B节段核苷酸与经典毒株、变异株和弱毒株同源性较高,与超强毒株同源性较低；与己发表的叁大进化群参考毒株的A、B片段氨基酸序列分析比较,BC6/85株共有21个特有氨基酸,VP1有3个,VP2有11个,VP5有3个,VP3有1个以及VP4有3个；与VP2氨基酸序列比较,VP1、VP3、VP5和VP4氨基酸序列较为保守。(3)将BC6/85株VP2基因克隆到原核表达载体pET-28a,成功构建了VP2基因原核表达载体pET-VP2。表达蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,能够与鸡IBDV抗血清发生特异性反应。将包涵体及变性复性处理后的蛋白以不同剂量免疫接种3周龄SPF鸡,并于首免后14天翅下静脉采血检测血清抗体,21天后攻毒。结果显示：免疫组的血清抗体水平显着高于对照组；攻毒试验结果表明：处理组(分别为160μg、320μg和640μg)和包涵体组(720μg和1440μg)保护率均达100%,包涵体360μg组保护率为90%,对照组保护率为0%,与免疫组差异极显着。
参考文献：
[1]. 中国传染性法氏囊病病毒野毒株致病性的流行病学研究[D]. 孙淑红. 山东农业大学. 2003
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[3]. 传染性法氏囊病病毒自然重配超强毒株的分离及其VP2和VP3基因的克隆表达[D]. 朱向东. 南京农业大学. 2013
[4]. 传染性法氏囊病病毒流行株的分离与检测方法的建立[D]. 梅永杰. 南京农业大学. 2016
[5]. 鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株细胞克隆化毒在回鸡过程中致病性与VP2基因变异比较[D]. 朱瑞良. 扬州大学. 2003
[6]. 河南省部分地区传染性法氏囊病病毒分离株的分子流行病学研究[D]. 张宇耕. 河南农业大学. 2012
[7]. 河南省传染性法氏囊病分子流行病学调查及其防制[D]. 李银聚. 南京农业大学. 2005
[8]. 传染性法氏囊病病毒野毒株的分离鉴定及其致病性研究[D]. 刘星火. 山东农业大学. 2007
[9]. 传染性法氏囊病病毒浙江分离株（TL2004）全基因组的克隆及生物信息学分析[D]. 郑江涛. 浙江大学. 2006
[10]. 传染性法氏囊病病毒VP2基因高变区和BC6/85株全基因组序列分析及亚单位疫苗的研究[D]. 于雷. 中国兽医药品监察所. 2012