导读:本文包含了肠激酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:重组牛肠激酶轻链,大肠杆菌,非融合蛋白,表达
肠激酶论文文献综述
王京红,于晓甜,唐铭泽,杨洪鸣,唐金宝[1]（2019）在《牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的非融合表达及生物学活性分析》一文中研究指出该研究尝试利用大肠杆菌表达体系以非融合蛋白形式表达牛肠激酶轻链(EK_(LC))。利用基因重组技术构建重组表达载体p6×His-D_4K-EK_(LC)并转化至E. coli DH5α,37℃过夜培养,超声破壁法释放菌体蛋白并收集包涵体,考察包涵体在不同浓度下的复性效率。复性后的目的蛋白经金属离子亲和层析纯化,并以EK_(LC)自切方式移除重组EK_(LC)的N-端6×His-D_4K序列得到具有天然N-端氨基酸序列的EK_(LC),酶活性测定结果显示该研究所制备的重组EK_(LC)高于商品化牛肠激酶。重组EK_(LC)在大肠杆菌中非融合表达成功,为实现EK_(LC)的经济、高效制备研究奠定了实验基础。(本文来源于《药物生物技术》期刊2019年01期）
王志彦[2]（2018）在《毕赤酵母N糖基化修饰对牛肠激酶酶学特性的影响》一文中研究指出N-糖基化修饰是最为常见也是最为复杂的一种翻译后修饰手段,对于调节蛋白质的结构和功能具有重要的作用。肠激酶作为一种具有高度特异性的异源二聚体蛋白酶,是基因工程领域常用的工具酶。本文在实现牛肠激酶轻链可溶性表达的基础上,首次利用定点突变的手段研究毕赤酵母N-糖基化修饰对于牛肠激酶酶学性质的影响。首先,本研究使用Endo H酶对重组野生型牛肠激酶轻链进行去糖基化处理,发现在毕赤酵母中表达的牛肠激酶轻链是N-糖基化修饰蛋白。基因序列研究发现,在牛肠激酶轻链的一级结构中含有叁个潜在的糖基化位点N64、N103以及N165,且都位于肠激酶外部的无规则卷曲部位。继而,利用基因工程手段,构建N-糖基化缺失程度不同的去糖基化突变牛肠激酶重组菌株,包括单点突变N64Q、N103Q、N165Q,双点突变MD1、MD2、MD3以及叁点突变MT,获得经SDS-PAGE检测条带单一的去糖基化突变牛肠激酶。接着,对比野生型及去糖基化突变牛肠激酶的生物化学性能,发现去糖基化修饰对牛肠激酶在毕赤酵母GS115中的分泌表达没有影响,但是对于酶的活性有重要意义。在以GD_4K-β-na为底物时,突变体N64Q提高了牛肠激酶的比活且提高了酶的催化效率。与野生型牛肠激酶相比,去糖基化牛肠激酶的热稳定下降且其下降程度与去糖基化程度有关,完全去糖基化突变体MT表现出最低的热稳定性。另外,研究发现去糖基化突变对牛肠激酶的二级结构没有影响,但是会改变牛肠激酶的叁级结构。本实验成功构建了N-糖基化缺失位点不同且程度各异的牛肠激酶轻链表达菌株,并研究了N-糖基化这一翻译后修饰手段对于牛肠激酶分泌、活性、稳定性等酶学性质的影响。本实验的研究成果为揭秘糖基化密码提供了一定的理论基础,同时该策略为研究其它工具酶的翻译后修饰提供了可借鉴的思路。(本文来源于《天津大学》期刊2018-05-01）
郭超,王志彦,甘一如,李丹,邓勇[3]（2016）在《理性设计改造牛肠激酶的热稳定性》一文中研究指出以牛肠激酶作为研究对象,利用理性设计的方法提高其热稳定性。首先通过分子动力学模拟软件Gromacs v 4.5.5,Flex Service以及B-FITTER软件预测出了肠激酶的柔性区Fragment 64~69,Fragment 85~90;然后结合β-转角序列统计学信息以及引入位置原有的残基不参与形成氢键的原则,确立了3个突变位点S67P,R87P以及Y136P;通过Quik Change~(TM)定点突变的方法引入突变位点,并进行了酶热稳定性分析。结果表明,R87P突变体酶的失活半衰(t_(1/2))和T_(50)~(10)较野生型分别提高了3.1 min和11.8℃,同时,动力学常数(K_m/k_(cat))测定结果显示酶活未受到显着影响。该策略有潜力应用于其他工业酶分子的热稳定性改造,为推动生物酶的工业化应用奠定基础。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2016年08期）
郭超[4]（2016）在《牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的表达及热稳定性改造》一文中研究指出肠激酶(Enterokinase,EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。由于其酶切的高度特异性,酶解后可保证目的蛋白N-末端氨基酸序列的完整性,从而使得肠激酶成为基因工程领域融合蛋白表达后修饰的首选工具酶之一。本研究通过基因工程手段,成功构建了重组牛肠激酶载体pPIC9K-BEKL。经G418抗性梯度筛选获得了5株不同抗性水平的菌株并借助QPCR技术,对其基因拷贝数进行了鉴定,结果显示菌株抗性水平及肠激酶表达量与外源基因拷贝数呈正相关。随后,采用多因素优选法对筛选所得的菌株进行了表达条件优化,并利用镍离子亲和层析的方法对发酵产物进行分离纯化。结果显示,经毕赤酵母表达所得的重组型牛肠激酶分子量约为43kDa,糖基化程度约为20.9%。纯化后,每1L发酵液获得5.7mg具有活性的目的蛋白,采用切割融合蛋白的方法测定纯化后牛肠激酶的比活达1.25×103U/mg,动力学常数Km=0.59mM,kcat=45.1S-1。以牛肠激酶轻链作为研究对象,尝试利用理性设计的方法以提高其热稳定性。首先综合Gromas 4.5.5、B-Factor及Flex Service等不同考评蛋白柔性区软件的分析结果,确定出肠激酶的结构灵活区Fragment 63-69,Fragment 85-93及Fragment135-139,并通过添加脯氨酸或二硫键的方法来对蛋白的灵活区进行刚化。根据β-转角内序列统计信息及引入位置原有的残基不参与形成氢键的原则确定了叁株脯氨酸突变体S67P,R87P及Y136P。结合肠激酶结构信息及Disulfide by Design软件预测结果,确定了叁株添加二硫键突变体:C5-C146,C85-C88及C73-C98。利用Quick-change定点突变的方法引入突变位点,并通过在毕赤酵母中表达成功获得了6种不同突变体蛋白。在对野生型及突变型牛肠激酶的热稳定性测定后发现,添加二硫键后的突变体(C5-C146,C85-C88及C73-C98)及脯氨酸突变体(R87P),其失活半衰期(t1/2)和半失活温度(T5010)较野生型均有了显着提高。同时,对R87P及C85-C88突变体酶活测定结果表明,突变体酶催化效率(Km/kcat)与野生型相比未发生明显改变。本研究成功构建了高产牛肠激酶轻链表达菌株,并利用理性设计的方法策略,提高了牛肠激酶的热稳定性同时保持其活性不受影响。该策略扩宽了肠激酶在基因工程领域中的应用,并为其他工业用酶的热稳定性改造提供了可借鉴的思路。(本文来源于《天津大学》期刊2016-05-01）
卢雪梅,黄演婷,金小宝,朱家勇[5]（2015）在《重组融合蛋白Trx-IFN-CSP的肠激酶酶切及纯化》一文中研究指出[目的]重组融合蛋白Trx-IFN-CSP的肠激酶酶切及纯化研究。[方法]选用国产肠激酶,在不同反应条件下酶切重组融合蛋白,15%的SDS-PAGE检测切割产物,并利用Ni2+亲和层析色谱联合肝素亲和层析色谱对酶切产物进行分离纯化。[结果]0.8 U的肠激酶在温度为10℃下酶切72 h能够完全裂解50μg融合蛋白。酶切产物经亲和层析色谱纯化,可获得电泳纯达99%的目的蛋白。[结论]重组融合蛋白Trx-IFN-CSP经肠激酶酶切及纯化后,可获得纯度达99%的肝靶向干扰素IFN-CSP单体,为进一步研究肝靶向干扰素的生物学活性及产业化开发奠定了基础,也为融合蛋白后处理工艺提供了技术借鉴。(本文来源于《生物技术》期刊2015年05期）
徐进[6]（2014）在《分子改造提高人肠激酶复性得率、热稳定性和特异性的研究》一文中研究指出肠激酶是由脊椎动物十二指肠细胞分泌的一种丝氨酸蛋白酶，可以特异性水解多肽序列“DDDDK”的羧基端肽键，对于胰蛋白酶原的激活有重要作用。此外，由于其独特的底物选择性，使之成为融合蛋白酶切的首选工具酶，并被广泛应用于重组蛋白表达，蛋白质分析等方面。尤其在生物制药领域，相当数量的重组蛋白类药物都是通过融合表达的方式进行生产，因此需要在下游的工艺中切除融合蛋白标签，以避免严重的毒副反应。完整的肠激酶由两条肽链组成，其中重链与其识别胰蛋白酶原相关，而轻链则因包含催化活性中心，被克隆表达以作为重组蛋白药物生产的辅助工具。来源于人的肠激酶是目前已知活性最高的肠激酶，比目前最常使用的牛肠激酶高出约10倍，非常适用于制备高效的固化酶切系统。但是重组人肠激酶轻链在制备过程中，由于其极低的复性得率，阻碍了其大规模应用。另一方面，同其他哺乳动物来源的肠激酶相似，重组人肠激酶轻链有时也会水解非特异性氨基酸位点的肽键，致使目的蛋白的得率降低，并产生副产物。非特异性活性的存在，也影响了重组人肠激酶的应用范围。本课题通过蛋白结构分析各氨基酸的二面角和立体空间位置，并辅助以分子动力学模拟技术，寻找最合适的改造位点，并利用定点突变技术将其突变成为构象熵值最高的脯氨酸，在提高热稳定性的同时，减少复性过程中无活性聚体的产生，从而提高重组人肠激酶轻链的复性得率。另一方面，通过解析特异性远高于其它同类酶的鳉鱼肠激酶的晶体结构，通过对比分析其与人、牛肠激酶轻链的结构上的差异，寻找与特异性相关的氨基酸位点。并在此基础上，再次利用定点突变技术，对重组人肠激酶进行改造，提高其特异性。结果表明，重组人肠激酶轻链的62位赖氨酸和101位的赖氨酸在突变为脯氨酸后，可以在增强热稳定性的同时，明显提高蛋白酶的复性得率（10倍）。另一方面，在解析了鳉鱼肠激酶轻链的晶体结构并结合突变研究后，发现24位组氨酸和185位甘氨酸之间，以及136位谷氨酸和213位精氨酸之间的相互作用，对于其高特异性有很大贡献。在此基础上，将重组人肠激酶轻链中的24位亮氨酸、136位酪氨酸和213位亮氨酸分别突变为鳉鱼肠激酶轻链中对应的的组氨酸、谷氨酸和精氨酸，发现24位的突变可以提高人肠激酶轻链的特异性，而136位的氨基酸残基对肠激酶的活性影响巨大。本研究首次证明，利用结构分析与分子模拟软件可以在蛋白质中找到合适的位点，通过定点突变引入脯氨酸残基，以帮助蛋白质的复性折迭，显着提高复性得率。此外，本研究首次解析了鱂鱼肠激酶轻链的晶体结构，并发现肠激酶轻链中活性中心附近的24位组氨酸和185位甘氨酸之间，以及136位谷氨酸和213位精氨酸之间可以相互作用，是其高特异性的结构基础之一。其中，24位的组氨酸可以“移植”到人肠激酶轻链中，以提高酶的特异性。最终，本研究开发出了高特异性高复性得率以及高稳定性的重组人肠激酶轻链，为其大规模应用于融合蛋白的酶切打下了坚实的基础。(本文来源于《上海交通大学》期刊2014-05-01）
徐振雷,谭树华[7]（2014）在《牛肠激酶催化亚基研究进展》一文中研究指出牛肠激酶催化亚基因具备全酶活性,可对DDDDK序列表现出高度特异性和高活性,已广泛融合蛋白表达后切割与纯化领域,本文主要阐述了牛肠激酶催化亚基理化性质,基因工程研究进展等方面(本文来源于《生物技术世界》期刊2014年03期）
陈展歌,陈锡贤,杨梦琳,蔡洪敏,李黄金[8]（2014）在《昆明鼠肠激酶轻链的原核表达、复性与纯化》一文中研究指出目的:构建昆明小鼠十二指肠肠激酶轻链(mEKL)大肠杆菌高效表达系统,并建立复性与纯化方法。方法:RT-PCR法扩增mEKL全长cDNA,以融合表达载体pET32a克隆于大肠杆菌BL21(DE3)和Origami(DE3),采用阴离子交换层析纯化复性表达产物,经牛肠激酶消化回收mEKL。结果:扩增得到723bp的mEKL全长cDNA,经序列分析发现,昆明鼠来源的mEKLcDNA序列的Ser131密码子中存在1个同义点突变。mEKL在2种宿主菌中的表达产物均为包涵体蛋白,经稀释复性、阴离子交换层析纯化和肠激酶切割可得高纯度mEKL。结论:成功构建昆明鼠源mEKL高效表达工程菌,并建立相应的纯化方法。(本文来源于《生物技术》期刊2014年01期）
马玉杰,申文捷[9]（2012）在《重组肠激酶融合蛋白纯化工艺的研究》一文中研究指出目的研究建立重组肠激酶融合蛋白纯化工艺的方法。方法利用大肠杆菌发酵表达肠激酶轻链融合蛋白DsbA-rEKL,超声破碎法破碎菌体,离心后收集包涵体。6 mol盐酸胍、5 mmol EDTA溶解包涵体,在胱氨酸存在的情况下,以脉冲方式复性。经IMAC层析及DEAE层析纯化,复性的融合蛋白做酶切实验。结果融合蛋白复性在5 mmol/L胱氨酸存在下、脉冲加量0.03 mg/ml和复性终蛋白浓度0.3 mg/ml为最佳复性方案。经IMAC层析及DEAE层析纯化,rEKL纯度可达90%以上。每升发酵液经复性及纯化后,可得rEKL 60 mg以上。结论实现了大规模生产rEKL的目的,使以融合蛋白表达rPA等药用蛋白成为现实。(本文来源于《中国卫生工程学》期刊2012年06期）
钮利喜,李娇,吉雪雪,李霞,李彦军[10]（2012）在《重组人肠激酶轻链的原核表达、纯化及活性分析》一文中研究指出【目的】在原核表达系统中实现人肠激酶轻链(Human enterokinase light chain,hEKL)的表达和纯化。【方法】通过PCR扩增得到编码hEKL的基因片段,利用基因重组技术构建原核表达质粒pMAL-s-hEKL,在Escherichia coli中进行诱导表达,菌体经超声破碎后利用Amylose亲和柱对目标蛋白进行纯化,并利用Tricine SDS-PAGE检测酶的切割活性。【结果】目的基因能够以可溶形式表达,每升发酵液可纯化得到40 mg纯度在97%以上的MBP-hEKL蛋白,活性检测表明该酶可以对含有肠激酶识别序列的蛋白进行特异性切割,酶活力达到6.0×105U/mol。(本文来源于《微生物学通报》期刊2012年11期）
肠激酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
N-糖基化修饰是最为常见也是最为复杂的一种翻译后修饰手段,对于调节蛋白质的结构和功能具有重要的作用。肠激酶作为一种具有高度特异性的异源二聚体蛋白酶,是基因工程领域常用的工具酶。本文在实现牛肠激酶轻链可溶性表达的基础上,首次利用定点突变的手段研究毕赤酵母N-糖基化修饰对于牛肠激酶酶学性质的影响。首先,本研究使用Endo H酶对重组野生型牛肠激酶轻链进行去糖基化处理,发现在毕赤酵母中表达的牛肠激酶轻链是N-糖基化修饰蛋白。基因序列研究发现,在牛肠激酶轻链的一级结构中含有叁个潜在的糖基化位点N64、N103以及N165,且都位于肠激酶外部的无规则卷曲部位。继而,利用基因工程手段,构建N-糖基化缺失程度不同的去糖基化突变牛肠激酶重组菌株,包括单点突变N64Q、N103Q、N165Q,双点突变MD1、MD2、MD3以及叁点突变MT,获得经SDS-PAGE检测条带单一的去糖基化突变牛肠激酶。接着,对比野生型及去糖基化突变牛肠激酶的生物化学性能,发现去糖基化修饰对牛肠激酶在毕赤酵母GS115中的分泌表达没有影响,但是对于酶的活性有重要意义。在以GD_4K-β-na为底物时,突变体N64Q提高了牛肠激酶的比活且提高了酶的催化效率。与野生型牛肠激酶相比,去糖基化牛肠激酶的热稳定下降且其下降程度与去糖基化程度有关,完全去糖基化突变体MT表现出最低的热稳定性。另外,研究发现去糖基化突变对牛肠激酶的二级结构没有影响,但是会改变牛肠激酶的叁级结构。本实验成功构建了N-糖基化缺失位点不同且程度各异的牛肠激酶轻链表达菌株,并研究了N-糖基化这一翻译后修饰手段对于牛肠激酶分泌、活性、稳定性等酶学性质的影响。本实验的研究成果为揭秘糖基化密码提供了一定的理论基础,同时该策略为研究其它工具酶的翻译后修饰提供了可借鉴的思路。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
肠激酶论文参考文献
[1].王京红,于晓甜,唐铭泽,杨洪鸣,唐金宝.牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的非融合表达及生物学活性分析[J].药物生物技术.2019
[2].王志彦.毕赤酵母N糖基化修饰对牛肠激酶酶学特性的影响[D].天津大学.2018
[3].郭超,王志彦,甘一如,李丹,邓勇.理性设计改造牛肠激酶的热稳定性[J].中国生物工程杂志.2016
[4].郭超.牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的表达及热稳定性改造[D].天津大学.2016
[5].卢雪梅,黄演婷,金小宝,朱家勇.重组融合蛋白Trx-IFN-CSP的肠激酶酶切及纯化[J].生物技术.2015
[6].徐进.分子改造提高人肠激酶复性得率、热稳定性和特异性的研究[D].上海交通大学.2014
[7].徐振雷,谭树华.牛肠激酶催化亚基研究进展[J].生物技术世界.2014
[8].陈展歌,陈锡贤,杨梦琳,蔡洪敏,李黄金.昆明鼠肠激酶轻链的原核表达、复性与纯化[J].生物技术.2014
[9].马玉杰,申文捷.重组肠激酶融合蛋白纯化工艺的研究[J].中国卫生工程学.2012
[10].钮利喜,李娇,吉雪雪,李霞,李彦军.重组人肠激酶轻链的原核表达、纯化及活性分析[J].微生物学通报.2012