马可[1]2017年在《有机荧光探针的制备及其生物传感和成像研究》文中提出聚集诱导型有机荧光探针作为荧光探针的一个重要研究分支,在化学传感、生物成像、疾病诊断等方面具有明显优势,人们的关注程度逐年提高,现在已经成为化学、生物学科的交叉研究领域和热门研究领域,但如何设计简单的分子探针并并使其具有优异的光学性质和识别能力,仍然是一个挑战。本论文主要设计了一系列具有聚集诱导性质的新型有机荧光探针,这些探针分子都具有很高的发光效率。我们在探针分子上引入了不同的识别基团,或者引入了其他的荧光淬灭材料,实现了目标物质的检测或成像,并且有效降低了背景噪音,提高了检测的灵敏度和选择性。具体内容包括:1.9,10-二苯乙烯基蒽衍生物小分子荧光探针的制备和重金属离子检测设计合成了一种带有胸腺嘧啶的9,10-二苯乙烯基蒽(DSA)衍生物DSA-T2,研究了其聚集诱导发光(AIE)性质。在良溶剂乙腈中,DSA-T2几乎没有荧光,在溶剂中加入汞离子可以与DSA-T2发生配位作用,这会限制DSA-T2的分子内单键旋转,减少非辐射跃迁的发生,溶液会呈现很强的荧光信号。而其他金属阳离子与荧光探针没有协同作用,溶液不发光。这种小分子荧光探针制备简单,灵敏度高,选择性好。另外,利用了另一种带有季铵盐的小分子荧光探针DSAI实现银离子检测。DSAI主要通过静电作用力和疏水作用力与DNA结合,并聚集在DNA链上,发出很强的荧光。实验选取了一种银离子的核酸适配体(DNA单链),使DSAI聚集在核酸适配体表面发出荧光,溶液中加入银离子后,核酸适配体改变构象,形成一种U型结构,进一步增强DSAI的发光强度。这时再加入核酸酶S1,不能够酶解这种特殊结构的核酸适配体,荧光没有变化。而其他的金属阳离子不能改变核酸适配体构象,核酸酶S1会使核酸适配体被水解成碎片,不能诱导DSAI聚集,溶液荧光基本消失。这种荧光探针选择性好、灵敏度高、有很好的荧光线性关系,实现了点亮型非标记的重金属检测。2.基于9,10-二苯乙烯基蒽衍生物荧光探针及水溶性碳纳米管的生物传感器由于DSAI分子可以聚集在DNA上产生荧光,在这一基础上,利用DSAI作为荧光探针,核酸适配体作为识别物质,水溶性碳纳米管作为荧光淬灭材料,设计了一种检测ATP的生物传感器。水溶性碳纳米管可以通过氢键和疏水作用力吸附核酸适配体,使其缠结在表面,这时聚集在核酸适配体上的DSAI分子的荧光被碳纳米管淬灭,溶液不发光。加入ATP后,核酸适配体与ATP相互作用,这一作用力比较强,使核酸适配体脱离碳纳米管表面,DSAI也随之脱离,溶液荧光增强。这种生物传感器实现了ATP特异性检测,是一种操作简单的点亮型非标记传感器。另外,研究了DSAI与双链DNA的相互作用力,主要表现为嵌插作用。基于这一研究结果,利用DSAI作为荧光探针,水溶性碳纳米管作为选择性平台和荧光淬灭材料,设计了一种单核苷酸多态性(SNP)光学传感器。完全互补的双链DNA与DSAI分子嵌插作用强、结合紧密,加入水溶性碳纳米管不会吸附以嵌插作用与DNA结合的DSAI分子,溶液荧光减弱程度不大。对于单碱基错配的双链DNA,其与DSAI分子之间的嵌插作用较弱、结合松散,水溶性碳纳米管会吸附一部分以静电力或疏水力结合在DNA表面的DSAI分子,溶液荧光减弱程度增大,这样就会区分出单碱基错配的双链DNA。这是一种非标记SNP生物传感器,操作简单,普适性好,具有明显优势。3.四苯乙烯适配体生物探针的制备和细胞因子的生物成像设计合成了一种核酸适配体修饰的四苯乙烯(TPE)衍生物荧光探针,并进行了活细胞内细胞因子干扰素-gamma(IFN-gamma)的生物成像。利用点击反应把TPE分子以共价键连接到核酸适配体末端,得到水溶性荧光探针,这种探针会结合IFN-gamma后,发出红色荧光,有利于细胞成像。首先利用正常细胞BV2进行标记,由于其中基本没有IFN-gamma,看不到红色荧光。如果向BV2细胞中注入少量IFN-gamma共培养,则可以看到被红色荧光探针标记的活细胞。为进一步证明实验的准确性,选取干扰素含量相对较高的T细胞(PBMC)进行标记,可以看到细胞质中明显的红色荧光,并且利用没有修饰核酸适配体的TPE分子进行对比实验,结果显示T细胞未被标记。因此这种生物适配体探针具有很好的选择性和灵敏性,适合标记细胞中含量偏低的细胞因子。4.近红外荧光磁性纳米粒子的制备和细胞因子的生物成像设计制备了一种近红外、强磁性、可降解的荧光纳米粒子Fe_3O_4/DSACN@PLGA/anti-VEGF NPs。这种纳米粒子以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为壳层结构,包覆了油酸修饰的磁性Fe_3O_4纳米粒子和油溶性聚集诱导型荧光分子DSA-CN,纳米粒子外围修饰了血管内皮生长因子抗体(anti-VEGF),可以特异性结合VEGF-A。聚集态的DSA-CN分子荧光不会完全被Fe_3O_4淬灭,使这种纳米粒子具有荧光及磁成像的功能。VEGF-A在癌细胞中含量很高,修饰了其抗体的纳米粒子可以通过识别VEGF-A来标记癌细胞。另外,在Fe_3O_4近红外光照射下会放出热量,一定程度上可以杀死癌细胞。这种荧光磁性纳米粒子的壳层PLGA可以生物降解,具有很好的生物相容性。实验选取了两种癌细胞进行标记,一种为结肠癌细胞HCT116,另一种为淋巴瘤细胞Raji。实验表明,Raji细胞的标记效率高于HCT116细胞,这是由于Raji细胞的VEGF-A含量高。用含有少量VEGF-A的BV2进行对比实验,发现BV2未被标记,说明这种荧光纳米粒子对于VEGF-A有很好的选择性。这种近红外荧光磁性纳米粒子选择性好、灵敏度高、易于制备、毒性低、生物相容性好,并且有很好的生物降解能力,在生物成像方面具有很好的应用前景。
赵彬[2]2013年在《多功能纳米生物探针的制备及其在生物分析中的应用》文中进行了进一步梳理随着生命科学的飞速发展，对生命体系中痕量甚至单个靶分子（核酸、蛋白质、小分子、细胞、病毒等）的检测变得越来越重要，因为体系中痕量特定靶分子出现（或存在）往往是体系发生重要变化的开始，如特定蛋白质组中某些蛋白质的痕量变化可能暗示细胞功能或遗传性状的改变；人血液中多种相关痕量肿瘤标志物分子的出现可能预示着某种肿瘤病灶的发生；血库中的任何一种痕量传染性病毒分子都标示着一个重大传染源隐患的存在；凡此种种。因此，在这些生命体系发生变化的初始阶段同时实现多种相关靶分子的痕量检测对于控制体系变化和改善体系现状无疑具有极为重要的意义。近年来，各种具有出色性能的纳米材料(纳米金、碳纳米管、量子点等)的涌现为制备多功能纳米生物探针用于生物分析提供了坚实的基础和可能。所以建立基于多功能纳米探针的既能实现多元检测又能实现超灵敏检测的信号放大系统必将为生命科学（尤其是蛋白质组学和分子诊断学）的研究提供强有力的支持。本论文将纳米材料和DNA纳米技术相结合，分别制备了基于碳纳米管和纳米金的多功能纳米生物探针，以及多荧光标记DNA纳米探针，实现了对各种生物分子（核酸、蛋白质和小分子）高灵敏特异性分析。主要内容如下：1.基于滚环扩增技术的碳纳米管多功能化及其在肿瘤标志物高灵敏检测中的应用利用滚环扩增技术(RCA)对多米碳纳米管(MWCNT)进行多功能化，构建了CRCAS信号放大系统并实现信号探针的负载。将CRCAS信号放大系统与经典ELISA方法相结合，对其应用与肿瘤标志物分析检测的信号放大性能进行鉴定。构建了CRCAS比色和化学发光分析方法，实现了血清中肿瘤标志物的高灵敏特异性检测；2. polyA介导纳隙内非荧光小分子编码SERS纳米探针用于多种生物分子识别制备了基于polyA非荧光拉曼小分子纳米标签（pA-nF-NTs）的SERS纳米探针，特别是polyA嵌段DNA的使用，使成本降低并且避免了一些操作中的实际问题，如样品污染和双硫键的形成等。发展了基于pA-nF-NTs多色纳米探针的通用分析平台，实现了对单一BRCA-1基因DNA，多元病毒DNA，以及多种类分析物的高灵敏特异性分析检测。首次实现了对多种类分析物(核酸、蛋白质、小分子)的同时分析检测，具有重要的科研意义和应用前景；3.基于氧化石墨烯的RCA介导多荧光标记DNA纳米探针用于DNA识别利用荧光RCA反应发展了一种新型的方法用于多荧光标记DNA纳米探针的合成，并进一步将其与氧化石墨烯的荧光淬灭特性相结合，建立了基于多荧光标记DNA纳米探针的氧化石墨烯传感平台用于DNA识别分析，实现了对不同长度以及不同浓度DNA靶标分子的分析检测。
李頔[3]2010年在《碳纳米管在药物传递和生物大分子分析中的应用研究》文中指出自1991年日本科学家饭岛澄男(Sumio Iijima)在高分辨透射电镜(HRTEM)下发现的一种针状的管形碳单质一碳纳米管(CNTs)以来,因其具有高比表面积、易功能化、酶底物催化性、良好的生物相容性以及独特的光学性质而广泛应用于药物传递系统、生物物理学治疗、神经组织再生以及蛋白质、DNA和原子量探针等方面,人们认为碳纳米管是最具发展潜力的新型生物医药材料之一。本文利用多壁碳纳米管的光散射特性及多壁碳纳米管能与DNA、药物以及微生物细胞膜发生强相互作用等性质,建立了病毒DNA特异性检测方法,探讨了碳纳米管在构建抗菌药物传递系统以及环境微生物富集、检测等方面的应用。具体内容包括以下叁个方面：(1)建立了多壁碳纳米管(MWCNTs)参与的新型药物传递系统。系统以营养肉汤分散的多壁碳纳米管和抗菌药物头孢塞肟(CTX)为模型,通过全面考察系统的分散效率、生物相容性、药效作用和传递效率,发现营养肉汤分散的多壁碳纳米管能在4℃下能稳定至少一周以上,所构成的药物传递系统较传统混酸分散多壁碳纳米管生物毒性低、传递效率高并增强了药效。同时,进一步利用多壁碳纳米管能增强药物对降解酶耐受性的作用,研究了多壁碳纳米管促进帕珠沙星对耐药细菌的抗菌活性和逆转细菌耐药性的能力,为提高临床耐药菌感染的治疗效率和逆转细菌耐药性提供了新思路。(2)提出了一种新型的可视化基因分析方法。方法的建立是以丙型肝炎病毒DNA为模型,结合多壁碳纳米管的光散射和磁小珠(MNPs)易分离特性。将丙肝病毒DNA探针通过共价偶联修饰在磁小珠表面。试验发现,探针DNA与靶物DNA杂交结合形成双链,失去了与多壁碳纳米管结合的能力,致使外加磁场的磁性分离之后上清液光散射性质发生变化。以此建立的特异性检测丙肝病毒DNA方法具有快速、灵敏、免标记的特点。(3)制备了新型的碳纳米管微生物捕捉器。应用戊二醛为连接剂,将经硅烷化处理的石英毛细管与氨基修饰的DNA相连,再以单链DNA可缠绕多壁碳纳米管的性质将多壁碳纳米管固载在石英毛细管上制成一似“纳米鱼竿”装置。由于多壁碳纳米管与细菌细胞膜有较强的天然亲和力,能主动侦测和捕获水样中的细菌。研究表明,该装置能快速、灵敏和有效的检测液相中的细菌,并对实际水样中的细菌同样有良好的响应。虽然目前碳纳米管的制备已经产业化,但其在生物医药领域的研究应用仍处于基础阶段。我们希望通过本文的研究,能为碳纳米管在药物传递、DNA光学检测以及微生物富集等方面的应用提供新方法和思路。
李贞[4]2012年在《基于纳米复合材料的电化学传感器检测堆肥中酚类物质及木质素功能基因研究》文中提出堆肥法是目前有机固体废物资源化的一种有效处理方法。在堆肥系统中,各种有机固体废物中含有不少酚类污染物,微生物降解多环芳烃的过程中还会产生对苯二酚和邻苯二酚两种中间产物。木质素是一种堆肥过程中大量存在且难以降解的芳香族化合物,锰过氧化物酶(MnP)和纤维二糖脱氢酶(CDH)在微生物降解木质素的过程中其中起了关键性作用。电化学生物传感器以其操作简单、选响应快速、选择性好、灵敏度高、成本低廉等特点在环境、生物、医药及食品工程等领域受到广泛关注。将纳米材料独特的导电性、催化活性及生物相容性与生物分子高度的催化能力和特异性识别能力结合起来,构建功能化的复合电极界面,为堆肥环境中污染物及其功能基因的分析检测提供了一个新的技术平台,对堆肥过程控制及环境监测具有十分重要的意义。本文以堆肥环境体系为研究对象,探讨了基于碳纳米管、石墨烯、金、铂等纳米复合材料的制备及功能化方法,合成并表征了多种水溶性纳米材料,研究了它们的电化学性质并将其应用于生物传感界面的修饰。通过酶、核酸探针等生物分子在电极上的固定,构建了一系列基于水溶性纳米复合材料修饰的生物传感器,用于堆肥环境中对苯二酚、邻苯二酚及锰过氧化物酶和纤维二糖脱氢酶功能基因的高灵敏检测。利用硼氢化钠化学还原及L-半胱氨酸共价结合的方法制备出一种水溶性石墨烯-纳米铂复合材料,构建出一种新型电化学传感器用于堆肥系统中的对苯二酚和邻苯二酚的同时检测。该纳米复合物具有良好的水溶性和生物相容性,可明显增大电极的有效比表面积、导电性能及催化活性。采用差分脉冲伏安法将其用于堆肥浸出液中对苯二酚和邻苯二酚的同时检测,检测下限分别为2.0×10-8M和1.0×10-8M。该传感器特异性好,稳定性强,灵敏度高,且不易受系统中其他物质的干扰,能快速实现酚类污染物的实时在线监测。制备了一种基于水溶性碳纳米管/L-赖氨酸/纳米金共同修饰的漆酶生物传感器用于对苯二酚和邻苯二酚两种物质的高灵敏测定。将L-赖氨酸通过电沉积的方法聚合在纳米金修饰后的玻碳电极上,滴涂刚果红功能化的碳纳米管水溶液,利用戊二醛交联的方法将漆酶固定。此固定化方法能很好地保持漆酶的生物活性,使得电极的催化能力大大提高,碳纳米管及纳米金均能明显提高电极的导电性、比表面积等电化学特性。该传感器制作简单,响应快速,灵敏度高,选择性好,检测下限达到了1.0×10-8M和1.0×10-9M,可用于各种环境中酚类污染物的实时监测。采用聚合酶链式反应扩增及限制性内切酶技术与基因传感技术相结合,研制出种基于辣根过氧化物酶和漆酶共同标记的生物传感器,用于锰过氧化物酶和纤维二糖脱氢酶编码基因的同时检测。利用目标链与巯基修饰的捕获探针及双酶标记的响应探针间夹心式杂交将其固定在电极表面,通过双酶信号放大来实现目标基因的快速检测。在最优实验条件下,采用计时电流法得到的还原电流与MnP和CDH两种目标基因浓度的常用对数值成良好的线性相关性,检测下限分别为6.2×10-12M和3.0×10-11。该生物传感器选择性好,精密度高,稳定性和可重复性好,为污染物生物降解过程中微生物功能基因的协同作用机理分析提供了很好的技术支持。研制了一种基于纳米金/多壁碳纳米管/1,5-萘二胺复合膜修饰的生物传感器用于纤维二糖脱氢酶功能基因的快速检测。1,5-萘二胺导电聚合膜带有大量自由氨基,有利于羧基化碳纳米管在电极表面的固定。经刚果红共价修饰后的碳纳米管导电性能好,水溶性也大大增强,为纳米金提供了一定的结合位点,增强了DNA分子在电极表面的固定量,提高了生物催化反应活性。将复合膜修饰后的电极通过扫描电镜、循环伏安法及交流阻抗法进行了表征。该传感器的灵敏度高,特异性好,操作简便,成本低,检测下限达到了1.2×10-16M,可应用于生命科学、临床医学以及环境污染控制系统中实时在线监测。开发出一种基于纳米金/多壁碳纳米管/石墨烯共同修饰的基因生物传感器用于锰过氧化物酶功能基因的超灵敏检测。L-半胱氨酸和刚果红分别对石墨烯和碳纳米管进行功能化修饰,得到一种水溶性较好、导电性能优越、生物相容性好的纳米复合材料。为纳米金的电化学沉积提供了良好的载体条件,明显增大了电极的比表面积,同时也提高了DNA分子在电极表面的固载量。通过扫描电镜、透射电镜、红外光谱扫描等方法对材料的形态和结构进行了表征。在最优实验条件下,采用计时电流法得到的还原电流与MnP目标基因浓度的常用对数值呈良好的线性相关性,检测下限达到了2.0×10-17M。该基因传感器的灵敏度极高,选择性和稳定性好,制备方法简单,成本低,可对环境中其他特定核苷酸序列进行快速灵敏检测。
殷敏[5]2010年在《磁性多壁碳纳米管的功能化修饰及在磁共振成像中的应用》文中进行了进一步梳理分子影像学是将医学影像技术与现代分子生物学相结合产生的一门新兴学科,它在生物医学方面有着广阔的应用前景。各种类型的分子成像探针已广泛应用于光学分子成像、磁共振分子成像(MRI)、核医学分子成像(PET/SPECT)和超声分子成像。随着纳米技术的发展,以纳米材料为基础的分子成像探针引起人们的极大关注。磁共振成像是重要的分子成像技术之一,它具有无入侵,实时监控和多维断层X光摄影等特性,能为软组织造影提供完美的解剖细节图像。随着能够提供更多组织细节和提高图像清晰度的磁共振成像造影剂的发展,磁共振分子成像技术进一步完善,已广泛应用于放射性诊断和医学治疗中。目前普遍研究的磁共振造影剂是超顺磁性氧化铁(SPIO),该造影剂主要是缩短质子自旋-自旋横向驰豫(T2)时间及有效横向驰豫时间(T2*)来增强健康组织与病变组织之间的对比。通过各种化学修饰在SPIO上连接生物靶向分子(如抗体、生物素等),可得到靶向磁共振造影剂,用于特定部位的成像。然而SPIO造影剂绝大多数是球形的纳米粒子,其与肿瘤细胞表面接受体的结合位点有限,主要被体内的巨噬细胞所清除,在较大程度上不能有效的到达病变组织以达到高效显影的作用。因此有必要研制合适的磁共振造影剂,它能提供更多的共价位点,增加其与肿瘤细胞结合能力,提高肿瘤细胞的磁标记率,从而增强靶细胞的MRI信号强度。近年来,一维线性纳米材料在生物医学领域中应用显示其独特优势,相比于球形纳米粒子而言,它们提供更多的结合位点、单核巨噬系统吞噬率低和血液循环时间长等。碳纳米管是典型的一维管状纳米材料,可提供高的比表面积负载磁性、荧光纳米粒子和靶向生物分子,有望为分子成像技术提供灵敏、高效的新型分子成像探针。本论文主要研究了功能化磁性多壁碳纳米管的制备及其在磁共振分子成像中的应用,其主要内容如下:1.磁性多壁碳纳米管的合成及表征二茂铁在高温下热分解为叁氧化二铁纳米粒子并成功修饰到多壁碳纳米管上,制备得到MWNTs/Fe2O3纳米复合材料—磁性多壁碳纳米管(MAGCNTs),通过透射电镜、振动探针式磁强计、XRD、XPS、Raman等对其进行了较系统地表征。2.功能化磁性多壁碳纳米管的制备及其生物相容性的研究将阴离子、阳离子聚合物通过层层组装方法修饰到超顺磁性多壁碳纳米管上,制成表面带有氨基的功能化磁性多壁碳纳米管。MTT法、流式细胞仪检测经聚合物修饰后的超顺磁性多壁碳纳米管的生物相容性。结果显示该功能化的磁性多壁碳纳米管具有良好的水溶性,稳定性和生物相容性。3.靶向磁共振造影剂的制备及其在磁共振分子成像中的应用通过酰胺反应将叶酸靶向生物分子进一步负载到功能化的磁性多壁碳纳米管上,制备得到靶向磁共振造影剂。系统研究了这种新型靶向磁共振造影剂在细胞水平上的特异性磁共振成像。初步探索了将红色量子点修饰到功能化磁性多壁碳纳米管上,形成具有光学和磁共振双功能纳米分子探针,激光共聚焦显微镜进一步探索了其光学成像。
曾明慧[6]2013年在《基于碳纳米管和DNA连接反应的生物传感平台的应用研究》文中研究说明随着科学技术的发展,对特定序列的DNA、酶及生物小分子的检测得到了飞速发展,基因疾病的诊断和治疗的机理逐渐被揭开。由于碳纳米管具有特殊的力学、电学等多种优越性能,因而被广泛应用于化学、传感、生物医学等诸多方面。它可以与核酸结合作为分子识别平台,产生和放大检测信号。碳纳米管与单双链DNA的结合能力的不同,可以分散或团聚碳纳米管。与此同时,影响生物体遗传活动的E. coli连接酶可以催化相邻DNA链的5'磷酸末端和3'羟基末端以磷酸二酯键结合两条DNA短链并与模板DNA互补。因此将DNA连接反应与碳纳米管结合可以提高分子的识别能力并构建新的信号输出平台。本论文集中研究核酸分子和碳纳米管的非共价相互作用,将DNA连接反应与碳纳米管有机结合,采用时间分辨荧光检测和荧光各向异性检测的方法对核酸、生物酶进行高灵敏度高选择性的荧光检测,不易发生光漂白,不受散射光干扰,适宜于复杂环境的生物学检测。本文的研究内容包括如下：1.基于碳纳米管(SWNTs)和连接酶时间分辨检测单碱基突变。基于碳纳米管与核酸单双链的结合能力不同、核酸间的连接酶反应和碳纳米管对稀土配合物的荧光猝灭作用,完成了对单碱基突变的时间分辨荧光检测。E.coli连接酶对单碱基突变有很高的辨识度,当反应中存在碱基错配时,反应效率下降,单链DNA吸附在碳纳米管表面,离心后取上层液体加入稀土配合物,稀土配合物可通过π-π堆积作用吸附到碳纳米管表面,荧光猝灭。采用时间分辨的方法检测荧光强度,此方法不需标记、灵敏度高且可以在复杂生物环境中实现单碱基突变的检测。2.基于碳纳米管(SWNTs)荧光各向异性检测连接酶活性。E.coli连接酶催化两条单链DNA与模板DNA形成杂交体,形成DNA双链的数目与酶活性成正比,SYBR Green I (SG I)选择性嵌入双链DNA,加入碳纳米管后双链不能吸附在其上。离心后上层清液留下嵌入SG I的DNA双链,荧光各向异性值较小。当体系中不存在E.coli DNA连接酶时,探针ssDNA和染料SG I都会吸附到碳纳米管表面,离心后缠绕着DNA和染料SG I的碳纳米管分子量较大,荧光各向异性值较大。本实验通过荧光各向异性值大小表征E.coli连接酶的活性。这种方法是一种均相检测方法,灵敏度高,可减少散射光的干扰,适用于复杂生物环境中实现酶活性的检测。
李芳[7]2015年在《化学发光功能化纳米材料合成及其在无标记生物分析中的应用研究》文中认为论文首先综述了化学发光、化学发光功能化纳米材料以及无标记化学发光生物分析技术的研究现状和最新进展。近年来,在纳米材料表面富集大量化学发光信号分子,合成发光功能化纳米材料受到人们的广泛关注,其在临床生化分析、食品药品检测、环境监测等领域具有重要应用前景。但是,目前发光功能化纳米材料主要被作为分析探针,构建基于标记技术的生物分析方法。最近,无标记分析方法无需复杂繁琐的标记过程,操作过程简单,能够实现目标分析物的灵敏、快速、低成本的检测,成为生物分析领域一个新的发展趋势。本论文针对化学发光试剂功能化纳米材料以及新型化学发光试剂/催化剂双功能化纳米材料的合成及其在无标记化学发光生物分析中的应用这一研究主题,开展了一系列研究工作。成功利用鲁米诺功能化金纳米和联吡啶钌功能化氧化石墨烯作为无标记传感平台,构建了叁个无标记电致化学发光生物分析界面,分别实现了凝血酶、急性心肌梗死标志物心肌肌钙蛋白Ⅰ和结核分枝杆菌特异DNA序列的快速测定。此外,目前所制备的发光功能化纳米材料发光效率有限,为了实现生物体系中超低含量分析物的检测,拟进一步提高发光功能化纳米材料的发光效率。本论文成功合成了N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)/过渡金属离子催化剂双功能化的金纳米材料和ABEI功能化金纳米点/Cu2+双功能化的碳纳米管,对其形貌和表面成分进行表征,研究了其化学发光特性,并基于所合成的双功能化纳米材料,成功发展了两种无标记化学发光生物分析方法,并分别将其应用于焦磷酸根离子和焦磷酸酶的简单、快速检测。主要研究内容如下：1.将鲁米诺功能化金纳米与核酸分子进行可控组装,构建无标记纳米分析界面,基于分析界面上识别分子捕获目标物后引起界面电致化学发光信号的变化作为检测信号,发展了一个无标记电致化学发光适配体传感器用于检测凝血酶。首先,利用Au-S键作用,将修饰了一段DNA链的普通纳米金组装到金电极表面；然后,利用DNA链的杂交反应,将修饰了互补DNA链和凝血酶适配体的鲁米诺功能化金纳米进一步组装到修饰电极表面。该层功能化金纳米可进行分子识别,并产生电致化学发光信号,从而构建了一个无标记纳米传感界面。当凝血酶存在时,适配体捕获凝血酶,导致修饰电极表面产生较大的电子转移阻力,影响界面上鲁米诺分子的电致化学发光反应,造成电致化学发光信号的降低。基于该电致化学发光信号的降低值,可实现对凝血酶的定量测定。对该传感器的分析性能研究表明,该传感器具有5.0pmol/L至50,nmolL宽的检测范围和低的检测限1.7pmol/L。将该电致化学发光适配体传感器用于其它蛋白,几乎没有响应,表明该分析方法具有良好的选择性。由于在测试过程中,样品基体可以被分离洗涤去除,因此该传感器具有良好的选择性,可用于人血清样品凝血酶的测定。该传感器还具有普适性,选择相应的蛋白目标物的适配体作为新的组装基元,所构建的适配体传感器还可应用于其它蛋白目标分析物的检测。2.基于鲁米诺功能化金纳米作为抗体载体和纳米传感平台,基于抗原-抗体免疫反应所引起的纳米传感界面上电致化学发光信号的变化值,成功构建了一个适用于急性心肌梗死疾病标志物心肌肌钙蛋白(cTnI)检测的无标记电致化学发光免疫传感器。首先,利用Au-S键作用,将修饰了链酶亲和素的普通纳米金组装到金电极表面；然后,利用生物素-链酶亲和素相互作用,将修饰有cTnI抗体的鲁米诺功能化的金纳米进一步组装到修饰电极表面,从而构建了一个能产生稳定的较强的电致化学发光信号的无标记免疫传感界面。当存在cTnI,传感界面的cTnI抗体捕获cTnI,造成界面电致化学发光信号的降低。基于传感界面ECL信号的变化,可实现对cTnI的直接测定。对该传感器的分析性能研究表明,该传感器可以实现cTnI从0.1到1000ng/mL宽的检测范围内的测定。同时该传感器具有较低的检测限,达到0.06ng/mL。此外,该传感器还可用于实际人血样中cTnI的检测。该方案具有简单、快速、灵敏、特异、稳定等优点。此外,该方案还可扩展用于其它疾病标志物的检测,在临床和药物诊断中具有重要应用前景。3.利用具有电致化学发光活性的Ru-GO发光功能化纳米材料作为悬浮传感界面,基于氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA的良好识别能力,利用二茂铁修饰的单链DNA (Fc-ssDNA)作为ECL信号控制单元,成功构建了一个均相电致化学发光DNA传感器,并将其用于多重耐药性结核病特异基因序列rpoB基因的检测。Ru-GO的电致化学发光信号将被吸附于其表面的Fc-ssDNA有效淬灭。耐药性结核病特异性基因序列与Fc-ssDNA发生杂交反应,从而将Fc-ssDNA从Ru-GO表面脱离,Ru-GO的电致化学发光信号得到恢复。基于Ru-GO的电致化学发光信号的变化值,可实现对特异DNA序列的识别和定量。该传感器具有较宽的检测范围,可以实现rpoB基因从0.1nmol/L到100nmol/L的测定,检测限达到0.04nmol/L。通过合理的设计DNA序列,该传感器也可用于其它疾病相关的特异DNA序列以及基因突变的检测,具有很好的应用前景。4.发展了一种新型、简单、便捷的发光试剂/金属离子催化剂双功能化金纳米材料的合成方法。利用ABEI作为模型化学发光试剂,Cu2+作为一种模型金属离子催化剂,利用生物巯基化合物,包括半胱氨酸(Cysteine, Cys),半胱氨酸-甘氨酸(Cysteinyl-glycine, Cys-Gly),同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)和谷胱甘肽(Glutathione, GSH)作为新型螫合配体,成功合成了一系列双功能化金纳米材料。在该方案中,首先合成ABEI功能化金纳米,然后通过Au-S键作用将生物巯基化合物组装到ABEI功能化金纳米表面,形成一层高密度螯合配体层。然后,金属离子催化剂,如Cu2+,将被ABE1功能化金纳米表面的螯合配体捕获,从而合成ABEI/Cu2+螯合物双功能化金纳米。研究结果表明,使用Cys作为螯合配体所合成的双功能化金纳米的化学发光强度远大于使用Cys-Gly、Hcy和GSH作为螯合配体所合成的双功能化金纳米的化学发光强度。利用所发展的方法合成的双功能化金纳米Cu2+-Cys/ABEI-AuNPs的化学发光强度比利用前期报道的方法合成的双功能化金纳米DTDTPA/Cu2+-ABEI-AuNPs的化学发光强度提高近1个数量级。此外,该方法所合成的双功能化金纳米在中性pH条件下也能产生化学发光光发射。最后,利用所合成的双功能化金纳米Cu2+-Cys/ABEI-AuNPs作为传感平台,基于焦磷酸根离子与Cys之间对Cu2+的竞争螯合反应,我们成功构建了一个简单、灵敏、高选择性的用于焦磷酸根离子检测的无标记化学发光传感器。该传感器具有较宽的检测范围,可实现焦磷酸根离子从10到100nmol/L范围内的检测,检测限低至3.6nmol/L。我们还成功将该传感器应用于实际人血浆样品中焦磷酸根离子的测定。5.发展了一种简单、有效的发光试剂/Cu2+催化剂双功能化碳纳米管的合成方法,并基于该双功能化碳纳米管的动态合成,开发了一个应用于焦磷酸酶活性检测的化学发光分析方法。首先,利用前期报道的方法,在表面修饰壳聚糖的碳纳米管溶液中,利用ABEI原位还原氯金酸,合成高密度ABEI-金纳米点修饰的壳聚糖碳纳米管(ABEI-Au-cs-CNTs)。然后,基于壳聚糖以及碳纳米管对Cu2+的优良配位和吸附能力,将金属离子催化剂Cu2+进一步组装到ABEI-Au-cs-CNTs表面,从而合成新型具有高效化学发光活性的双功能化碳纳米管ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs。ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs的化学发光强度比前期合成的ABEI-Au-cs-CNTs的化学发光强度高近2个数量级,ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs的电致化学发光强度则比ABEI-Au-cs-CNTs的电致化学发光强度高2倍。焦磷酸根离子可以与Cu2+形成稳定的螯合物,从而阻碍ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs的成功合成。当加入焦磷酸酶后,焦磷酸根离子将被催化水解为磷酸根,释放Cu2+。所释放的Cu2+可被高效、快速、有选择性的结合,组装得到化学发光强度大大增强的ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs。体系化学发光的增强值与所加入的焦磷酸酶的活性单位相关,因此可以实现焦磷酸酶从0.025U到0.5U活性单位的检测,检测限为9mU。该分析方法还被成功应用于PPase活性抑制剂的监控和浓度检测。
李光进[8]2011年在《基于罗丹明B衍生物的碳纳米管荧光传感器的制备与研究》文中提出本文以碳纳米管和罗丹明B为原料合成了碳纳米管荧光传感器,首先使纯化后的碳纳米管表面接枝偶氮二异丁腈,经与氢氧化钠反应加酸水解得到表面羧基化碳纳米管,随后加入过量的二氯亚砜将其表面羧基酰氯化,对表面修饰得到碳纳米管预材料。将罗丹明B与叁(2-氨基乙基)胺反应得到失去荧光的配体修饰基团,之后将碳纳米管预材料与配体基团反应得到目标荧光传感器。随后利用F-4500荧光仪测试此材料对金属离子的荧光选择性,结果表明,该材料对汞离子具有高度敏感性和选择性。并对其进行相应的热重分析,发现碳纳米管负载的罗丹明B衍生物的量在21.7%左右。此法合成的纳米荧光传感器对汞离子的检出浓度能够达到1×10-5mllL-1。在上述基础上还合成了罗丹明B席夫碱衍生物荧光探针,以罗丹明B和叁(2-氨基乙基)胺为原料合成了罗丹明B席夫碱衍生物,将其对金属离子的选择性和敏感性做了荧光测试,发现其对铬离子的选择性最高,同时测定了铬离子浓度梯度的荧光强度,结果表明其对铬离子的敏感性达到10-6molL-1。
张晶晶[9]2010年在《基于碳纳米管的肿瘤细胞电化学传感及凋亡研究》文中研究指明肿瘤是严重危害人们身体健康的一类疾病,它的早期诊断和有效治疗是提高肿瘤患者生存率的关键。近年来,以肿瘤细胞及其相关标志物为研究对象的细胞电化学传感器,由于具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低等特点,引起了越来越多研究者的兴趣。碳纳米管因其独特的一维、纳米管状结构、优异的热学、电学和力学性质等,在生物传感领域显示出诱人的应用前景。另一方面,细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,与许多肿瘤疾病的发病机制及化学治疗相关。开展肿瘤细胞凋亡的检测新方法研究,对于肿瘤的发病机理及治疗方法研究具有非常重要的意义。本论文正是基于以上研究背景,围绕如何将功能化的碳纳米管应用到肿瘤的早期诊断中,开展了肿瘤细胞电化学传感和细胞凋亡检测的新方法研究。主要包括以下几方面的内容：1.明胶稳定的金纳米粒子的合成和羧基化单壁碳纳米管/金复合物的组装用于细胞传感及药物传输通过在明胶溶液中原位还原氯金酸这一简便、绿色的合成方法,合成了具有良好生物相容性和亲水性的明胶稳定的金纳米粒子。该纳米粒子有良好的胶体稳定性。利用紫外-可见光谱、透射电子显微镜和原子力显微镜对不同尺寸的金纳米粒子进行了表征。此外,将具有良好生物相容性的纳米金和优良导电性的羧基化单壁碳纳米管(c-SWNTs)相结合,构建了一个新颖的用于HL-60细胞电化学传感的纳米复合物(纳米金-明胶-c-SWNTs).该纳米复合物膜为电极表面HL-60细胞的固定和电化学传感提供了一个生物相容性的界面。固定的细胞呈现出灵敏的伏安响应、良好的生物活性和递增的电子传递阻抗,说明该复合物可用于构建高灵敏的阻抗细胞传感器,其测定范围为1×104-1×107cell mL-1,检测限为5×103cell mL-1。此外,细胞毒性测试、荧光显微镜和电化学实验结果表明,该复合物能有效地促进了阿霉素和HL-60细胞的相互作用,明显地增加癌细胞内的药物沉积量,从而提高了药物治疗的效果。2.由贻贝启发的合成碳纳米管/聚多巴胺/叶酸纳米探针用于靶向细胞检测利用多巴胺的自身氧化聚合反应,我们在羧基化的多壁碳纳米管(CNTs-COOH)表面原位包覆了一层聚多巴胺(PDA),并进一步通过碳二酰亚胺偶联反应,共价构建了一种新颖的叶酸功能化的纳米探针(CNTs@PDA-FA)。用扫描电子显微镜、高分辨透射电镜和接触角分析仪表征了纳米探针的均一性和生物相容性。该探针同时具有碳纳米管的优异的电化学性能和叶酸分子对肿瘤细胞膜表面叶酸受体的特异性识别能力。进一步利用电化学阻抗技术,我们发展了一种无标记的电化学细胞传感方法,它对高表达叶酸受体的肿瘤细胞,如人宫颈癌HeLa细胞及人白血病HL-60细胞,具有灵敏的电化学响应。由于聚多巴胺修饰层的良好的黏附性能和高的生物分子结合能力,该无标记的电化学传感策略为进一步研究肿瘤细胞膜表面的其它受体-配体的识别反应提供了有力的平台。3.用于检测细胞表面糖基和糖蛋白的电化学细胞传感器的设计与应用本文设计了一种新颖的电化学免疫传感策略用于检测人宫颈癌HeLa细胞及其表面聚糖和P-糖蛋白(P-gp)的表达水平。首先通过简单的层层组装方法,将氮掺杂的碳纳米管、硫堇和金纳米粒子组装到一起,构建了新型的具有叁维结构的细胞传感界面。该界面具有高度的亲水性、良好的生物相容性和稳定性,能有效地促进伴刀豆球蛋白A(ConA)的固定,并使固定的ConA具有高度的稳定性和生物活性。由于ConA对细胞表面甘露糖基的特异性识别作用,构建的ConA/3-D传感界面显现出卓越的捕获细胞的能力。随后利用两步酶联免疫反应将HRP酶引入到细胞传感界面上,通过HRP催化H202氧化硫堇,进一步实现了电化学信号的放大。该细胞电化学传感器具有优异的性能,在8.0×102-2.0×107cells mL-1范围内,电化学信号与HeLa细胞浓度对数呈线性关系,并且在36时计算其检测限为500cells mL-1。此外,利用预先封闭甘露糖或者P-gp结合位点的方法,该传感器可进一步用于估算单个HeLa细胞上的甘露糖残基和P-gp的表达水平,在优化的实验条件下,测得单个细胞表面约含有(4±2)×10m个甘露糖基和8.47×106个P-gp蛋白分子。这一策略为癌细胞及其表面受体的灵敏测定提供了新的途径,为癌症的诊断和治疗提供了帮助。4.基于碳氮纳米管和凝集素功能化的量子点/硅球纳米探针的双信号放大策略用于检测早期凋亡细胞通过层层静电组装的方法制备了核壳结构的SiO2@CdTe QDs纳米复合物,并以聚烯丙基胺盐酸盐作为连接剂,将伴刀豆球蛋白A非共价组装到纳米复合物表面,构建了一种新型的凝集素功能化的纳米探针。该探针同时具有凝集素对细胞表面甘露糖基的特异性识别能力和量子点/二氧化硅纳米复合物的多标记电化学信号放大功能,可以作为一种细胞电化学传感器的标记物。为了构建细胞传感器的基底,我们将碳氮纳米管和金胶组装到电极表面,用于膜联蛋白Ⅴ (Annexin Ⅴ)的固定。利用Annexin Ⅴ能特异性的识别并结合凋亡细胞暴露在细胞膜外表面的磷脂酰丝氨酸,将早期凋亡细胞捕获到传感界面上,并进一步结合凝集素纳米探针,我们发展了一种快速识别和灵敏检测早期凋亡细胞的电化学分析检测方法。这种方法快速简便、灵敏度高、选择性好,在细胞凋亡的检测中具有潜在的应用价值。5.功能化碳纳米管/量子点纳米探针用于Caspase3激活和抑制的检测将碳纳米管/量子点纳米探针的信号放大作用与半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)对DEVD肽段的特异性识别与酶解相结合,研制出一种检测Caspase3活性与抑制作用的电化学传感器。首先利用LBL静电组装的方法合成了CNTs/PDDA/CdTe QDs纳米复合物,随后通过碳二酰亚胺偶合反应,共价偶联了链亲和素(SA)得到功能化的纳米探针。然后设计了一种Biotin标记的含有DEVD肽段的多肽,这种多肽可以特异性的识别激活的Caspase3。组装到电极上的多肽被凋亡细胞裂解液中的Caspase3切割后,多肽末端的Biotin分子从电极表面脱落下来。随后利用量子点纳米探针,我们可以检测电极上剩余Biotin分子的比例。由于Biotin分子的剩余量与Caspase3的活性成反比,因此通过电化学检测QDs的信号,可以间接反映细胞裂解液中Caspase3的活性。此外,该传感器也为检测Caspase3抑制剂及评估抗癌药物的药效提供了一个有力的平台。6.基于热电极体系的竞争型免疫传感器用于人白介素6的检测通过一步化学还原法合成了聚多巴胺功能化的金纳米粒子,并利用超声方法将其组装到石墨烯表面制备了石墨烯/金胶纳米复合物。该复合物同时具有了石墨烯的高负载特性、金胶的良好生物相容性以及聚多巴胺与蛋白质分子的高结合能力,因此有望成为一种新的生物分子的固定载体。我们以石墨烯/金胶复合物为传感器的基底,结合量子点功能化的碳纳米管探针作为生物标记物,构建了一种新型的竞争型电化学免疫传感器用于人白介素6的检测。该传感器结合了石墨烯/金胶的高效固载生物分子能力和碳纳米管/量子点探针的多标记信号放大特性,因此具有很高的灵敏度。更重要的是,我们将丝网印刷热电极引入到免疫传感器的信号测定中去,通过简便的提高电极表面的温度,实现了待测金属离子的快速有效富集,显着增强了电化学信号,从而进一步提高了传感器的灵敏度。该电化学免疫分析方法的检测范围是0.1-100pg mL-1,检测限是0.033pg mL-1。这种新型的免疫传感器具有较高选择性与稳定性,能够应用于实际血清样品的检测,在临床方面具有一定的应用前景。
董微[10]2009年在《量子点的制备及在生物标记中的应用》文中提出对生物体内及生命过程中蛋白质、核酸、多肽等重要生物分子的高灵敏分析检测,是生命科学研究领域的重要难题。探索和发展高灵敏度、高选择性的分析检测方法一直是这一领域研究者的努力方向。荧光分析法是生物学研究中十分重要的方法之一,其检测灵敏度很大程度上取决于标记物的发光强度和光化学稳定性。目前使用的大多数荧光试剂如有机荧光染料等存在着光学稳定性较差、激发光谱范围窄、发射光谱较宽、与生物分子的背景荧光难以区分等不可忽视的弱点,导致应用中灵敏度下降。量子点作为一种新型的荧光纳米材料,弥补了有机染料的上述缺点,引起分析化学和生命科学领域的广泛关注。早期的量子点是在有机体系中制备的,即用金属有机化合物在具有配位性质的有机溶剂环境中生长纳米颗粒。这种方法制备条件比较苛刻、操作复杂,且制得的量子点水溶性不佳,欲获得较理想水溶性,需进行复杂的修饰改性,因而水溶性量子点的制备成为人们研究的热点。但目前报道的水相中合成量子点的一般量子产率较低(10%～30%),荧光发射峰半峰宽较宽。基于上述研究现状,本项研究选用谷胱甘肽作为稳定剂在水相中制备高质量的量子点,并考察它们在生物大分子标记以及细胞的免疫成像等领域中的应用。首先采用水相合成法,以谷胱甘肽(L-glutathione,GSH)作为稳定剂,氯化镉、和碲粉等简单的无机试剂作为合成原料,合成水溶性CdTe量子点。利用CdTe量子点表面的羧基和氨基基团与生物分子(如蛋白质和抗体)中氨基和羧基基团之间的相互作用,直接与生物分子链接并对细胞进行荧光标记。实验中CdTe量子点与牛血清白蛋白成功地链接后,量子点荧光强度明显提高。并在BSA的浓度为2.0-10 mg/L时,溶液的荧光强度与BSA浓度形成良好的线性关系,可以用来进行蛋白的初步定量测定。同时,CdTe量子点能与大鼠抗小鼠CD4抗体连接,制备水溶性CdTe-CD4复合物探针,对鼠的淋巴细胞和脾脏标记成像。结果表明,CdTe量子点与传统的异硫氰酸荧光素(FITC)相比,具有更强的荧光强度和光稳定性。其次,将CdTe量子点作为生物荧光探针引入前列腺癌研究中。采用直接和间接标记两种方法检测前列腺癌细胞的特异性抗原(prostate specific antigen,PSA),比较两种方法对细胞的免疫标记效果。结果表明,直接标记方法操作步骤虽然简单,但是量子点在细胞表面有明显的非特异性吸附现象;而间接标记方法利用一抗和二抗之间的结合降低了非特异性吸附,量子点探针在细胞表面呈现出明显的荧光信号。同时,通过对活的前列腺癌细胞进行标记,考察了CdTe量子点的生物毒性。第叁,选用谷胱甘肽(GSH)作为稳定剂,首次在水溶液中合成了稳定的CdSe/CdS核/壳结构的量子点。采用CdS无机包覆层对CdSe量子点表面进行修饰,有效地限制对核的激发,消除非辐射驰豫途径和防止光化学褪色,提高了量子点的稳定性和荧光产率。经光学性能表征,制备的CdSe/CdS核/壳结构量子点具有荧光产率较高、半峰宽窄、峰形对称等优良的光谱性能;结构性能表征表明合成的量子点尺寸分布均匀,为近似球形颗粒。同时,将CdSe/CdS量子点和鼠抗人CD3抗体连接,制备水溶性CdSe/CdS-CD3复合物探针,对人血淋巴细胞标记成像。实验结果表明,CdSe/CdS量子点与传统的FITC相比,具有更强的荧光强度和光稳定性。最后,初步研究了量子点与碳纳米管复合物的制备。由于这种纳米复合物具有独特的物理和化学的性质,预期在纳米电学、催化反应、生物感应器等领域具有广泛的应用,尤其在医学和药学上的应用成为众多国际研究者最为关注的热点。实验中碳纳米管经氧化处理后,在端口处会形成羧基,利用羧基与谷胱甘肽包被的CdTe量子点上氨基之间的作用,实现了量子点与单壁碳纳米管的链接。经荧光光谱表征,链接碳纳米管后的量子点荧光强度减弱。总之,本研究工作以谷胱甘肽作为稳定剂,合成了两种高质量的水溶性量子点。利用量子点表面的羧基和氨基基团与生物分子抗体中氨基和羧基基团之间的相互作用,直接与生物分子链接制备了叁种免疫探针,成功地用于淋巴细胞及脾组织、前列腺癌细胞和人血淋巴细胞的荧光标记及成像。实验中还考察了CdTe量子点的生物毒性。此外,初步探索了量子点与碳纳米管复合物的制备工艺。
参考文献：
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