导读:本文包含了牛肠激酶催化亚基论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:肠激酶,酵母,层析,基因,胰蛋白酶,工程,阳离子。
牛肠激酶催化亚基论文文献综述
徐振雷,谭树华[1]（2014）在《牛肠激酶催化亚基研究进展》一文中研究指出牛肠激酶催化亚基因具备全酶活性,可对DDDDK序列表现出高度特异性和高活性,已广泛融合蛋白表达后切割与纯化领域,本文主要阐述了牛肠激酶催化亚基理化性质,基因工程研究进展等方面(本文来源于《生物技术世界》期刊2014年03期）
姬秋彦,毕研伟,肖红剑,闫玲梅,高丹丹[2]（2012）在《重组肠激酶催化亚基在毕氏酵母中的高密度发酵、纯化及活性鉴定》一文中研究指出应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚基(EKLC)表达并分泌至酵母培养基中.高密度发酵后,经超滤浓缩,采用SP Sepharose F.F一步纯化得到纯度达98%以上的重组目的蛋白,活性达到2.3 U/uL.上述结果表明,本实验成功获得了肠激酶催化亚基,它是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.(本文来源于《云南大学学报(自然科学版)》期刊2012年S2期）
刘龙飞[3]（2011）在《猪肠激酶催化亚基基因的克隆及其在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达》一文中研究指出肠激酶(Enterokinase,EK)是哺乳动物十二指肠上皮产生的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶,由1条重链和1条轻链组成,酶的催化活性部位于轻链上。EK是蛋白酶类中专一性较高的一种酶,它能够专一性识别蛋白质分子中由连续4个天冬氨酸和1个赖氨酸与下一个任意氨基酸组成的肽段,并能水解由赖氨酸与任意氨基酸形成的肽键,即-D-D-D-D-K-↓-X-(X代表任意氨基酸)。用EK切割融合蛋白不仅能够确保其它部位的肽键不被破坏,同时切割后所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的N-末端氨基酸序列,因此EK作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂被广泛利用。市售的肠激酶价格昂贵,本实验拟采用基因工程的方法制备具有生物活性的肠激酶。目前,多见关于牛肠激酶的研究,对猪肠激酶的的研究未见于报道。因此,本试验考虑到生产成本和重组蛋白活性等方面,对猪的肠激酶轻链分别采用毕赤酵母表达体系和原核表达体系进行了表达。首先,本试验对猪肠激酶催化亚基基因进行了克隆并在毕赤酵母中进行了表达。为制备重组猪肠激酶催化亚基(EKL),依据GenBank猪EKL基因的编码序列,通过RT-PCR方法从猪小肠粘膜组织中扩增EKL cDNA基因,利用SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点,将该EKL片段插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K质粒中,并与载体中的α因子信号肽序列融合,构建成EKL基因的分泌型酵母表达载体pPIC9K-EKL。表达载体经Sal I线性化后,以电转化的方法将其转移到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中。然后利用以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝猪EKL基因的重组酵母。经PCR检测证明EKL基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导进行表达,表达产物经SDS-PAGE检测及酶促活性检测,结果显示在酵母菌培养基中检测到分子量为35 kDa的重组EKL蛋白,经过对制备的胰蛋白酶原进行酶促水解检测,证明该重组EKL蛋白具有激活胰蛋白酶原的活性,表明本研究制备的重组猪EKL具有生物活性。考虑到生产成本及表达便捷程度等方面的因素,本试验用大肠杆菌BL21(DE3)对猪肠激酶催化亚基基因进行了表达。采用PCR方法扩增猪肠激酶轻链(EKL)基因,利用EcoRⅤ和HindⅢ位点将猪EKL基因插入到原核表达载体pET-20b(+)中,构建成C端与His-tag融合的EKL原核表达载体pET-20b-EKL。将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,使猪EKL基因在大肠杆菌中进行表达,表达菌体经超声波破碎、离心后用SDS-PAGE和Western blot检测上清中的表达重组猪EKL。结果表明构建的猪EKL原核载体能够介导重组猪EKL在大肠杆菌中表达。表达重组EKL能够特异切开含有肠激酶切点的融合蛋白,这表明本试验用大肠杆菌表达系统制备的重组猪EKL也具有生物活性。这项研究为重组猪EKL在科学研究和生产中的应用奠定了基础。(本文来源于《河北农业大学》期刊2011-06-04）
张春香,罗学刚,童锦禄,蒋声海,符玉梅[4]（2011）在《牛肠激酶催化亚基工程菌培养条件的探索与鉴定》一文中研究指出目的:探索牛肠激酶催化亚基工程菌高效表达的培养条件。方法:牛肠激酶催化亚基基因的初步表达,筛选构建工程菌,从以下方面入手优化培养条件:培养基的组成、摇瓶发酵培养条件、培养基的PH、种龄、接种量、培养时间等,并且通过Western Blotting和SDS-PAGE等鉴定不同条件下的实验结果,从而确定最佳培养条件。结果:通过鉴定实验结果,从不同种平行培养条件中选择产量最高的培养条件,作为最优培养条件。结论:成功地探索并鉴定了工程菌的适宜培养条件。(本文来源于《现代生物医学进展》期刊2011年09期）
刘龙飞,李秀锦,仲飞,李巍,潘素敏[5]（2011）在《猪肠激酶催化亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达》一文中研究指出依据GenBank猪肠激酶催化亚基(EKL)基因的编码序列设计引物,通过RT-PCR方法从猪小肠黏膜组织中扩增EKL cDNA基因,利用SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点,将该EKL片段插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K质粒中,并与载体中的α因子信号肽序列融合,构建EKL基因分泌型酵母重组质粒载体pPIC9K/EKL。重组质粒载体经SalⅠ线性化后,以电转化的方法将其转移到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中。然后利用以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选获得高拷贝猪EKL基因的重组酵母。经PCR检测证明EKL基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE及酶促活性检测,结果显示在酵母菌培养基中检测到相对分子质量为35 000的重组蛋白。经过对制备的胰蛋白酶原进行酶促水解检测,证明该重组蛋白具有激活胰蛋白酶原的活性,表明制备的重组猪EKL具有生物活性。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2011年05期）
张春香,罗学刚,童锦禄,蒋声海,符玉梅[6]（2011）在《牛肠激酶催化亚基工程菌的构建》一文中研究指出目的:构建牛肠激酶催化亚基工程菌。方法:将带有牛肠激酶催化亚基(bEKL)的结构基因进行克隆,将克隆产物纯化后,构建bEKL克隆质粒,后构建bEKL表达质粒,并将表达质粒制导入备感受态细胞,进行蛋白表达。结果:琼脂糖电泳验证牛肠激酶催化亚基基因已经成功地插入表达载体,序列与预期设计一致。结论:表达质粒构建成功。(本文来源于《现代生物医学进展》期刊2011年03期）
刘龙飞,李秀锦,仲飞,李巍,张峰[7]（2010）在《猪肠激酶催化亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达》一文中研究指出为制备重组猪肠激酶催化亚基(EKL),依据GenBank猪EKL基因的编码序列,通过RT-PCR方法从猪小肠粘膜组织中扩增EKL cDNA基因,利用SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点,将该EKL片段插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K质粒中,并与载体中的α因子信号肽序列融合,构建成EKL基因的分泌型酵母重组质粒载体pPIC9K/EKL。重组质粒载体经SalI线性化后,以电转化的方法将其转移到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115(本文来源于《全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编》期刊2010-07-01）
黄鹤,甘一如,张镜宇[8]（2004）在《牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆及融合表达载体的构建》一文中研究指出肠激酶(Enterokinase,EK)是目前生物制药领域纯化重组蛋白产品时用于切割融合蛋白的首选工具酶之一.为克隆表达牛肠激酶催化亚基(EKL)编码的基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售肉牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCm T载体中进行全序列分析.结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致.随后,将目的基因片段插入pET32a融合型表达载体中.经测序证实其重组DNA5'端多克隆位点与重组片段的接口处核苷酸顺序准确无误,所表达重组蛋白经SDS PAGE分析,相对分子质量为50kD,表达量达38%,为进一步进行Enterokinase催化亚基蛋白表达及活性研究奠定了基础.(本文来源于《天津大学学报》期刊2004年10期）
黄鹤[9]（2003）在《牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆、表达及表达产物的纯化和应用》一文中研究指出肠激酶(enterokinase, EK)是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,可沿胰蛋白酶原序列中(Asp)4 –Lys的羧基端切下，从而释放出活性胰蛋白酶。正是肠激酶在体内表现出的这种高度的酶切特异性使其成为当前基因工程领域融合蛋白表达后切割与纯化的重要工具之一。较之目前裂解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、羟胺等化学试剂,肠激酶具有非特异性切割极少，反应条件宽泛，切割位点在全部识别序列之后，切出的目标产品首位氨基酸可完全忠实于天然蛋白等特点。本文首次对中国北方黄牛肠激酶基因催化亚基（EKL）编码序列的cDNA进行了克隆并分别在大肠杆菌与毕赤酵母中实现了表达，得到如下结果：首先从市售中国北方黄牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段，将此片段克隆于pGEM?-T Easy载体中，经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后，进行全序列分析。结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致，得到了编码正确的牛Enterokinase催化亚基基因全序列。然后利用基因重组技术将编码牛EKL的基因片段插入pET39b融合型表达载体，转化到大肠杆菌E.coli BL21（DE3）pLysS中，首次用融合的方式在原核系统中成功表达了带（His）8亲和标记的重组肠激酶催化亚基。经条件优化后，重组肠激酶催化亚基融合蛋白DsbA-EKL-（His）8可溶性表达量占裂菌上清总蛋白的18%以上。经镍亲和层析分离纯化后自催化切割产生的rEKL-（His）8达3.5mg/g湿菌，比活力1.34×107U/mg。与此同时，本文利用毕赤酵母表达系统对EKL基因编码序列进行了在真核细胞中的表达。将目的基因克隆到穿梭质粒pPIC9中，线性化后转染酵母Pichia pastoris，使之获得了分泌表达，表达量占培养液上清的32.8%。经大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）亲和层析纯化后得到活性rEKL 10.9ug/mL发酵液，酶的比活力2.88×107U/mg。本文还首次将融合蛋白DsbA-EKL-（His）8的自催化切割与酶解融合蛋白Trx-IL-11的过程偶联，酶切体系经一步镍亲和层析后rhIL-11纯度大于95%，为融合蛋白后处理工艺构建了一个崭新的技术平台，是我国生物制药领域在融合表达基因工程产品这一研究方向的先期工作。(本文来源于《天津大学》期刊2003-07-01）
牛肠激酶催化亚基论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚基(EKLC)表达并分泌至酵母培养基中.高密度发酵后,经超滤浓缩,采用SP Sepharose F.F一步纯化得到纯度达98%以上的重组目的蛋白,活性达到2.3 U/uL.上述结果表明,本实验成功获得了肠激酶催化亚基,它是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
牛肠激酶催化亚基论文参考文献
[1].徐振雷,谭树华.牛肠激酶催化亚基研究进展[J].生物技术世界.2014
[2].姬秋彦,毕研伟,肖红剑,闫玲梅,高丹丹.重组肠激酶催化亚基在毕氏酵母中的高密度发酵、纯化及活性鉴定[J].云南大学学报(自然科学版).2012
[3].刘龙飞.猪肠激酶催化亚基基因的克隆及其在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达[D].河北农业大学.2011
[4].张春香,罗学刚,童锦禄,蒋声海,符玉梅.牛肠激酶催化亚基工程菌培养条件的探索与鉴定[J].现代生物医学进展.2011
[5].刘龙飞,李秀锦,仲飞,李巍,潘素敏.猪肠激酶催化亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[J].中国兽医学报.2011
[6].张春香,罗学刚,童锦禄,蒋声海,符玉梅.牛肠激酶催化亚基工程菌的构建[J].现代生物医学进展.2011
[7].刘龙飞,李秀锦,仲飞,李巍,张峰.猪肠激酶催化亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[C].全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编.2010
[8].黄鹤,甘一如,张镜宇.牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆及融合表达载体的构建[J].天津大学学报.2004
[9].黄鹤.牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆、表达及表达产物的纯化和应用[D].天津大学.2003
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