Methylobacterium rhodesianum源二氯甲烷脱卤酶的异源表达优化及其定向改造

论文摘要

二氯甲烷（DCM）是一种高挥发性化合物,被广泛用作工业溶剂。它在水溶液中稳定,半衰期超过700年,在大气中约为150天。DCM具有严重的遗传毒性,因此需要严格的处理条件才能最大限度地减少其对人体的危害。目前已经开发了多种方法,包括焚烧、吸收、氧化、冷凝和生物降解,用于去除环境中的DCM。其中,生物法因其反应条件温和,成本低,去除率高,无二次污染而日益普及。微生物细胞中的DCM脱卤酶可以催化DCM的降解。然而,由于传质慢和酶活性及含量低,微生物细胞中天然存在的DCM脱卤酶的效用通常受到限制。基于此,本论文期望通过异源表达DCM脱卤酶,优化产酶条件来提高DCM脱卤酶的表达量,并借助生物信息学分析和实验探究DCM脱卤酶的结构并进行改造,得到酶活力更高的DCM脱卤酶。首先将编码DCM脱卤酶的基因从Methylobacterium rhodesianum中克隆并在大肠杆菌中表达。对重组菌的产酶条件进行优化,发现其最适产酶条件是诱导温度20℃,诱导时间8 h,培养基pH为7。构建了分子伴侣共表达菌株,发现伴侣质粒pGro7表达的蛋白使可溶性DCM脱卤酶的表达量提升了近50%。此外,通过包涵体的折叠复性,得到了更多可溶的DCM脱卤酶。使用同源建模和保守结构域分析对DCM脱卤酶的结构进行预测,发现DCM脱卤酶属于谷胱甘肽转移酶（GST）家族,由N末端β折叠结构域和C末端α螺旋结构域组成。底物结合在C末端α螺旋之间的裂隙中。基于以DCM为配体的DCM脱卤酶分子对接分析,将底物结合口袋和10个保守氨基酸残基的所有靶氨基酸残基分别突变为丙氨酸（Ala）。测定活性后,选取R120,L121,W128和T146进行饱和突变。结果显示dcmT146A、dcmT146R和dcmT146Q具有更高的活性,而dcmL121A、dcmT146L、dcmL121Q和dcmL121F的活性基本保持不变。接下来,选择这7个突变体进行双突变。结果发现突变体dcmL121A/T146R表现出最高的酶活力,相对于野生型DCM脱卤酶的活性提高了52.8%。通过分析比较野生酶和突变体dcmL121A/T146R的结构,探究了结构和功能的关系,发现突变体dcmL121A/T146R在活性中心具有更小的空间位阻,底物结合口袋氨基酸残基的数量从8个减少到5个,同时酶分子整体的亲水性增加。此外,底物结合口袋内疏水性氨基酸残基的比例增加并且Km值变小。据推测,突变体dcmL121A/T146R中所有的这些变化可能有助于DCM脱卤酶催化活性的增加;此外还对比研究了两者的酶学特性,发现突变型和野生型酶具有相似的酶活变化规律。为了提高DCM脱卤酶的使用寿命,进行了酶的固定化研究。使用氧化石墨烯（GO）来固定DCM脱卤酶,提高了DCM脱卤酶的热稳定性。研究还发现,在交联剂戊二醛和金属离子Fe2+的作用下,GO的固定化效率大大提高。固定化酶的最适pH向碱性偏移。此外,固定化酶使用6次以后,酶活仍然保留50%。

论文目录

摘要

ABSTRACT

符号与缩略

第一章绪论

1.1 DCM的处理方法

1.1.1 DCM的物化处理方法

1.1.2 生物法处理DCM

1.1.3 DCM降解菌

1.2 DCM脱卤酶的研究现状

1.2.1 DCM脱卤酶与GST的关系

1.2.2 DCM脱卤酶代谢过程

1.2.3 DCM脱卤酶基因的克隆表达

1.3 重组大肠杆菌的包涵体

1.3.1 包涵体形成的原因

1.3.2 减少包涵体形成的策略

1.3.3 包涵体蛋白的折叠复性

1.4 酶的固定化方法

1.4.1 传统酶固定化方法

1.4.2 新型酶固定化方法

1.4.3 氧化石墨烯固定化酶

1.5 选题意义、技术路线、研究内容及目标

1.5.1 选题意义

1.5.2 技术路线及研究内容

1.5.3 研究目标

参考文献

第二章 DCM脱卤酶的表达优化

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 实验菌株及培养条件

2.2.2 实验仪器

2.2.3 主要药品试剂

2.2.4 DCM脱卤酶基因的克隆表达

2.2.5 菌落PCR验证阳性克隆

2.2.6 质粒DNA的提取

2.2.7 DNA的琼脂糖凝胶电泳

2.2.8 DNA含量和纯度的测定

2.2.9 PCR产物测序

2.2.10 DCM脱卤酶的提取纯化

2.2.11 SDS-PAGE凝胶电泳

2.2.12 蛋白浓度的测定

2.2.13 共表达体系的构建

2.2.14 重组包涵体蛋白质的折叠复性

2.2.15 Cl-浓度的测定

2.3 结果与分析

2.3.1 DCM脱卤酶基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的克隆表达

2.3.2 重组菌株的生长曲线测定

2.3.3 诱导剂IPTG对菌株生长的影响

2.3.4 酶活检测条件的优化

2.3.5 DCM脱卤酶重组菌产酶条件的优化

2.3.6 伴侣蛋白对DCM脱卤酶可溶性表达的影响

2.3.7 共表达菌株产酶条件的优化

2.3.8 包涵体蛋白的折叠复性

2.4 本章小结

参考文献

第三章 DCM脱卤酶的分子对接及定点突变

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 实验菌株及培养条件

3.2.2 实验仪器

3.2.3 主要药品试剂

3.2.4 DCM脱卤酶的生物信息学分析

3.2.5 DCM脱卤酶与DCM的分子对接

3.2.6 突变菌株的构建

3.2.7 蛋白的提取纯化

3.2.8 蛋白浓度的测定

3.2.9 DCM脱卤酶酶活的测定

3.2.10 DCM脱卤酶酶学性质的研究

3.2.11 圆二色谱（CD）分析

3.3 结果与分析

3.3.1 DCM脱卤酶的结构预测

3.3.2 分子对接结果分析

3.3.3 DCM脱卤酶底物结合位点的预测

3.3.4 DCM脱卤酶的定点突变

3.3.5 突变位点的保守性分析

3.3.6 圆二色谱检测蛋白的二级结构

3.3.7 突变型和野生型DCM脱卤酶底物结合口袋的对比分析

3.3.8 突变型和野生型DCM脱卤酶酶学特性的研究

3.3.9 突变型和野生型DCM脱卤酶的降解动力学分析

3.4 本章小结

参考文献

第四章 DCM脱卤酶的固定化的初步研究

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 实验菌株及培养条件

4.2.2 实验仪器

4.2.3 主要药品试剂

4.2.4 DCM脱卤酶的提取纯化

4.2.5 固定化酶的制备

4.2.6 固定化酶的酶学性质研究

4.3 结果与分析

4.3.1 氧化石墨烯固定化DCM脱卤酶

4.3.2 固定化酶的酶学特性

4.3.3 固定化酶的热稳定性

4.3.4 固定化酶的重复使用性

4.4 本章小结

参考文献

第五章总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

附录

致谢

作者简介

1 作者简历

2 攻读硕士学位期间发表的学术论文

学位论文数据集

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 施佳齐

导师: 余志良,於建明

关键词: 脱卤酶,分子伴侣,分子对接,定点突变,固定化

来源: 浙江工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 浙江工业大学

分类号: Q55;Q78

DOI: 10.27463/d.cnki.gzgyu.2019.000850

总页数: 87

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