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单增李斯特菌感染依赖溶血素LLO触发ERK1/2磷酸化机制研究

2020-12-24阅读(451)

单增李斯特菌感染依赖溶血素LLO触发ERK1/2磷酸化机制研究

论文摘要

单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是一种革兰氏阳性胞内菌。该菌含有溶血素O（Listeriolysin O,LLO）,可引起宿主细胞膜结构穿孔,对于单增李斯特菌在细胞内复制至关重要。前期有研究发现,单增李斯特菌感染宿主细胞后,LLO能引起丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族蛋白ERK1/2磷酸化,但机制未知。本研究以单增李斯特菌感染Caco-2细胞为模型解析ERK1/2被磷酸化的分子机制。我们分别利用单增李斯特菌和纯化的重组LLO蛋白（5n M）感染或处理Caco-2细胞,检测ERK1/2的表达及磷酸化水平变化。我们发现,单增李斯特菌感染Caco-2细胞后能显著增加ERK1/2的磷酸化水平,并在感染或处理半个小时后达到高峰且呈LLO依赖性。该ERK1/2的磷酸化水平与细胞内LLO的浓度呈正相关,当用胆固醇封闭LLO对宿主细胞的膜结合位点后,LLO丧失启动ERK1/2磷酸化的能力。我们也发现,LLO缺失活性位点PEST序列并不影响其激活ERK1/2磷酸化,这说明LLO启动ERK1/2的磷酸化与LLO与宿主细胞的膜结合位点有关而与活性位点无关。进一步研究表明,当LLO与宿主细胞的膜结合位点关键氨基酸突变（LLOT515AL516A）后,即使在高浓度LLO（>20n M）的情况下也无法触发胞内ERK1/2磷酸化,这说明LLO进入宿主细胞是启动ERK1/2磷酸化的关键步骤。为此,我们利用可以控制进入细胞的LLO突变体LLON478AV479A处理Caco-2细胞,我们发现LLO突变体LLON478AV479A启动ERK1/2磷酸化完全取决于细胞膜的完整性。为此,我们借助碘化丙啶追踪细胞膜的完整性,我们发现当LLON478AV479A的浓度（5n M）不足以破坏细胞膜的完整性时,ERK1/2不发生磷酸化,但当LLON478AV479A的浓度（20n M）达到破坏细胞膜的完整性时,ERK1/2磷酸化被启动。这说明LLO蛋白触发ERK1/2磷酸化是在宿主细胞浆完成的,而不是在细胞膜上完成的。此外,我们还发现缺失LLO或者表达LLOT515AL516A的单增李斯特菌在小鼠巨噬细胞内丧失增殖能力,但噬斑实验表明表达LLOT515AL516A的单增李斯特菌依然具有细胞毒性并能够进行胞间扩散,这说明单增李斯特菌感染宿主细胞与细菌数量和LLO的膜结合能力有关。综上,本研究发现单增李斯特菌感染宿主细胞通过LLO诱导ERK1/2磷酸化高度依赖于宿主细胞膜的完整性,其中T515、L516为LLO触发ERK1/2的磷酸化的关键氨基酸位点。本研究结果对于深入阐明单增李斯特菌感染与宿主信号通路之间的内在机制以及革兰氏阳性食源性胞内菌的污染防控和公共卫生具有重要意义。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一部分 文献综述
  •   1 李斯特菌概述
  •   2 单增李斯特菌感染机制
  •   3 穿孔毒素概述
  •     3.1 胆固醇依赖性胞质溶素概述
  •     3.2 溶血素O研究进展
  •   4 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联反应及其激活概述
  •     4.1 MAPKs协助机体抗细菌感染简述
  •     4.2 病原体对MAPK信号传导的调节
  • 第二部分 试验研究
  •   第一章 单增李斯特菌感染依赖LLO介导ERK1/2 磷酸化的研究
  •     1 材料与方法
  •       1.1 菌株及培养条件
  •       1.2 细胞及培养条件
  •       1.3 试剂及仪器
  •       1.4 试剂配制
  •       1.5 重组蛋白LLO的表达纯化及透析
  •       1.6 单增李斯特菌的Caco-2细胞感染试验
  •       1.7 单增李斯特菌LLO蛋白处理Caco-2 细胞试验
  •       1.8 ERK1/2 蛋白磷酸化的Western blot分析
  •     2 试验结果
  •       2.1 单增李斯特菌感染Caco-2 细胞活化ERK1/2 蛋白分析
  •       2.2 重组蛋白LLO处理Caco-2 细胞活化ERK1/2 蛋白分析
  •     3 讨论
  •   第二章 单增李斯特菌LLO激活ERK1/2 磷酸化不依赖其PEST序列
  •     1 材料与方法
  •       1.1 菌株及培养条件
  •       1.2 细胞及培养条件
  •       1.3 试剂订购
  •       1.4 试验仪器
  •       1.5 试剂配制
  •       1.6 E.coli感受态细胞的制备
  •       1.7 EGD-e基因组DNA的提取
  •       1.8 LLO缺失PEST序列的重组蛋白LLOΔPEST的构建
  •       1.9 LLO及其PEST序列缺失蛋白的表达与纯化
  •       1.10 重组蛋白溶血活性检测
  •       1.11 碘化丙啶细胞染色试验
  •       1.12 单增李斯特菌LLO蛋白处理Caco-2 细胞试验
  •       1.13 ERK1/2 蛋白磷酸化的Western blot分析
  •     2 试验结果
  •       2.1 PEST序列不影响LLO激活ERK1/2 磷酸化
  •       2.2 LLO对细胞膜的裂解能力与其含量成正比
  •       2.3 胆固醇抑制LLO激活ERK1/2 磷酸化
  •     3 讨论
  •   第三章 单增李斯特菌LLO激活ERK1/2 磷酸化依赖其膜裂解功能研究
  •     1 材料与方法
  •       1.1 菌株及培养条件
  •       1.2 细胞及培养条件
  •       1.3 试剂订购
  •       1.4 试验仪器
  •       1.5 试剂配制
  •       1.6 LLOT515L516位点双突变的重组蛋白的构建
  •       1.7 缺失hly的单增李斯特菌感受态细胞的制备
  •       1.8 hly回补突变株的构建
  •       1.9 单增李斯特菌回补质粒电转程序
  •       1.10 LLO及其突变蛋白的表达纯化与透析
  •       1.11 重组蛋白溶血活性检测
  •       1.12 单增李斯特菌hly突变株蛋白表达水平验证
  •       1.13 单增李斯特菌的溶血活性检测
  •       1.14 单增李斯特菌hly各突变株的体外生长曲线测定
  •       1.15 碘化丙啶细胞染色试验
  •       1.16 单增李斯特菌感染Caco-2细胞试验
  •       1.17 单增李斯特菌LLO蛋白处理Caco-2 细胞试验
  •       1.18 Western blot试验
  •     2 试验结果
  •       2.1 LLOT515AL516A丧失溶血活性
  •       2.2 LLO的膜裂解活性影响其激活ERK1/2 磷酸化
  •       2.3 李斯特菌突变株CΔhlyT515AL516A不能激活ERK1/2 磷酸化
  •     3 讨论
  •   第四章 单增李斯特菌介导ERK1/2磷酸化与其感染能力相关
  •     1 材料与方法
  •       1.1 菌株及培养条件
  •       1.2 细胞种类及培养条件
  •       1.3 试剂购买
  •       1.4 空斑试验
  •       1.5 细菌毒性试验
  •       1.6 细菌的胞内增殖试验
  •       1.7 细菌的小鼠体内脏器增殖试验
  •     2 试验结果
  •       2.1 单增李斯特菌突变株CΔhlyT515AL516A胞间扩散能力减弱
  •       2.2 单增李斯特菌突变株CΔhlyT515AL516A胞内增殖能力减弱
  •       2.3 单增李斯特菌突变株CΔhlyT515AL516A小鼠体内脏器增殖能力减弱
  •       2.4 单增李斯特菌突变株CΔhlyT515AL516A具有细胞毒性
  •     3 讨论
  • 第三部分 结论与展望
  •   结论与展望
  • 参考文献
  • 附录1 中英文对照表
  • 附录2 试验所需引物
  • 个人简历
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 马天天

    导师: 宋厚辉,程昌勇

    关键词: 单核细胞增多性李斯特菌,溶血素,膜裂解活性,磷酸化

    来源: 浙江农林大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 浙江农林大学

    基金: 国家自然科学基金(31872620),国家自然科学基金(31770040)

    分类号: S852.61

    DOI: 10.27756/d.cnki.gzjlx.2019.000288

    总页数: 65

    文件大小: 3239k

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