何林[1]2003年在《朱砂叶螨（Tetranychus Cinnabarinus）抗药性机理及抗性适合度研究》文中研究表明农药的应用与许多现代科学技术的应用一样，在给人类带来好处的同时也带来了副作用，其中有害生物的抗药性就是人们在病、虫、草等有害生物防治中所面临的一场严峻挑战。为此，人们不得不进行有害生物抗药性的研究，而害虫抗药性的研究则一直是有害生物抗药性研究中最活跃的领域。 螨类因其繁殖力强，世代周期短，活动范围小，近亲交配率高，受药机会多，其抗药性问题甚至比其他农作物害虫更见突出。朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是我国分布广泛，在棉花及多种蔬菜作物上为害严重而又难于防治的一种害螨。该螨在我国绝大部分地区都已产生抗药性。特别是近几年来，部分棉区大力推广应用转基因棉，虽然棉铃虫的发生危害受到很大抑制，但是棉蚜、棉叶螨为害问题更显突出，这一信号不能不使植保工作者感到忧心。研究朱砂叶螨对常用杀螨剂的抗性发展趋势，分析其抗药性遗传方式，明确其抗性发生机制，比较敏感、抗药性品系的生态适合度，估计其抗药性现实遗传力并作出抗药性风险评估，对制订螨类抗药性治理方案和充实有害生物抗药性研究内容有着重要的理论和实际意义。本项研究得到了国家自然科学基金(39970493)资助。通过3年多的努力，获得了以下主要研究结果。 1 朱砂叶螨抗药性品系选育及抗性发展趋势 1．1 朱砂叶螨抗药性品系选育 本文选用3种新型杀虫(螨)剂(insecticide,acaricide)，即菊酯类的甲氰菊酯、生物源类的阿维菌素和杂环类的哒螨灵进行朱砂叶螨室内抗性品系选育。朱砂叶螨敏感品系(SS)最初采自北碚区田间的豇豆苗上，已在人工气候室内用盆栽豇豆苗饲养了5年约100代。从敏感品系中分出7个同源亚品系，其中3个亚品系分别用甲氰菊酯、阿维菌素和哒螨灵单一连续汰选，分别记为FeR、AbR和PyR品系，2个亚品系分别用两种混剂(甲氰·阿维混剂和哒螨·阿维混剂)单一连续处理，分别记为Fe-AbR和Py-AbR品系；最后2个亚品系分别用两种不同的药剂轮换组合(甲氰、阿维轮换及哒螨、阿维轮换)处理，分别记为Fe/AbR和Pv/AbR品系。经过约40余代的筛选，朱砂叶螨对不同药剂及药剂组合发生了不同的选择反应。 单剂筛选：分别用甲氰菊酯、阿维菌素和哒螨灵单一连续用药40、42和48代，朱砂叶螨对叁者的抗性系数分别为68.5、8.7和0.8，这表明朱砂叶螨对菊酯类药剂甲氰菊酯的抗性 中 文 摘 要发展最快，其次是对生物源农药阿维菌素，而对杂环类药剂Its螨灵没有产生抗药性。另外，从各次毒力回归线的b值分析，如果继续用药，朱砂叶螨对甲氰菊酯和阿维菌素的抗性还会上升，但抗性发展速率比较缓慢，对啦螨灵可能会停留在敏感性降低阶段。 混剂筛选：用啦螨·阿维混剂筛选40代，朱砂叶螨对其产生了6．7倍抗性，而对组成该混剂的两单剂呸螨灵和阿维菌素没有产生抗性，对二者的抗性系数分别为1．0和1．1；用甲氰·阿维混剂筛选40代，抗性系数为1J，对两单剂甲氰菊酯和阿维菌素的抗性分别达5．7和1．0倍。 轮换组合筛选：分别用啦螨灵、阿维菌素轮换筛选26代（共计52代），朱砂叶螨对咯螨灵、阿维菌素的抗性分别为1．4倍和2．5倍；分别用甲氰菊酯、阿维菌素轮换筛选26代（共计52代），朱砂叶螨对甲氰菊酯、阿维菌素的抗性系数分别为28．7和ID。 笔者最终筛选成功叁个抗性品系，即朱砂叶螨甲氰菊酪抗性品系（FeR）、阿维菌素抗性品系（AbR）和啦螨·阿维混剂抗性品系（Py－AbR）。1．2抗性个体频率对抗性进化的影响 根据敏感品系的毒力基线确定诊断剂量，用诊断剂量法测定了北磅田间种群及室内各抗性筛选品系对各药剂的抗性个体频率。朱砂叶螨北腊田间种群对甲氰菊酯、阿维菌素、呸螨灵、its螨·阿维混剂和甲氰·阿维棍剂的抗药性个体频率分别为21．2％、16．4％、0％、2．So／o和0O，室内各对应的抗性筛选品系的抗性频率分别为58．0％、64．9％、0％、37．8o和0％。此结果表明，正是由于朱砂叶螨北砖田间种群缺乏抗呛螨灵和抗甲氰·阿维混剂的个体，所以才不能从来源于田间种群的室内敏感品系筛选出对贴螨灵和甲氰·阿维混剂的抗药性品系。2朱砂叶螨抗药性形式遗传研究 通过正交、反交和回交获得遗传后代并用LD－P线法研究了朱砂叶螨抗甲氰菊酯品系、抗阿维菌素品系的抗药性遗传形式。结果表明朱砂叶螨对甲氰菊酯的抗药性为单基因不完全隐性遗传，并且抗性遗传可能还存在母体影响或核外效应；朱砂叶螨对阿维菌素的抗性遗传形式为多基因不完全隐性或半隐性遗传，抗性遗传没有母体影响或核外效应。3抗药性朱砂叶螨生物学及实验种群生态学研究、3＊抗药性朱砂叶螨生物学研究 研究了不同温度梯度（15’C、20’C、25’C、28’C、31’C、34C、36t）朱砂叶螨敏感品 2 西南农业人学博上学位论文系及两个单剂抗性品系（FeR PI AbR）和同一温度（26 OC）条件朱砂叶螨叁个单剂抗性筛选品系（FeR、AbR和 PyR）的世代发育及生
冯晓姣, 卜春亚, 师光禄, 高品, 王有年[2]2014年在《朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶基因的克隆与特征分析》文中研究表明乙酰胆碱酯酶(AChE)是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫(螨)剂的主要作用靶标,为建立以朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)AChE为靶点的杀螨剂体外筛选体系,本研究拟克隆朱砂叶螨AChE基因,并分析其特征.采用同源基因克隆及RACE技术克隆基因,通过荧光定量PCR分析其表达特征.结果获得朱砂叶螨AChE的cDNA序列长为2 512 bp,其中开放阅读框(ORF)为2 064 bp,编码687个氨基酸,N端有信号肽,剪切位点在甲硫氨酸开始的第74-75个氨基酸残基之间,C端有糖酯锚定结构,GenBank登录号为AGI96546.1.序列分析显示朱砂叶螨与其他蜱螨目的AChE有高度的同源性,特别与同属叶螨属的二斑叶螨(Tetranychus urticae)AChE的同源性最高,但氨基酸序列比较分析显示两者酶的催化特性可能存在区别.朱砂叶螨不同发育期AChE的转录水平比较分析显示幼螨期的表达量最高,且从幼螨期开始表达量逐渐下降,成螨期最低.本研究表明朱砂叶螨与二斑叶螨的ace 1有较高的同源性,但酶特性存在差异,朱砂叶螨不同发育时期ace 1基因表达水平的不同可能与不同发育期螨的习性和代谢特性有关.
冯楷阳[3]2017年在《朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性形式遗传及抗性稳定性研究》文中研究指明朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种重要的农业害螨,可为害豇豆、茄子、花卉等百余种农业、经济作物。该螨具有繁殖力强、世代周期短、活动范围小等生物学特点,加之杀螨剂大量不科学的使用,使其抗药性问题尤为严重。丁氟螨酯是一种新型杀螨剂,在我国上市晚,还未广泛使用。该药剂杀螨活性高,对非靶标生物安全,具有成为未来主流杀螨剂的潜力。本论文通过长期在室内进行朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性筛选,分析了朱砂叶螨丁氟螨酯抗性品系的抗性遗传方式、适合度、抗性稳定性,并评估了丁氟螨酯的抗性风险,研究结果为丁氟螨酯的合理使用以及抗性治理的有效开展奠定了理论基础。本文主要研究内容与结果如下:1.以敏感品系(SS)为源头,室内经过97代筛选获得丁氟螨酯抗性品系(CyR),其LC50值由2.19mg/L上升到58.80mg/L,相对于室内敏感品系抗性倍数为26.85倍。2.利用丁氟螨酯抗性品系与敏感品系进行杂交和回交,明确其抗药性遗传形式,结果表明:F1代正交(CyR_80♀×SS♂)及反交(SS♀×CyR_80♂)所得显性度DRS和DSR分别为-0.24和-0.32,表明朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性为不完全隐性遗传;t测验得出正反交所得D值的95%置信限重迭,不存在显着性差异,表明抗性基因位于常染色体上;回交F2代期望值与实际LD-P曲线及χ2值存在明显差异,表明抗性受多对等位基因控制。3.通过构建抗性品系(CyR)与敏感品系(SS)的生命表,逐日统计其生长发育情况,计算生物学参数,发现CyR品系的生殖力及存活率均低于SS品系,相对适合度(RR/SS)Rf=0.88<1,表明CyR品系存在一定的抗性适合度代价。4.通过从CyR_85中分出一支亚系,去除其药剂筛选压,研究了朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性稳定性。主要以下叁方面来评价:首先在药剂敏感性方面,抗性亚系(CyR_D)在停止药剂筛选后仅过了5代,其LC50从47.34mg/L下降到11.35mg/L,抗性倍数从21.6倍下降到5.2倍,12代后抗性倍数又下降至3.8倍,表明去除药剂压力后,CyR_D对丁氟螨酯的药剂敏感性逐渐恢复。其次从生理生化方面,CyR_D在停止药剂筛选的情况下仅过了5代,叁大解毒酶GSTs、MFO、CarE酶活性均发生显着性下降,12代后MFO和CarE酶活性下降到敏感水平。表明去除药剂压力后,CyR_D解毒酶活性会逐渐下降。分子生物学方面,结合高通量测序及qPCR验证的结果,鉴定出10条可能与丁氟螨酯抗性相关的解毒酶基因,在停止筛选后的不同阶段测定其mRNA表达量,发现TCGST-M2、TCGST-M3、TCGST-M4,TCCarE-4、TCCarE-14,CYP389C11、CYP392D6、CYP385C2,8条原本显着性上调表达的基因在停止筛选12代后表达量较原表达水显着性下降,2条显着性下调的基因TCCarE-12、TCCarE-23较原表达水平显着上升,表明去除药剂压力后,CyR_D解毒酶基因mRNA表达量呈现不稳定性,会逐渐变化至与敏感品系相当的水平。药剂敏感性,解毒酶活性及相关解毒酶基因mRNA表达量叁方面的结果均表明朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗药性不稳定。5.应用数量遗传学方法估算出朱砂叶螨丁氟螨酯抗性品系的抗性现实遗传力h2=0.005,表明其对丁氟螨酯的抗性发展较为缓慢。抗性风险评估表明,在70%-90%致死率的药剂筛选压力下,朱砂叶螨对丁氟螨酯产生10倍抗性需13-36代。通过测定朱砂叶螨丁氟螨酯抗性品系与5种不同作用杀虫杀螨剂的交互抗性,发现丁氟螨酯与甲氰菊酯、阿维菌素、联苯肼酯、炔螨特之间无交互抗性,而与哒螨灵会产生明显的交互抗性,在农业害螨防治中应当避免丁氟螨酯与哒螨灵的混用、轮用等。本论文研究结果表明:朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性发展较为缓慢,去除药剂压力后,已产生的抗药性会迅速衰退;多基因、不完全隐性的抗性遗传形式及适合度代价使得抗药性基因在种群间传播不利,抗性种群发展慢。综上所述,丁氟螨酯在防治朱砂叶螨时抗性风险较小。
罗雁婕[4]2013年在《谷胱甘肽S-转移酶介导的朱砂叶螨对炔螨特抗药性研究》文中研究表明朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus (Boisduval)属蛛形纲Arachnida蜱螨目Acarina叶螨科Tetranychidae叶螨属Tetranychus,是一种寄主广泛的世界性重要害螨,危害包括棉花、花卉、果树和蔬菜在内的多种植物,朱砂叶螨也是桑园重要的植食性害螨,近年来,发生危害日益严重。目前化学防治仍是害螨的主要防控手段,但由于螨类繁殖力强、世代周期短等自身特点,以及不合理使用杀虫杀螨剂,导致其抗药性问题日趋严重,已经发展成为世界上抗药性最严重的害螨之一。作为一种传统的杀螨剂,炔螨特具有高效、低毒、广谱的特点,自1964年推出以来便被广泛应用于各种农林害螨的防治。虽然长期使用该药剂,但抗药性监测表明橘全爪螨、朱砂叶螨等螨类对炔螨特并未产生抗性。未来几年内,炔螨特仍是螨类防控的主打药剂之一。目前,对该药剂的研究主要集中在农药残留和环境毒理学等方面,而关于害虫对炔螨特的抗药性却没有系统研究报道。因此,深入了解炔螨特的作用机理,评估螨类对该药剂的抗性风险,对害虫害螨抗药性产生机制和治理对策的深入研究具有重要的基础作用。本学位论文以重要害螨朱砂叶螨为研究对象,针对螨类防治中可能出现的抗药性这一农业生产实际问题,开展对云南桑园朱砂叶螨不同种群的抗药性测定,首次明确了云南桑园朱砂叶螨抗药性水平；在室内选育了朱砂叶螨炔螨特抗性品系,并对其抗性现实遗传力和抗性风险进行估测,揭示了朱砂叶螨对炔螨特的抗性发展规律；在基于对抗性品系生理生化特性分析的基础上,明确了以朱砂叶螨体内重要解毒代谢酶系GSTs作为炔螨特代谢抗性主导因子,并进一步开展了其分子生物学特性分析,克隆了朱砂叶螨GSTS基因,比较分析抗性和敏感品系mRNA水平表达差异,进行了异源表达研究。从种群生物学到分子生物学综合分析朱砂叶螨对炔螨特抗性机制,明确了以GSTs介导的朱砂叶螨对炔螨特代谢抗性机制,对解决农业生产问题和丰富农业害虫害螨抗药性研究理论等都具有实际意义。通过叁年多的研究工作,主要取得以下研究结果：1.云南桑园朱砂叶螨不同种群抗药性测定根据国际杀虫剂抗性委员会(Insecti cide Resistance Action Committee, IRAC)对杀虫杀螨剂作用机制分类,选择5类7个常用药剂,采用FAO(1980)推荐的玻片浸渍法(Slide-dip method)对云南7个蚕桑主产区桑园朱砂叶螨种群进行抗药性测定,并检测了主要代谢解毒酶羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和细胞色素P450单加氧酶(P450)的活性及动力学参数。结果表明,云南桑园朱砂叶螨种群总体上对7种药剂仍处于低到中抗水平。蒙自和祥云朱砂叶螨田间种群对辛硫磷的相对抗性倍数分别为31.45和26.22,已达到中等抗性水平；陆良、蒙自、鹤庆和巧家田间朱砂叶螨种群对溴虫腈的相对抗性倍数分别为22.52、19.05、16.28和14.98,达到低抗水平。朱砂叶螨各地方种群对阿维菌素比较敏感；各田间种群对长期使用的敌敌畏、灭多威、哒螨灵和炔螨特的抗性倍数在10倍以下,说明上仍可作用于桑树上。将朱砂叶螨田间种群对常用杀虫杀螨剂的相对抗性比进行Spearman's rank相关性分析发现,阿维菌素和灭多威呈显着负相关(rs=-0.857),这对田间药剂轮用具有重要参考价值。分别比较朱砂叶螨各田间种群CarE、GSTs和P450比活力与敏感品系相对比值发现,GSTs比值范围在6.44-117.96之间,CarE为1.53-29.87倍,P450为1.12-2.67倍,各田间种群体内GSTs和CarE的活性相对较高。2.朱砂叶螨炔螨特抗性品系的选育及抗性特点2.1朱砂叶螨炔螨特抗性品系的选育以2000年采自重庆北碚区田间,对在室内未接触任何药剂饲养10多年的朱砂叶螨敏感品系进行抗药性筛选,选育朱砂叶螨炔螨特抗性品系。经炔螨特不连续(F1-F23)和连续(F24-F34)筛选共34代后,得到炔螨特相对抗性品系,其抗性倍数达30.669。在炔螨特选择压力下,朱砂叶螨产生抗性的速率较慢,截止汰选至第34代,其毒力回归方程的斜率b值逐渐减小。分析炔螨特选育过程中不同选育方式(连续用药与不连续用药)对炔螨特抗性进化的影响发现,不连续用药筛选(F1-F23)23代现实遗传力(h2)为0.047,连续筛选(F24-F34)10代的现实遗传力(h2)为0.055,连续药剂选择压力下的朱砂叶螨对炔螨特的现实遗传力(h2)大于不连续用药的抗性遗传力。连续药剂选择压力下的朱砂叶螨对炔螨特的抗性进化速率高于不连续用药选择。根据现实遗传力预测抗性提高10倍出现的时间,若药剂防治平均杀死率为50%-90%时,在不连续药剂情况下,朱砂叶螨抗性提高10倍需要53-21代,连续用药则需要46-18代。2.2朱砂叶螨炔螨特抗性品系的相对适合度采用叶碟饲养法组建朱砂叶螨敏感品系(F0)和抗性品系(F34)的生命生殖力表,进行种群参数和适合度分析。朱砂叶螨经炔螨特筛选34代后,其抗性倍数达30.669倍,与敏感品系相比,炔螨特抗性品系卵期、若螨期和产卵前期延长,幼螨期缩短,在整个世代历期上,完成世代大概需要11.117d,敏感品系为10.581d,无显着差异。抗性品系每雌产卵量少于敏感品系,卵孵化率低于敏感品系,但差异并不显着。种群参数分析表明,抗性品系的内禀增长率(rm)为0.243,略低于敏感品系(0.257),抗性品系的净生殖率(Rn)为28.990,略高于敏感品系(25.342)。以Rn比值比较朱砂叶螨抗性品系的适合度,抗性品系适合度为1.144,与敏感品系无明显差异,表明朱砂叶螨敏感品系经过炔螨特筛选后形成的抗性品系(F34)并未出现适合度缺陷。2.3朱砂叶螨对炔螨特抗性生化机制使用玻片浸渍法(Slide-dip method)分别对炔螨特抗性选育过程中的朱砂叶螨F26(RR=10.80)和F34(RR=30.669)进行交互抗性测定,结果显示在抗性筛选过程中,朱砂叶螨炔螨特抗性品系对辛硫磷、哒螨灵和溴虫腈表现出不同程度的交互抗性,对丁醚脲、敌敌畏和阿维菌素未产生明显的交互抗性。在酶特异性抑制实验中,运用玻片浸渍法(Slide-dip method)分别测定了敏感品系和抗性品系(F34)雌成螨中,羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和细胞色素P450(P450)的特异性酶抑制剂—磷酸叁苯酯(TPP)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM)和增效醚(PBO)对炔螨特的增效作用。叁种特异性酶抑制剂对敏感品系朱砂叶螨雌成螨没有增效作用,在抗性品系(F34)中,TPP和PBO对炔螨特的增效比分别为1.059和1.471,增效作用不明显,而DEM的增效作用相对明显,增效比达2.583。在此基础上,进一步运用喷雾法(Potter spray method)测定两个品系内各个发育阶段螨态中,DEM对炔螨特的增效作用,结果显示DEM对敏感品系各螨态朱砂叶螨没有增效作用,在抗性品系(F34)的卵、幼螨、若螨中,DEM对炔螨特的增效比分别为1.269、1.164、1.092,增效作用不明显,而在成螨中的增效作用相对明显,增效比达1.9916。根据酶特异性抑制剂实验结果,比较两个品系内GSTs酶活性差异,当底物分别为GSH和CDNB时,朱砂叶螨抗性品系(F34)的GSTs比活力分别是敏感品系的1.982倍和2.719倍。综上,酶特异性抑制剂和酶活性实验表明,GSTs在朱砂叶螨对炔螨特的解毒代谢中发挥了重要作用,可能与其抗性密切相关,且在朱砂叶螨不同品系和不同发育阶段中的作用存在差异,这将在后一部分研究中在分子生物学水平探讨。3.朱砂叶螨GSTs基因的克隆及其mRNA的表达模式3.1朱砂叶螨GSTs基因cDNA克隆及序列分析参考朱砂叶螨的近缘种二斑叶螨全基因组信息,利用RT-PCR技术,从朱砂叶螨体内克隆获得了12个GSTs基因cDNA序列,并比对确定了这12个GSTs基因的开放阅读框,对其编码的氨基酸序列进行了推导。根据与其他物种的序列相似性和聚类分析结果,将其中的2个基因归类于Delta家族,5个基因归类于Mu家族,2个基因归类于Omega家族,以及Kappa和Zeta家族基因各1个,余下的1个基因则不能划分在已知的类型中,暂将其归为未分类家族Unclassified。2个Delta家族基因间的氨基酸同源性为88.58%,5个Mu家族基因间的氨基酸的同源性范围介于41.26-98.67%,2个Omega家族基因的氨基酸同源性为45.38%,而在任意的非同一家族之间,氨基酸序列同源性在5.07-18.52%之间。根据命名法则命名这些GSTs基因并在GenBank上登录,其名称和登录号分别为：TcGSTd1(KF421142)、TcGSTd2(KF421143)、TcGSTm1(KF421144)、TcGSTm2(KF421149)、TcGSTm3(KF421146)、 TcGSTm4(KF421147)、TcGSTm5(KF421148)、TcGSTol (KF421150)、TcGSTo2(KF421151)、TcGSTz1(KF421153)、TcGSTkl (KF421152)、TcGSTu2(KF421145).克隆所获得的12个GSTs基因编码区长度范围是651-735bp,编码216-244个氨基酸,相对分子量为24.19-28.95kDa,理论等电点的范围是5.97-8.99,TMHMM2.0跨膜预测显示12个基因编码的氨基酸序列不存在跨膜结构域,易于分离纯化。ScanProsite推测氨基酸保守功能域表明,这些基因N-端结构域高度保守,具有多个GSH的结合位点。将克隆获得的朱砂叶螨各家族GSTs基因同黑腹果蝇、橘全爪螨、二斑叶螨等物种氨基酸序列进行多重比较,结果显示朱砂叶螨Delta家族的GSTs氨基酸序列相对保守,具有与其他物种相同的催化活性中心丝氨酸S、天冬酰胺N以及决定蛋白折迭的氨基酸脯氨酸P、亮氨酸L、甘氨酸G、天冬氨酸D。朱砂叶螨Mu家族GSTs基因同样相对保守,具有催化活性中心酪氨酸Y,以及决定蛋白折迭的苏氨酸T、苯丙氨酸F以及AILRYLARKH特征基序。朱砂叶螨Omega家族GSTs的关键残基半胱氨酸C代表GSH的催化位点,N-端结构域非常保守,特征基序是ESLIIAEYL。3.2朱砂叶螨RT-qPCR内参基因筛选运用geNorm和NormFinder软件,对6个看家基因a-TUB、RPS18、EF1α、5.8SrRNA、SDHA、GAPDH在朱砂叶螨不同发育阶段(卵、幼螨、若螨和雌成螨)和不同品系(敏感品系F0和炔螨特抗性品系F34)中的稳定性进行评价。结果分析表明,在朱砂叶螨不同发育阶段中,稳定性较好的是RPS18和GADPH,在不同品系中,经筛选表达最稳定的是a-TUB和RPS18,综合考虑评价结果,选用RPS18作为内参基因用于后续实验。3.3朱砂叶螨不同发育阶段GSTs基因的表达模式运用定量PCR技术(quantitative real-time PCR, qPCR),以朱砂叶螨RPS18作为内参基因,对所克隆的8个GSTs基因在不同发育阶段(卵、幼螨、若螨、雌成螨)mRNA表达水平进行了相对定量分析。在朱砂叶螨敏感品系中,Delta家族的2个基因TcGSTd1和TcGSTd2在幼螨和若螨阶段的相对卵期的表达量上调,在若螨期明显高于卵期,随后在成螨阶段下降。而在朱砂叶螨抗性品系中,这2个基因在幼螨、若螨和成螨阶段随着发育历期的增加其相对表达量明显上调,在成螨达到最高。朱砂叶螨敏感品系Mu家族5个GSTs基因中,TcGSTm1、TcGSTm2、TcGSTm3、TcGSTm4在幼螨的相对表达量显着高于其余叁个发育阶段,随后降低,最终在成螨期的表达量与卵期相当；TcGSTm5基因的相对表达量随着发育阶段的增加而逐渐升高,若螨阶段表达量达到最高；TcGSTz1基因在4个螨态中的相对表达量没有较大波动。在抗性品系中,TcGSTm1、TcGSTm2、TcGSTm4随着发育历期的增加其表达量上调,在若螨期达到高峰,然后在成螨阶段的相对表达量降低,但还是高于卵期的表达量；TcGSTm3在幼螨阶段的表达量显着增高,随后在若螨阶段突然下调后在成螨其恢复到与卵期相当的水平。TcGSTm5基因的相对表达量随着发育阶段的增加而逐渐上调；TcGSTz1基因在朱砂叶螨卵期、幼螨和成螨期的相对表达量略有上调,其显着表达高峰出现在若螨期。由上述基因在朱砂叶螨不同发育阶段的表达模式推测,TcGSTd1和TcGSTd2不仅参与了朱砂叶螨正常的生长发育活动,而且在成螨阶段在该螨对炔螨特的抗性中发挥了重要作用,Mu家族5个GSTs基因也不同程度地参与了朱砂叶螨对炔螨特的抗性。3.4朱砂叶螨不同品系GSTs基因的表达模式运用实时定量PCR技术,以朱砂叶螨RPS18作为内参基因,对所克隆的8个GSTs基因在敏感品系和炔螨特抗性品系(F34)mRNA表达水平进行相对定量分析。结果表明,相对于敏感品系,8个GSTs基因在朱砂叶螨抗性品系中总体趋势表现为卵期和幼螨期表达下调,而若螨和成螨期显着上调。在卵期,朱砂叶螨抗炔螨特品系的TcGSTd2基因的相对表达显着下降,推测该基因参与了螨类在这一阶段的生理活动。在幼螨期,朱砂叶螨抗炔螨特品系Delta家族的2个GSTs基因TcGSTd1和Mu家族的4个GSTs基因TcGSTm1、TcGSTm2、TcGSTm4基因相对表达量显着下调,推测这几个基因在这一螨态发挥了重要生理功能。在若螨和成螨期,8个GSTs基因的相对表达量都上调,其中TcGSTd1、TcGSTd2、TcGSTm、 TcGSTm2、TcGSTm4和TcGSTm5显着增加,表明这些基因参与了该螨的生理功能和抗药性的形成。3.5朱砂叶螨GSTs基因的原核表达载体构建利用限制性内切酶Nde I和Xho I的双酶切以及DNA重组技术成功构建了朱砂叶螨TcGSTm2基因基于pET30a(+)的原核表达载体,为进一步深入研究GSTm蛋白质特性和功能研究奠定了基础。综上所述,本研究开展了对云南桑园朱砂叶螨不同田间种群的抗药性测定,在室内继代选育朱砂叶螨炔螨特抗性种群,获得抗性倍数达30.669的相对抗性品系,以该品系和敏感品系为基础,研究了朱砂叶螨对炔螨特的抗性发展趋势,对其抗性现实遗传力和抗性风险进行评估,在对抗性品系酶特异性抑制实验和生理生化特性分析基础上,确定了朱砂叶螨体内重要解毒代谢酶系GSTs是作为炔螨特抗性机制的主导因子,以此为基础,在分子水平上进一步解析GSTs基因在朱砂叶螨对炔螨特的抗性分子机制中的作用。运用分子生物学技术,克隆了12个朱砂叶螨GSTs基因,分析了这些基因的分子生物学特性。并采用geNorm和NormFinder软件确定了朱砂叶螨不同发育阶段和不同品系的最适内参基因。采用qPCR技术,解析了本研究所克隆的8个GSTs基因在朱砂叶螨敏感品系和炔螨特抗性品系mRNA水平表达模式和差异,揭示了这些基因在朱砂叶螨抗性过程中发挥的作用。成功构建了朱砂叶螨TcGSTm2基因基于pET30a(+)的原核表达载体,为GSTs基因的异源表达和蛋白质特性研究奠定基础。本研究应用生物学、生理生化和分子生物学知识和技术,全面解析了GSTs介导的朱砂叶螨对炔螨特的抗性机制,为朱砂叶螨的抗药性治理和炔螨特的可持续应用提供理论
卢文才[5]2017年在《二斑叶螨对朱砂叶螨竞争性扩张的毒理学机制研究》文中指出二斑叶螨(Tetranychus urticae)和朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)同属于蛛形纲、叶螨科、叶螨属,都是重要的农业害螨,但二者的分类地位长期存在争议。在中国,一般认为朱砂叶螨为国内本地种,二斑叶螨为外来入侵种。二斑叶螨在中国相对于朱砂叶螨竞争性扩张是一例典型的生物入侵事件,但有关其持续扩张并逐渐替代本地种朱砂叶螨的原因,迄今缺乏系统的研究和报道。现有的关于二斑叶螨和朱砂叶螨的零星比较研究中,比较一致的结果是相对于朱砂叶螨,二斑叶螨更耐药。据此,我们提出一个科学假设,即二斑叶螨更强的药剂胁迫适应能力是其持续扩张并逐渐成为叶螨优势种群的重要原因。因此,本论文以二斑叶螨和朱砂叶螨为比较研究对象,以验证上述科学设想为研究目的,拟从毒理学的独特视角研究并阐明二斑叶螨在中国持续扩张的机制。获得的主要研究成果如下:1.二斑叶螨入侵后的扩张趋势分析通过检索与整理国内(1975-2014年)有关朱砂叶螨和(或)二斑叶螨的研究文献(CNKI及SCI引文数据库),追溯每篇文献中叶螨的采集地绘制不同历史时期的地理分布图。发现以1983年为起点至上世纪末,二斑叶螨的分布由北京市扩大至长江以北9省市,朱砂叶螨在全国17省市有分布;进入本世纪后,二斑叶螨已越过长江,其分布由9省市继续扩大至18省市,朱砂叶螨的分布范围则缩至12省市。通过文献检索间接重现二斑叶螨扩张趋势,结果表明入侵中国后,二斑叶螨相对于朱砂叶螨存在明显的竞争性扩张现象。2.朱砂叶螨与二斑叶螨地理种群采集及鉴定野外混合种群采集于云南省昆明市郊的玫瑰上,首先根据体色将叶螨初步区分为朱砂叶螨(红色)和二斑叶螨(绿色);再采用文献报道的足Ⅰ胫节刚毛数量统计法结合杂交试验鉴定两种叶螨。研究结果表明:二斑叶螨种群所有个体足Ⅰ胫节刚毛数量为10根,朱砂叶螨野外种群和室内品系足Ⅰ胫节刚毛数量为10根的个体比例分别为70%和66.7%,与报道的朱砂叶螨和二斑叶螨种群足Ⅰ胫节刚毛数量差异相吻合。杂交试验结果表明野外红色叶螨与室内朱砂叶螨,野外绿色叶螨与室内二斑叶螨能正常繁殖后代,而体色不同的两种叶螨间存在生殖隔离。3.二斑叶螨和朱砂叶螨在不同温度下的生物学特性分析组建16、26和33℃叶螨实验种群生命表,比较朱砂叶螨和二斑叶螨生物学特性和种群参数:在低温16℃,二斑叶螨相对朱砂叶螨生长发育较快且相对适合度较大(Rf为1.44),存在适合度优势;在26℃,两种叶螨发育历期和相对适合度无明显差异;33℃时,相对于朱砂叶螨,二斑叶螨的相对适合度为0.55,表明二斑叶螨在高温下存在适合度劣势。4.朱砂叶螨和二斑叶螨对药剂胁迫的反应差异比较生物测定结果表明来源相同背景的二斑叶螨相对朱砂叶螨,对阿维菌素、甲氰菊酯、炔螨特、哒螨灵、溴虫腈、吡螨胺、丁氟螨酯、联苯肼酯和乙螨唑等9种常用杀螨剂更加耐药,其中二者对阿维菌素的耐药力差异高达8.5倍。室内外模拟药剂胁迫对两种叶螨混合种群结构变化的影响:混合种群(两种叶螨个体初始比例为1:1)在室内豇豆上饲养2个月后,对照(不接触药剂)处理中朱砂叶螨数量显着多于二斑叶螨(P<0.05)(前者与后者个体数量的比例为1:0.46),而在阿维菌素和丁氟螨酯的胁迫处理中,二斑叶螨逆转为混合种群的优势种群(比例分别逆转为1:4.44和1:1.85);混合种群在田间分别在豇豆和茄子上生长一个种植季节后,对照组中的朱砂叶螨数量显着多于二斑叶螨(P<0.05),在豇豆和茄子上朱砂叶螨与二斑叶螨的比例分别为1.53:1和1.83:1,而处理组(阿维菌素防治2次)中两种叶螨数量没有显着差异。室内、外实验都表明杀螨剂的使用能显着影响混合种群中两种叶螨的比例结构,主要是表现为药剂能相对多地压制朱砂叶螨而间接促进二斑叶螨逐渐占优。分别选用丁氟螨酯和甲氰菊酯对朱砂叶螨和二斑叶螨进行室内抗性筛选,25代后,朱砂叶螨和二斑叶螨对丁氟螨酯的抗性倍数分别发展到了13.52和29.35倍,对甲氰菊酯的抗性倍数分别发展到了28.04和39.57倍。5.二斑叶螨与朱砂叶螨解毒酶活性比较酶活性检测发现二斑叶螨的P450s和Car Es活性均显着高于朱砂叶螨(P<0.05),分别为朱砂叶螨的1.81和2.80倍,二者的GSTs活性没有显着差异。分别以LC30剂量的阿维菌素、甲氰菊酯、吡螨胺诱导处理朱砂叶螨和二斑叶螨6h,叁种解毒酶活性(P450s、GSTs和Car Es)均呈现不同程度的变化:阿维菌素处理后,二斑叶螨的P450s和Car Es活性分别为诱导前的1.54和1.23倍,朱砂叶螨的P450s和Car Es活性分别为诱导前的1.14和0.96倍,且二斑叶螨酶活性升高倍数显着大于朱砂叶螨(P<0.05),两种叶螨GSTs活性变化倍数无显着差异;甲氰菊酯处理后,二斑叶螨的P450s和GSTs活性分别为诱导前的1.32和2.55倍,朱砂叶螨的分别为诱导前的1.07和1.98倍,二斑叶螨的酶活性变化倍数显着大于朱砂叶螨(P<0.05),两种叶螨的Car Es活性变化无显着差异;吡螨胺处理后,二斑叶螨的P450s活性提高幅度显着大于朱砂叶螨(P<0.05)(变化倍数分别为1.17和1.04倍),而朱砂叶螨GSTs活性变化倍数大于二斑叶螨(P<0.05)(变化倍数分别为2.32和1.61倍),两种叶螨Car Es活性变化幅度无显着差异。总体上,相对于朱砂叶螨,二斑叶螨解毒酶对药剂胁迫的响应变化更大。使用甲氰菊酯分别对朱砂叶螨和二斑叶螨筛选20代后,朱砂叶螨的GSTs活性显着升高2.41倍,P450s和Car Es活性无显着性变化;二斑叶螨的P450s和GSTs活性分别显着升高1.48和3.19倍。使用丁氟螨酯筛选20代后,朱砂叶螨的P450s和GSTs活性分别显着升高1.72和2.21倍;二斑叶螨的P450s、GSTs和Car Es升高幅度分别为1.92、5.40和2.15倍。抗性种群解毒酶活性测定结果表明,相对于朱砂叶螨,二斑叶螨中的解毒酶对药剂选择的反应更积极。6.朱砂叶螨和二斑叶螨的表达谱测序比较数字基因表达谱(DGE)测序结果表明,相对于朱砂叶螨,二斑叶螨有974条差异表达基因(DEGs)(538条基因表达上调,436条基因表达下调),其中58条注释为解毒代谢相关基因(39条基因上调表达,20条基因下调表达)。分别选用LC30剂量的阿维菌素、甲氰菊酯、吡螨胺胁迫处理朱砂叶螨和二斑叶螨,并进行表达谱测序,结果表明:阿维菌素处理后,朱砂叶螨有168条DEGs(35条基因上调表达,133条基因下调表达),二斑叶螨有268条DEGs(89条基因上调表达,179条基因下调表达);甲氰菊酯处理后,朱砂叶螨有65条DEGs(32条基因上调表达,33条基因下调表达),二斑叶螨有168条DEGs(74条基因上调表达,104条基因下调表达);吡螨胺处理后,朱砂叶螨有71条DEGs(21条基因上调表达,50条基因下调表达),二斑叶螨有179条DEGs(59条基因上调表达,120条基因下调表达)。对DEGs进行功能注释,发现二斑叶螨受杀螨剂胁迫后上调表达的解毒代谢相关基因的数量明显多于朱砂叶螨。从表达谱测序、比较可以看出,二斑叶螨相对朱砂叶螨耐药性/抗药性更强的分子基础是二斑叶螨本身拥有更多上调表达的基因,更为重要的是,遭受药剂胁迫时二斑叶螨参与响应的基因也显着多于朱砂叶螨。本论文充分地说明了来源相同背景的二斑叶螨相对朱砂叶螨具有对药剂解毒代谢能力更强的生化及分子基础,从而导致二斑叶螨对大多数杀螨剂具有更强的耐药性。我们进一步推测两种叶螨对相同杀螨剂反应差异是二斑叶螨相对朱砂叶螨在中国持续扩张的一个重要因素。更重要的是室内外模拟试验验证了杀螨剂的应用促进了二斑叶螨在混合种群相对占优。研究成果意义在于:一、理论上可为解释二斑叶螨在中国扩张为叶螨优势种群提供独特的视角、丰富入侵生物学研究内容;二、实践上可依据叶螨种群结构及药剂敏感性差异指导科学选用杀螨药剂、对叶螨进行减量增效的精准防控。
刘炎超[6]2016年在《朱砂叶螨γ-氨基丁酸与阿维菌素杀螨活性关系研究》文中研究说明朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是棉花、蔬菜等经济作物上的重要害螨,其防控主要以化学防治为主。杀螨剂阿维菌素(AVM)杀螨效果突出,具有广谱、高效、低残留和对人畜及环境安全等特点。已有的研究发现朱砂叶螨阿维菌素抗性品系(AbR)中γ-氨基丁酸(GABA)含量显着高于敏感品系(SS)。GABA是脊椎动物和非脊椎动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质,生物体内GABA含量的调控是GABA合成与分解共同平衡的结果。参与GABA合成与分解的酶分别是谷氨酸脱羧酶(GAD)与γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)。前期研究表明AbR品系中GABA-T活性显着低于SS品系,而GAD活性无显着差异。本论文在此基础上,重点研究了朱砂叶螨GABA含量与阿维菌素杀螨活性的关系,研究结果如下:1.利用RT-PCR及PCR技术,克隆获得2条GAD基因和2条GABA-T基因,分别命名为GAD~(TC1)、GAD~(TC2)、GABA-T~(TC1)和GABA-T~(TC2),GenBank登录号依次为:JQ942360、JQ798396、JQ942361和JQ942362。序列分析表明所得基因均与二斑叶螨亲缘关系最近。采用实时荧光定量PCR(qPCR)分别检测4条基因在SS品系和AbR品系中的表达情况,结果显示2条GAD基因的表达在SS和AbR品系中无显着差异,而2条GABA-T基因在Ab R品系中显着下调。以上结果与已有的酶活测定结果一致,表明朱砂叶螨AbR品系中GABA含量高于SS品系的分子机制是GABA-T基因表达下调。2.抗癫痫药物氨己烯酸(Vigabatrin)是GABA-T的特异性抑制剂,可以利用Vigabatrin抑制GABA-T活性,提高朱砂叶螨SS品系GABA含量的方法来研究GABA与阿维菌素杀螨活性的关系。GABA-T酶活性测定结果显示在离体条件下,随着Vigabatrin浓度的增大,对GABA-T酶活性的抑制率也相应增大,抑制中浓度IC50为0.443mM。同时,该浓度的Vigabatrin在活体条件下同样可以抑制GABA-T的活性。3.高效液相色谱测定结果显示Vigabatrin处理后4h GABA含量显着升高,8h时降低;而AVM处理后4h、8h朱砂叶螨GABA含量均显着高于对照,表明AVM可以刺激朱砂叶螨GABA的释放,且作用时间长于Vigabatrin。用Vigabatrin预处理后4h时再用AVM处理,4h后GABA含量与对照无显着差异,表明螨体内高含量的GABA可以抵消AVM的刺激作用。毒力测定结果显示经Vigabatrin预处理后敏感个体对AVM的耐药性提高4.1倍,进一步说明高含量的GABA可以降低AVM的杀螨效果。4.通过饲喂GABA-T基因dsRNA的RNAi法提高朱砂叶螨内源GABA含量,进一步研究其与阿维菌素杀螨活性的关系。RNAi结果显示,饲喂GABA-T dsRNA后GABA-T mRNA表达下调33%,GABA含量显着增加,朱砂叶螨爬行速度显着减慢。用阿维菌素LC30、LC50分别处理取食GABA-T-dsRNA的敏感个体,死亡率分别减少12%和18%(与对照相比)。说明通过RNAi的方法提高朱砂叶螨GABA含量后,增加了对AVM的忍耐力。5.利用喷施GABA溶液的方法外源增加朱砂叶螨GABA含量后,其爬行速度显着降低;再分别用6.25、25和100μM的AVM处理朱砂叶螨,与对照处理相比,喷施过外源GABA的朱砂叶螨在一定的浓度和时间范围内死亡率下降,对AVM的忍耐力显着增加。
南灿[7]2017年在《丝氨酸蛋白酶与朱砂叶螨抗性相关关系的研究》文中进行了进一步梳理朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是农业生产中一种危害严重、分布广泛的害螨,在世界各地均有分布。在我国华南、西北、西南、湖北等地方都有发生,其寄主植物多达1000多种,其中经济作物有100多种,因其具有繁殖能力强、世代周期短、活动范围小、近亲交配率高等特点,以及几年来杀虫(螨)剂的大量、持续和不科学使用,导致抗药性问题尤为严重。丝氨酸蛋白酶作为昆虫体内一类重要的水解酶,在维持昆虫机体正常生命活动中扮演着重要的角色,它参与了昆虫机体消化、胚胎发育、组织重建、细胞分化、血管形成、血液凝固、免疫反应、激素活化等多种生理生化过程,它是否也可能与朱砂叶螨的抗性存在着相关关系,为探究两者之间存在的相关关系,我们设计了相关研究内容:在室内筛选出的甲氰菊酯抗性品系(FeR)、阿维菌素抗性品系(AbR)朱砂叶螨以及敏感品系(SS)朱砂叶螨的基础上,研究丝氨酸蛋白酶与朱砂叶螨抗性之间存在的相关关系,并初步对其机制进行初步探究,主要的研究内容和结果如下:1.对丝氨酸蛋白酶基因(SP-900)进行核苷酸序列全长克隆,获得一条长为897 bp碱基序列,并且顺利翻译成含有298个氨基酸的序列,序列分析确定其为一条丝氨酸蛋白酶基因,并且通过进化树构建分析结果表明它亦是一条类胰蛋白酶基因。2.采用q-PCR技术检测目的基因SP-900在SS、FeR、AbR叁个品系中表达情况,利用数据分析软件SPSS22.0采用独立样本T检验的分析方法分析抗性品系与SS品系表达量的差异性,结果显示FeR、AbR品系目的基因SP-900的表达量均高于SS品系,分别是SS品系的2.45、5.54倍。对叁个品系朱砂叶螨经甲氰菊酯或阿维菊素诱导后6h、12h、24h SP-900基因的表达量情况也进行了检测,结果显示,SS品系经甲氰菊酯诱导后12h SP-900基因表达量上调至3.05倍,6h、24h表达量没有上调,FeR品系经甲氰菊酯诱导后6h、12h SP-900基因表达量分别上调至2.77、2.65倍;SS品系经阿维菌素诱导后12h SP-900基因表达量上调至2.42倍,6h、24h表达量没有上调,AbR品系经阿维菌素诱导后12h SP-900基因表达量上调至2.25倍,6h、24h表达量没有上调。上述研究结果表明在目前的抗性水平,朱砂叶螨抗性的增加可能与丝氨酸蛋白酶基因表达量的上调有关,并且在药剂诱导下,SP-900基因的表达量会上升,表明SP-900可能参与了朱砂叶螨在应对药剂带来的不利影响时的某些生理生化反应。3.SS、FeR、AbR叁个品系朱砂叶螨丝氨酸蛋白酶粗酶活性测定结果为:SS、FeR、AbR叁个品系朱砂叶螨丝氨酸蛋白酶粗酶活力分别为3.0024nmol/μg/min、5.2634 nmol/μg/min和6.2774 nmol/μg/min,FeR、AbR两个抗性品系的粗酶活力分别是SS品系的1.75、2.09倍,具有显着性差异。采用药膜法对叁个品系朱砂叶螨进行丝氨酸蛋白酶抑制剂处理,这种处理方法能够抑制朱砂叶螨体内丝氨酸蛋白酶粗酶活性,处理后SS、FeR、AbR叁个品系的粗酶活性分别下降了38.4%、24.8%和21.9%,叁个品系朱砂叶螨丝氨酸蛋白酶活性被抑制后,其对甲氰菊酯和阿维菌素的敏感性上升。表明朱砂叶螨丝氨酸蛋白酶活性下降,对药剂的敏感性上升。4.采用叶碟饲喂法对SS、FeR、AbR叁个品系朱砂叶螨进行RNAi处理,SP-900基因的表达量分别被抑制了49.19%、51.74%和53.69%;粗酶活性分别下降了28.6%、18.2%和23.5%;SS品系对甲氰菊酯、阿维菌素的LC50分别下降了174ppm、0.089ppm,FeR品系对甲氰菊酯的LC50下降了14234ppm,AbR品系对阿维菌素的LC50下降了0.211ppm。RNAi结果显示,叶碟饲喂法能够较好的抑制朱砂叶螨基因SP-900的表达,基因SP-900表达量下降,酶活降低,药剂敏感性上升,。5.丝氨酸蛋白酶与甲氰菊酯或阿维菌素结合实验的结果显示,丝氨酸蛋白酶没有与药剂结合,表明其没有直接参与朱砂叶螨对甲氰菊酯和阿维菌素的分解代谢活动;利用HPLC测定SS、FeR、AbR叁个品系朱砂叶螨ATP含量,结果显示叁个品系之间ATP含量没有表现出差异性。可能是因为FeR、AbR两个抗性品系的解毒代谢活动强于SS品系,ATP需求增加,但是两个抗性产生了适合度代价,导致其其它的生命活动减弱(生殖力下降),ATP需求量下降,从而在ATP总量上没有表现出差异性。
吴琼[8]2017年在《邻位开环双加氧酶TcID1介导朱砂叶螨对两种杀螨剂抗性研究》文中研究指明朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)在我国分布广泛,主要危害棉花、蔬菜等农作物。目前我国对于农业害螨的防治主要以化学防治为主,其中阿维菌素和甲氰菊酯是使用十分广泛的杀螨剂。这些杀螨剂的大量使用以及叶螨自身的生理特性,导致我国绝大多数地区的朱砂叶螨已经对阿维菌素和甲氰菊酯产生了抗药性。邻位开环双加氧酶(Introdial ring-cleavage dioxygenases,ID-RCDs)是一类能够催化邻苯二酚类底物氧化分解的双加氧酶,主要存在于微生物如真菌、细菌中,其主要功能是降解带有芳香环的化合物。朱砂叶螨的基因芯片检测结果显示,相对于敏感品系(Susceptible strain,SS),ID-RCDs基因在阿维菌素抗性品系(Abametin resistant strain,AbR)和甲氰菊酯抗性品系(Fenpropathrin reisitant strain,FeR)中均上调表达。因此,本论文在此基础上,重点研究了ID-RCDs与朱砂叶螨对阿维菌素和甲氰菊酯抗性的关系并取得了以下研究结果:1、朱砂叶螨ID-RCDs酶活性测定。对朱砂叶螨ID-RCDs酶进行粗酶活性测定,该酶在AbR及FeR中的活性均显着高于SS品系,其中AbR品系酶活性是SS品系的1.63倍,FeR品系酶活性是SS品系的2.0倍。2、朱砂叶螨TcID1基因克隆及序列分析。基因克隆结果显示,朱砂叶螨TcID1基因全长的开放阅读框长度为774bp,编码257个氨基酸,蛋白分子量为29.4kD,等电点为5.31。经Signal IP 4.1在线预测发现TcID1的翻译氨基酸含有23个氨基酸的信号肽,可能属于分泌蛋白。对朱砂叶螨TcID1氨基酸序列进行分析,发现TcID1编码的蛋白具有邻位开环双加氧酶特有的Fe3+结合位点:2个His和2个Tyr。与二斑叶螨、细菌、真菌等同源基因进行氨基酸序列相似性和进化分析,结果显示:朱砂叶螨TcID1基因与二斑叶螨基因tetur06g00460的相似度最高,氨基酸一致性为98%;与伊氏叶螨AFY99039.1氨基酸一致性为66%;而与真菌或细菌ID-RCDs相关的氨基酸一致性均低于40%。系统发育树结果显示,相对于细菌,朱砂叶螨TcID1基因与真菌类ID-RCDs具有更高的同源性。3、TcID1基因在不同螨态、不同品系、药剂胁迫下的mRNA表达模式。qPCR结果显示:在朱砂叶螨敏感品系的不同螨态中,TcID1基因在幼螨、若螨及3日龄雌成螨中均呈高表达,并且在若螨中表达量最高,其次为幼螨、成螨、卵;在不同品系之间,相对于敏感品系,AbR及FeR品系均呈高表达,这也验证了基因芯片中的相关结果;在阿维菌素(药剂在各品系中的LC30剂量)胁迫6h、12h及24h后,TcID1基因在SS品系表现为先增加后降低的表达模式;在AbR品系表现为先降低后增加的表达模式;甲氰菊酯胁迫6h、12h及24h后,TcID1基因的表达模式同阿维菌素胁迫结果类似。4、RNAi鉴定TcID1基因在朱砂叶螨对杀螨剂抗性的功能。采用叶碟法间接饲喂TcID1-dsRNA后,SS品系TcID1基因表达量下降60.7%,ID-RCDs酶活性降低38%,对阿维菌素的敏感性显着增加,表现为死亡率显着升高,分别为44%(阿维菌素LC30处理)和38%(阿维菌素LC50处理);而对甲氰菊酯的敏感性无显着变化;饲喂TcID1-dsRNA后,AbR品系TcID1基因表达量下降67.5%,ID-RCDs酶活性降低44%,对阿维菌素的敏感性显着增加,表现为死亡率显着升高,分别为19.5%(阿维菌素LC30处理)和17%(阿维菌素LC50处理);饲喂TcID1-dsRNA后,FeR品系TcID1基因表达量下降47.7%,ID-RCDs酶活性降低40%,而对甲氰菊酯的敏感性无显着变化。5、原核表达TcID1基因。以pColdⅡ为表达载体,构建去除信号肽的TcID1重组表达质粒,并测序验证。将测序正确的重组质粒TcID1-pColdⅡ转化至大肠杆菌感受态细胞中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测发现该基因一部分以可溶性表达,一部分以包涵体形式表达;经过镍亲和层析柱纯化,Western Blot检测表明TcID1基因在大肠杆菌中成功表达。以原儿茶酸为底物进行蛋白活性测定,结果显示重组蛋白比活力为0.1346±0.0090 nmol/μg.pro/min,Km为14.2±4.6 mM,Vmax为0.1163±0.0153nmol/μg.pro/min。6、TcID1异源表达产物与杀螨剂的作用模式。药剂对重组蛋白酶活影响的测定结果显示,使用0.001mmol/L~2mmol/L的阿维菌素及甲氰菊酯均对重组蛋白酶活无影响;借助高效液相色谱检测TcID1重组蛋白对杀螨剂的代谢试验,结果表明TcID1重组蛋白不能代谢阿维菌素。
彭军[9]2013年在《球孢白僵菌对胡瓜钝绥螨和朱砂叶螨的影响》文中研究表明朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus (Boisduval)是世界范围内广泛分布的农业害螨,且由于化学杀螨剂的长期大量使用造成朱砂叶螨种群抗药性的急剧上升,探索生物防治为主体综合控制方法成为防治朱砂叶螨的热点。为此,本文在室内筛选了对朱砂叶螨具有高致病性同时对天敌胡瓜钝绥螨相对安全的球孢白僵菌菌株,评价了球孢白僵菌对朱砂叶螨的致病力、发育历期和繁殖力的影响,研究了球孢白僵菌对胡瓜钝绥螨发育历期、产卵量及捕食功能的影响,旨在协调球孢白僵菌与胡瓜钝绥螨对朱砂叶螨的控制作用提供理论依据。获得的主要结果如下：1、测定了15种球孢白僵菌菌株对朱砂叶螨雌成螨和卵以及胡瓜钝绥螨雌成螨的室内毒力效果。在第一轮筛选中,15种球孢白僵菌菌株对朱砂叶螨螨雌成螨均具表现出一定的致病率,在喷雾浓度为1×107孢子/mL时,校正死亡率为18.7-83.8%,致死中时间的变化范围在4.4-11.7d之间,其中有8种菌株的校正死亡率超过50%。进一步比较了8种对雌成螨高致病性菌株在高、中、低不同剂量上对朱砂叶螨卵的致病率,在高浓度下,只有菌株Bb0062、13b025和Bb2170对卵的致死率大于50%。在第二轮筛选中,我们测定了8种高致病菌株对天敌胡瓜钝绥螨雌成螨的毒力。在1×107孢子/mL浓度下所有测试菌株对胡瓜钝绥螨雌成螨的致死率在2.4～22.0%之间,表明这8种菌株对胡瓜钝绥螨雌成螨致病性不强。对比这两次菌株筛选结果发现菌株Bb025在保证对朱砂叶螨高致死率的同时对其天敌胡瓜钝绥螨并没有明显的致死作用,具有开发应用于朱砂叶螨生物防治的潜力。2、评价了目的菌株Bb025不同浓度对朱砂叶螨的幼螨、若螨和雌成螨的致死效果,结果表明,朱砂叶螨各螨态的死亡率与孢子悬浮液浓度和接种时间成正相关。在相同菌悬液浓度和处理时间时,雌成螨的致死率最高,其次是若螨,幼螨的致死率最低。我们运用时间—剂量—死亡率模型估计了Bb025对朱砂叶螨的致死中量与致死中时间,且模型拟合度很好。朱砂叶螨的LC50和LC9o随着接种时间的延长而减小,接种第7天后,幼螨的LCso估计值为1.06x107个/mL,LC90估计值6.95×109个/mL。若螨的LC5o估计值为9.76×105个/mL,LC90估计值8.17×108个/mL。雌成螨的LC5o估计值为2.43×105个/mL,LC90估计值1.01×108个/mL。球孢白僵菌对朱砂叶螨的致死中时间与接种浓度呈负相关,在1.0×106～1.0×108个/mL的范围内,若螨的LT50从6.94天降低到3.99天,雌成螨的LT50值从5.80天降低到3.90天。此外,球孢白僵菌处理朱砂叶螨能显着的降低其产卵量、产卵历期和雌成螨寿命,但并不影响卵的孵化率和子代各螨态的发育历期。以上结果表明菌株Bb025对朱砂叶螨有较好的控制潜力。3、本实验研究了菌株Bb025对胡瓜钝绥螨的发育历期和产卵量的影响,结果表明Bb025处理后的胡瓜钝绥螨在发育历期和产卵量上与对照组相比均有所改变,但都没有达到显着水平。我们还进一步研究了胡瓜钝绥螨对球孢白僵菌处理后的朱砂叶螨功能反应的影响。结果表明：处理组和对照组的功能反应类型都符合HollingⅡ型,随着球孢白僵菌接种时间的增加,胡瓜钝绥螨对朱砂叶螨的处理时间也增加,而捕食量、瞬时攻击率和寻找效应反而降低,且不同处理之间是存在显着差异的。
彭邈[10]2014年在《朱砂叶螨miRNA鉴定及其在敏感和抗药性品系的表达差异》文中研究表明朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是重要的世界性害螨,因其个体小、繁殖速度快、移动范围小、接触药剂机会多和近亲繁殖率高等特点而极易产生抗药性。miRNAs (microRNAs)是一种人小为21nt左右,由真核生物基因组编码的内源性,具有调控功能的非编码RNA,它通过5'端种子序列2-8位核苷酸与靶基因mRNA3'端UTR区互补配对识别,降解靶基因mRNA或抑制mRNA的翻泽,从而调控基因的表达。为了解miRNAs的调控作用是否与朱砂叶螨抗药性的产生有关,我们利用Illumina HiSeq2000测序平台第一次对朱砂叶螨small RNA进行测序,鉴定朱砂叶螨miRNA并研究其在甲氰菊酯抗性品系和敏感品系中的表达。主要研究结果如下1.通过small RNA测序,在朱砂叶螨甲氰菊酯抗性品系FeR中获得24796487条reads,在敏感品系SS中获得22001867条reads.通过筛选,发现sRNA(18-30nt)的在FeR中为21232699条,其中的7014169条(33.56%)能匹配上二斑叶螨(Tetranychus urticae)基因组；在SS中为19657179条,其中的6578128条(33.21%)能匹配上一二斑叶螨(Tetranychus urticae)基因组,长度主要集中在20nt(15.23%)、21nt(22.60%)、22nt(19.10%)、23nt(10.20%)2.将sRNA与1miRBase20中二斑叶螨miRNA序列进行比对,共鉴定了75个已知的miRNA成熟体和45个前体；预测了93个新的miRNA成熟体和64个前体。一共预测了26202个靶基因,发现了55个可能与昆虫抗性相关的靶基因,这些抗性相关的靶基因可能受到了39个已知的：miRNA和33个新的miRNA的调控。通过miRNA碱基编辑分析,发现SS中发生碱基编辑的位点数仅为210977个,而FeR中为390968个。3.将抗性品系和敏感品系miRNA表达量进行对比,共发现12条表达显着差异的miRNA,其中表达上调的4个,表达下调的8个。对测序预测的12条差异表达的miRNA进行qPCR验证,其中10条miRNA的表达趋势一致,一致率83%。
参考文献：
[1]. 朱砂叶螨（Tetranychus Cinnabarinus）抗药性机理及抗性适合度研究[D]. 何林. 西南农业大学. 2003
[2]. 朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶基因的克隆与特征分析[J]. 冯晓姣, 卜春亚, 师光禄, 高品, 王有年. 应用与环境生物学报. 2014
[3]. 朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性形式遗传及抗性稳定性研究[D]. 冯楷阳. 西南大学. 2017
[4]. 谷胱甘肽S-转移酶介导的朱砂叶螨对炔螨特抗药性研究[D]. 罗雁婕. 西南大学. 2013
[5]. 二斑叶螨对朱砂叶螨竞争性扩张的毒理学机制研究[D]. 卢文才. 西南大学. 2017
[6]. 朱砂叶螨γ-氨基丁酸与阿维菌素杀螨活性关系研究[D]. 刘炎超. 西南大学. 2016
[7]. 丝氨酸蛋白酶与朱砂叶螨抗性相关关系的研究[D]. 南灿. 西南大学. 2017
[8]. 邻位开环双加氧酶TcID1介导朱砂叶螨对两种杀螨剂抗性研究[D]. 吴琼. 西南大学. 2017
[9]. 球孢白僵菌对胡瓜钝绥螨和朱砂叶螨的影响[D]. 彭军. 西南大学. 2013
[10]. 朱砂叶螨miRNA鉴定及其在敏感和抗药性品系的表达差异[D]. 彭邈. 西南大学. 2014