郑锦乾[1]2006年在《利用酵母双杂交系统筛选铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiA的相互作用蛋白》文中研究说明蓝藻是目前已知具有生物钟节律的最简单生物,它的生物钟基因簇kai由叁个基因组成,分别是kaiA, kaiB ,kaiC,它们已被证明是维持蓝藻基本生物钟节律所必需的,其中任何一个基因的缺失都会导致生物钟节律的消失。在生物钟节律产生的过程中,Kai蛋白相互之间以及它们与其他蛋白之间的相互作用可能起着关键作用。其中KaiA的作用是作为一种传递来自输入途径信息的通道,它通过接受环境信息后整合入钟蛋白复合体中,进而激活KaiC自身磷酸化使之发生构象变化。这种Kai蛋白之间和Kai蛋白与其它蛋白的相互作用以及KaiC蛋白的磷酸化状态,构成了由Kai蛋白振荡器产生生物钟守时机制的核心。酵母双杂交系统是研究蛋白相互作用的常用方法,为了研究铜绿微囊藻生物钟基因(Microcystis aeruginosa) kaiA的功能找到与其相互作用的蛋白,我们通过PCR方法克隆得到该基因,然后将其克隆入酵母双杂交流系统所用的钓饵载体pGBKT_7和猎物载体pGADT_7中,经测序证明正确后,分别将两组质粒pGBKT_7-kaiA /pGADT_7- kaiA和pGBKT_7-kaiA/ pGADT_7转化入酵母菌AH109中,分析其表达产物是否会影响酵母菌的生长以及能否激活报告基因转录。实验结果表明KaiA蛋白对酵母菌AH109无毒性,也不能激活报告基因转录,同时也证实了KaiA蛋白在转化酵母菌中可以发生自身相互作用。实验还表明我们可以将pGBKT_7-kaiA作为酵母GAL4双杂交系统的钓饵载体,从铜绿微囊藻基因组文库中钓取与KaiA相互作用的蛋白。因此,我们构建了两种铜绿微囊藻基因组文库:pGADT_7-Sau3AI和pGADT_7-HapII,然后通过酵母双杂交系统筛选基因组文库中可能与KaiA相互作用的蛋白。实验最终共筛选得到23个阳性克隆,通过测序和比对,发现其中有7个未知蛋白与蓝藻有关,为了确定这些蛋白与KaiA相互作用的结构域,我们分别深入分析了这些蛋白所包含的各种功能结构域与KaiA之间的相互作用。结果表明,下列功能结构域:DUF29,TRCF,PAP-fibrillin, pp-bing, COG4995能够与KaiA发生相互作
王靖[2]2008年在《利用酵母双杂交系统筛选铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiC的相互作用蛋白》文中研究表明生物钟是调控生物代谢和行为的内源计时系统,它广泛存在于自然界的各种生物体内。蓝藻是目前已知的具有生物钟的最简单的生物。其生物钟核心是kai基因簇及其编码的KaiA、KaiB、KaiC蛋白。其中KaiC蛋白是蓝藻生物钟机制的核心部分,通过对kai基因簇转录的调控,可以调节Kai蛋白的表达,并且这3种蛋白则通过自身的相互作用,能够对KaiC的磷酸化状态进行调节,从而产生昼夜节律信息。KaiC磷酸化状态的变化会影响它与其他蛋白的相互作用,并使许多与生物钟相关的基因表达呈现出昼夜节律性。为了研究铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的钟基因KaiC的功能,寻找与其相互作用的蛋白,本文利用酵母双杂交的方法来钓取未知的相关基因。在取得pGBKT_7-kaiC后,我们检测了其能够在酵母AH109中正常表达,并且不会产生毒性影响酵母AH109的生长,且不具自激活性。实验表明,可以将pGBKT_7-kaiC作为酵母GAL4双杂交系统的钓饵载体,从铜绿微囊藻基因组文库中钓取与KaiC相互作用的蛋白。利用载体pGADT_7构建了铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC 7820的染色体DNA文库,通过上述酵母双杂交系统的反复筛选和验证,共找到了11个不同的与KaiC蛋白有相互作用的蛋白,其中3个蛋白C99、C196及C10为铜绿微囊藻的蛋白。根据比对结果,我们对C99和C196进行了异源表达,并对其与KaiC蛋白的相互作用进行了进一步研究。由于铜绿微囊藻C99蛋白的基因序列未知,我们采用KaiC蛋白与铜绿微囊藻PCC 7820的KaiC蛋白具有很高的相似性的集胞藻中的OmpR代替C99进行研究。将集胞藻OmpR基因在大肠杆菌中得到可溶性表达后,通过体外pull-down的方法验证了其在体外与KaiC蛋白不会发生相互作用,同时酵母双杂交方法验证结果表明集胞藻中的OmpR蛋白与KaiC蛋白在体内也不会发生相互作用。另外,对铜绿微囊藻C196蛋白进行了在大肠杆菌的异源表达后,通过Far-western的方法验证了该蛋白在体外与KaiC蛋白有相互作用,进而推断C196很可能是与铜绿微囊藻生物钟调控有关的蛋白。本实验对与铜绿微囊藻生物钟蛋白复合体的核心部分KaiC蛋白的相互作用蛋白进行了初步的研究,对于阐明生物钟节律的信号输出途径提供了理论依据,为铜绿微囊藻生物钟分子机制的研究奠定了基础。
王靖, 徐虹, 李珣, 郑锦乾, 王立红[3]2008年在《铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiC的自激活活性和自身相互作用研究》文中指出通过PCR扩增了铜绿微囊藻的生物钟主控基因KaiC,并将其分别克隆到酵母双杂交系统的诱饵质粒pGBKT7和猎物质粒pGADT7中,然后将重组质粒pGBKT7-kaiC/pGADT7-kaiC和pGBKT7-kaiC/pGADT7分别共转化酵母菌AH109,经营养缺陷生长和β-半乳糖苷酶印迹检测表明,KaiC蛋白不具有毒性不会影响酵母细胞的生长,也不具有自激活活性,不会激活报告基因的表达,并且KaiC蛋白自身存在较强的相互作用。诱饵质粒pGBKT7-kaiC可用于从基因组文库中筛选KaiC的相互作用蛋白。
郑锦乾, 徐虹, 章军, 王靖, 朱斌琳[4]2006年在《利用酵母双杂交研究铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB的自身相互作用》文中指出从铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7820中克隆了生物钟基因kaiB,并将其克隆入酵母双杂交系统的两个质粒pGADT7和pGBKT7中。经测序验证后,将重组质粒pGADT7-kaiB和pGBKT7-kaiB转化酵母菌AH109进行自激活性和自身相互作用的检测和验证。结果表明,铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB无自激活性,KaiB蛋白自身能发生相互作用。因此,可用KaiB蛋白为诱饵利用酵母双杂交系统筛选文库钓取与KaiB发生相互作用的蛋白。
参考文献：
[1]. 利用酵母双杂交系统筛选铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiA的相互作用蛋白[D]. 郑锦乾. 厦门大学. 2006
[2]. 利用酵母双杂交系统筛选铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiC的相互作用蛋白[D]. 王靖. 厦门大学. 2008
[3]. 铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiC的自激活活性和自身相互作用研究[J]. 王靖, 徐虹, 李珣, 郑锦乾, 王立红. 海洋环境科学. 2008
[4]. 利用酵母双杂交研究铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB的自身相互作用[J]. 郑锦乾, 徐虹, 章军, 王靖, 朱斌琳. 海洋科学. 2006