左富义, 李世拥, 安萍, 于波, 蔡慧芸[1]2004年在《蛋白质酵母双杂交系统的建立及其在大肠癌肝转移研究中的意义》文中研究说明目的 建立酵母双杂交系统 ,筛选与FasL相互作用的蛋白 ,探讨FasL与大肠癌肝转移的关系。方法 以FasL基因构建诱饵蛋白质粒 ,筛选人胎肝cDNA文库 ,鉴定与FasL相互作用的蛋白 ,通过生物信息学分析FasL及其相互作用蛋白在大肠癌肝转移中的作用。结果 筛选出 10个与FasL特异性相互作用的蛋白 ,包括金属硫蛋白 1K、1G、2A ,组织蛋白酶B ,脂肪酸合成酶 ,干扰素α诱导蛋白 2 7,磷脂清除酶 ,丝氨酸 /苏氨酸样激酶 ,锚着黏附蛋白以及纤维微丝蛋白 5等。结论 成功建立了筛选FasL相互作用蛋白的酵母双杂交系统 ,并初步证明FasL与组织蛋白酶、金属硫蛋白、锚着黏附蛋白等之间的相互作用与大肠癌肝转移密切相关
左富义[2]2004年在《FasL酵母双杂交系统的建立及其在大肠癌肝转移研究中的意义》文中研究表明大肠癌(CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一，在消化道肿瘤中的发病率和死亡率均位居第二位。随着我国国民总体生活水平的提高，膳食结构的变化，近年CRC的发病率呈逐年上升趋势，虽CRC诊疗技术有着长足发展，但CRC的总体5年存活率并无显着提高。制约CRC预后的关键因素是如何早期发现、早期诊断与早期治疗CRC病人，预防手术后CRC的复发与转移。因此深入研究CRC的发病机理以及其复发与转移的机制，具有十分重要的临床意义。寻找新的、特异性强、敏感性高的诊断复发与转移的标志物，以及新的分子治疗靶标，是本研究的立题依据和主要目的。 目的建立FasL相互作用蛋白的酵母双杂交系统，为大肠癌肝转移的蛋白质组学研究建立一个相互作用蛋白的实验模型。利用建立的酵母双杂交系统，在人胎肝文库中筛选与FasL相互作用的蛋白质，探讨FasL及其相互作用蛋白在大肠癌发生、发展和在肝转移中的作用机制，为筛选大肠癌肝转移的早期诊断标志物和治疗靶标提供理论依据。 方法构建FasL基因的诱铒蛋白质粒FasL-pGBKT7，应用Western' Blot验证其能否在酵母AH109细胞中表达FasL蛋白。将FasL-pGBKT7。质粒和人胎肝cDNA文库质粒共转化酵母AH109细胞。通过从低到高严格性地筛选，在人胎肝cDNA文库中筛选并鉴定与FasL相互作用的蛋白；应用生物信息学方法，了解这些蛋白的病理生理功能，分析他们可能在大肠癌肝转移中的作用机制。将FasL相互作用蛋白的基因转染人直肠癌HR一8348细胞，G-418筛选成功转染的细胞；用5-氟脲嘧啶(5-FU)和奥沙利铂作为筛选药物，通过细胞学实验(四唑蓝比色实验，MTT法)，了解转染细胞对5-FU和奥沙利铂的耐药能力，以研究FasL及相互作用蛋白对直肠癌细胞耐药性的影响；用免疫组织化学方法检测FasL及相互作用蛋白在CRC标本中表达情况，比较在CRC不同分期中这些蛋白的表达差异，证实他们在大肠癌肝转移中的作用机制。所有数据均采用SPSS 12.0统计分析软件进行统计分析。第叁军医大学硕士学位论文 结果构建的FasL一pGBKT7本身没有自身激活活性，并可以在酵母AHIOg细胞中稳定表达FasL蛋白。通过酵母双杂交系统筛选出10个与FaSL特异性相互作用的蛋白，包括金属硫蛋白1K、lG、2A，组织蛋白酶B，脂肪酸合成酶，干扰素a诱导蛋白27，磷脂清除酶，丝氨酸/苏氨酸样激酶，锚着粘附蛋白以及纤维微丝蛋白一5等。在细胞耐药性实验中，证实了FasL与金属硫蛋白和组织蛋白酶之间的相互作用能够增强人直肠癌HR一8348细胞的耐药能力。通过免疫组织化学检测FaSL、组织蛋白酶、金属硫蛋白在大肠癌中的表达情况，结果表明，癌变的CRC组织中上述蛋白表达明显增高，高于正常大肠粘膜(尸<0 .05)，但在不同分期的CRC组织中表达没有差异(尸>0，05);上述蛋白在CRC组织中的联合表达率比正常大肠粘膜明显增高(尸<0.05)，CRC不同组之间的联合表达情况没有差异(尸>0 .05)。 结论成功建立了筛选FaSL相互作用蛋白的酵母双杂交系统，并初步证明FaSL与组织蛋白酶、金属硫蛋白、锚着粘附蛋白等之间的相互作用与大肠癌的侵袭力、肝转移能力以及大肠癌细胞的耐药性方面密切相关;FaSL与脂肪酸合成酶、磷脂清除酶等之间的相互作用与大肠癌细胞的生长与增殖密切相关。FaSL可能与PKC细胞信号传导途径具有密切关系，通过此系统调节其他蛋白在细胞内的表达，并发生相互作用。FaSL、组织蛋白酶、金属硫蛋白可能为大肠癌诊断的标志物。FaSL在大肠癌发生、发展及肝转移过程中具有中心地位的作用，决定了大肠癌细胞的各种恶性生物学行为，因此FaSL有可能成为治疗大肠癌肝转移的分子标靶。
左富义, 李世拥, 安萍, 于波, 蔡慧芸[3]2006年在《FasL相互作用蛋白的筛选及其在大肠癌研究中的意义》文中指出目的建立FasL相互作用蛋白的酵母双杂交系统,筛选与FasL相互作用的蛋白质,探讨FasL及其相互作用蛋白在大肠癌发生与发展中的意义,为筛选大肠癌早期诊断标志物和治疗靶标提供理论依据。方法以FasL作为诱饵蛋白,在人胎肝cDNA文库中筛选与FasL相互作用的蛋白质;将FasL相互作用蛋白的基因转染人直肠癌HR-8348细胞,通过细胞学实验(四唑蓝比色法),研究FasL及相互作用蛋白对直肠癌细胞耐药性的影响;应用免疫组织化学方法检测FasL及相互作用蛋白在大肠癌标本中表达情况,比较在大肠癌不同分期中这些蛋白的表达差异,研究他们在大肠癌发生与发展中的作用机制。结果筛选出10个与FasL特异性相互作用的蛋白,包括金属硫蛋白1K、1G、2A,组织蛋白酶B,脂肪酸合成酶,干扰素α诱导蛋白27,磷脂清除酶,丝氨酸/苏氨酸样激酶,锚着黏附蛋白以及纤维微丝蛋白-5等。细胞耐药实验证实,FasL与金属硫蛋白和组织蛋白酶之间的相互作用能够增强人直肠癌HR-8348细胞的耐药能力。免疫组织化学结果表明,癌变的大肠癌组织中FasL、组织蛋白酶、金属硫蛋白表达明显增高,高于正常大肠黏膜(P<0.05)。结论FasL与组织蛋白酶、金属硫蛋白、锚着黏附蛋白等之间的相互作用与大肠癌的侵袭力及癌细胞产生耐药性密切相关;FasL、组织蛋白酶、金属硫蛋白可能为大肠癌诊断的标志物;FasL及其相互作用蛋白可作为治疗大肠癌新的分子标靶。
左富义[4]2007年在《FasL相互作用蛋白在结直肠癌肝转移中的作用及其意义》文中研究说明结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一,在消化道肿瘤中的发病率和死亡率均位居第二位。随着我国国民总体生活水平的提高,膳食结构的变化,近年结直肠癌的发病率呈逐年上升趋势,虽结直肠癌诊疗技术有着长足发展,但结直肠癌的总体5年存活率并无显着提高,其原因是术后复发与肝转移,也是制约结直肠癌预后的主要因素。因此如何早期预测、早期发现、早期诊断与早期治疗结直肠癌复发与肝转移,是提高5年生存率的关键。因此深入研究结直肠癌复发与转移的机理,具有十分重要的临床意义。寻找新的、特异性强、敏感性高的诊断复发与转移的标志物,是本研究的立题依据和主要目的。目的利用酵母双杂交系统,在人胎肝文库中筛选并验证FasL相互作用蛋白;通过在筛选建立的结直肠癌高肝转移动物模型组织及细胞株中验证其表达规律,探讨FasL及其相互作用蛋白在结直肠癌发生、发展和在肝转移中的作用机制,为筛选结直肠癌肝转移的早期诊断分子标志物提供理论依据。方法扩增诱铒蛋白质粒FasL-pGBKT7,应用Western’Blot验证其在酵母AH109细胞中表达FasL蛋白。将FasL-pGBKT7质粒和人胎肝cDNA文库质粒共转化酵母AH109细胞。通过高严格性筛选,在人胎肝cDNA文库中筛选并鉴定与FasL相互作用的蛋白;通过筛选得到的结直肠癌高肝转移动物模型,比较高转移细胞COLR-1细胞与人直肠癌HR-8348细胞的肿瘤细胞学特性;用免疫组织化学方法检测FasL及相互作用蛋白在裸鼠组织标本中表达情况,比较在有无肝转移组织中这些蛋白的表达差异,证实他们在结直肠癌肝转移中的作用机制。所有数据均采用SPSS 12.0统计分析软件进行统计分析。结果FasL-pGBKT7在酵母细胞中没有自身激活活性,并可以稳定表达FasL蛋白。通过酵母双杂交系统筛选出4个与FasL特异性相互作用的蛋白,包括金属硫蛋白1K、1G,组织蛋白酶B,Anchor Attachment蛋白。用皮下瘤结直肠原位移植模型及肝转移灶组织块原代培养的方法,筛选出了具有肝转移潜能的结直肠癌肝转移细胞系COLR-1细胞,并比较了COLR-1细胞与结直肠癌HR-8348细胞的生长特性,体外培养显示COLR-1细胞肿瘤细胞学特性更加明显。流式细胞仪检测COLR-1细胞的增殖指数明显高于结直肠癌HR-8348细胞。应用免疫组化方法对COLR-1细胞相关分子的表达进行检测,结果表明:组织蛋白酶B在具有高转移潜能的结直肠癌细胞内高表达(82.35%),高于未转移组(27.27%);而FasL在二组中均高表达。应用蛋白印迹检测进一步证明FasL及组织蛋白酶B均可在COLR-1细胞中增强表达。结论本实验通过酵母双杂交系统验证了FasL相互作用蛋白结果的可靠性和重复性。从本实验中我们获得的FasL相互作用的四种蛋白在肿瘤复发与转移机制中均具有重要的研究价值,尤其是组织蛋白酶B和Anchor Attachment蛋白更为重要,其中组织蛋白酶B在肿瘤侵袭和转移中的研究较为突出,而Anchor Attachment蛋白在结直肠癌的研究领域尚属空白。本实验证明组织蛋白酶B在动物体内可以与FasL发生相互作用,并且在具有高转移潜能的结直肠癌细胞内大量表达,说明了FasL蛋白可能直接作用于其下游蛋白,激活并引起其下游蛋白(包括组织蛋白酶B)在结直肠癌肿瘤细胞的大量表达,组织蛋白酶B然后作用于肝脏细胞基底膜成分的重要蛋白,从而促进结直肠癌细胞定向转移至肝脏,增强其侵袭及转移能力。本实验为研究结直肠癌复发与肝转移提供了重要理论依据。
参考文献：
[1]. 蛋白质酵母双杂交系统的建立及其在大肠癌肝转移研究中的意义[J]. 左富义, 李世拥, 安萍, 于波, 蔡慧芸. 中华外科杂志. 2004
[2]. FasL酵母双杂交系统的建立及其在大肠癌肝转移研究中的意义[D]. 左富义. 第叁军医大学. 2004
[3]. FasL相互作用蛋白的筛选及其在大肠癌研究中的意义[J]. 左富义, 李世拥, 安萍, 于波, 蔡慧芸. 中国现代医学杂志. 2006
[4]. FasL相互作用蛋白在结直肠癌肝转移中的作用及其意义[D]. 左富义. 第叁军医大学. 2007