拟南芥转录因子SHR调控的根尖活性氧微环境对细胞平周分裂的调控研究

论文摘要

植物的根是它们重要的营养器官,在植物的生长发育过程中,根的结构形态与其生理功能紧密相关。根尖分生组织（Root Apical Meristem,RAM）是根的干细胞区域,围绕着根尖静止中心（Quiescent Center,QC）组成一个干细胞笼。从横向上看,拟南芥的根尖形态由内向外分别是维管束、中柱鞘、内皮层、皮层及外表皮,它们共同构成根尖的辐射形态。QC两侧的细胞叫做基本组织起始细胞母细胞,它会发生不对称的垂周分裂产生子细胞,再由其子细胞发生不对称平周分裂产生皮层（Cortex）和内皮层（Endodermis）,平板生长7 d以内的拟南芥幼苗,皮层和内皮层称作基本组织。转录因子SHORT-ROOT（SHR）参与根尖辐射形态建成,在基本组织细胞平周分裂形成过程中有着的重要作用。过量表达SHR会导致基本组织发生大量平周分裂,研究认为,SHR与其下游转录因子SCR调控分生区的平周分裂与基本组织的形成,但是SHR对分裂调控的机制一直在探索之中。为此,本研究使用SHR的过表达植株iSHR（induced overexpression of SHR）,截取6 d幼苗根尖提取RNA,进行转录组测序,分析,并进行相应的表型与生理实验,研究SHR分裂的调控机制。实验结果如下:1.通过GO分析,我们发现SHR过表达植株中氧化呼吸爆发酶RBOH A,RBOH C,RBOH D,RBOH E和RBOH F发生明显上调。由于前人有研究表明活性氧（ROS）会调控根尖内皮层的分裂,于是我们猜想ROS极有可能参与到了iSHR调控的平周分裂;2.NBT和DAB染色均表明,iSHR分生区的ROS含量明显高于野生型（WT）;当使用H2O2清除剂处理时,根尖的平周分裂分裂明显减少;使用O2-清除剂处理时,对分裂并无明显影响。此外,一定浓度的H2O2促进WT内皮层发生分裂;高浓度则不会促进,反而引起细胞凋亡;外源H2O2对iSHR根尖平周分裂无明显影响;同时我们发现H2O2不能恢复shr-2发生平周分裂的能力;3.鉴于前人对水杨酸（SA）与ROS在植物胁迫方面的研究,我们注意到SA并发现SA能够促使WT的内皮层提前发生分裂产生中皮层（MC）,其ROS染色表明H2O2有所升高;SA处理与外源添加H2O2有很多相似之处,不能使shr-2分裂能力恢复;SA处理对iSHR细胞分裂没有明显影响;4.通过qRT-PCR验证,我们发现SA的合成基因群体性地被SHR上调,而SA能增加H2O2的积累,所以我们认为SHR会通过促进SA而提升ROS的水平,这是SHR间接维持ROS稳态的一种方式;5.SPY是一个乙酰氨基葡糖基转移酶,已知其突变体spy-3的H2O2水平会升高。当我们在spy-3背景下过表达SHR,与iSHR相比,并不会促进细胞分裂,其根尖干细胞反而受到氧化损伤;以上结果表明,平周分裂过程中,ROS微环境是一个重要条件。其中H2O2可能作为信号分子,参与了细胞的信号转导。SHR调控氧化呼吸爆发酶类而促进ROS的积累,并通过SA维持ROS水平,而SPY的存在能够保持ROS的稳态,使细胞免受ROS损伤。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 SHR与根尖辐射形态

1.2 植物激素与平周分裂

1.3 活性氧与细胞分裂

1.4 水杨酸简介

1.5 本研究内容及意义

1.5.1 研究内容

1.5.2 研究目的及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 拟南芥材料

2.1.2 菌株

2.1.3 载体

2.2 实验所需的重要仪器设备

2.3 实验试剂

2.4 实验中常用的培养基配置

2.5 实验中常用的溶液配制

2.5.1 常用溶液的配制

2.5.2 常用抗生素母液的配制

2.5.3 常用激素母液的配制

2.6 实验方法

2.6.1 拟南芥的播种与种植

2.6.2 用CTAB法提取拟南芥DNA

2.6.3 用CTAB法提取拟南芥DNA

2.6.4 拟南芥根尖RNA的提取（Omega植物RNA提取试剂盒）

2.6.5 拟南芥RNA的反转录（诺唯赞）

2.6.6 q-PCR检测目的基因的表达

2.6.7 克隆与载体的构建

2.6.8 大肠杆菌DH5α及 DB3.1 感受态的制备

2.6.9 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定

2.6.10 大肠杆菌的质粒提取（全式金小提）

2.6.11 农杆菌转化及侵染拟南芥

2.6.12 转基因拟南芥植物的筛选与获得

2.6.13 诱导拟南芥过表达SHR处理

2.6.14 不同药物及激素处理拟南芥幼苗

2.6.15 激光共聚焦显微镜观察根尖细胞分裂

2.6.16 用微分干涉差显微镜（DIC）观察根尖染色

2.6.17 过氧化氢染色（DAB staining）

2.6.18 增强型DAB试剂盒显色（试剂盒）

2.6.19 超氧根染色（NBT staining）

2.6.20 GUS染色

3 结果与分析

3.1 对拟南芥根尖平周分裂表型的鉴定

3.1.1 iSHR能够大量促进平周分裂

3.1.2 shr突变体的根尖基本组织丧失分裂能力

3.2 iSHR与 ROS的关系

3.2.1 ROS对 SHR表达的影响

3.2.2 SHR对 ROS的影响

3.2.3 iSHR株系进行转录组测序与分析

3.2.4 验证ROS产生有关酶类的表达量

3.3 对iSHR 进行ROS的清除实验

3.4 对iSHR进行ROS的增加并不影响平周分裂

3.5 ROS的增加与清除对WT的影响

3.5.1 ROS的增加

3.5.2 WT中 ROS的清除

3.6 ABA/GA与 ROS在细胞分裂中的关系

3.7 SA对平周分裂表型的影响

3.8 SA合成与信号基因的表达验证

3.9 iSHR对氧化状态的自控

4 讨论

4.1 ROS微环境是进行平周分裂的必要不充分条件

4.2 SHR与 ROS/SA之间的关系

4.3 机体对ROS自稳态的调控

4.4 本研究后续探索的问题

4.5 本研究的创新点

5 结论

参考文献

致谢

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王红

导师: 吴双

关键词: 平周分裂,基本组织,微环境,水杨酸

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 福建农林大学

分类号: Q943.2

总页数: 59

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拟南芥转录因子SHR调控的根尖活性氧微环境对细胞平周分裂的调控研究

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