刘春花[1]2003年在《胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与免疫防制》文中研究表明从某猪场死亡猪严重出血的肺脏、肝脏、脾脏和胸腔渗出液中分离到1株具有多形性的革兰氏阴性球杆菌，为两极着色，其大小为0.7～1.6×0.2～0.5μm，单在、成双、成短链或成团状。该菌不能在普通营养琼脂、普通肉汤和麦康凯培养基上生长。在绵羊血琼脂平板上生长18～24h，形成不透明的淡灰色、湿润、光滑、表面稍隆起的菌落，呈明显的β溶血。CAMP试验可发现金黄色葡萄球菌周围的溶血带明显增宽。生长需要V因子，发酵糖类，产酸不产气，不能发酵乳糖、木糖和山梨醇，硝酸盐还原试验和尿素酶试验均呈阳性，不产生H_2S和靛基质，接触酶、氧化酶、VP和MR试验均呈阴性。血斜面培养物4℃可保存15d左右，脱脂牛乳中—40℃可保存6个月左右。动物感染试验表明，分离菌有强致病性，含菌量3×10~8～4×10~9个/mL的肉汤培养物腹腔注射，可使小白鼠在感染后6～10h死亡，也可使豚鼠发病。用分离菌肉汤培养物通过胸腔、腹腔、肌肉、耳静脉和滴鼻五种途径感染35日龄左右的仔猪，均可不同程度地引起仔猪发病或死亡。其中通过胸腔感染的仔猪发病较快，症状及病变也较为典型。发病仔猪表现为咳嗽，喷嚏，呼吸极度困难，严重的呈犬坐呼吸，若继发其他细菌感染，则症状加剧，有的仔猪表现为走路不稳。剖检可发现胸腔有大量的渗出液，心包增厚，与胸膜或肺脏黏连；肺脏萎缩，表面有灰白色或暗红色的坏死灶或淤血斑，切面支气管内有泡沫状液体流出；肝脏、肾脏肿大，表面有坏死灶，被膜紧张。气管内侧黏膜肿胀，消化系统无明显病变。病理组织学观察，可见肺泡内有少量的浆液，肺间质有坏死，肺脏静脉血管扩张充血；肝脏、肾脏均有不同程度的变性、坏死，静脉血管扩张充血。可从死亡仔猪的病变组织中分离到感染菌。结合生物学特性和动物致病试验，可将该分离菌鉴定为胸膜肺炎放线杆菌。 该分离菌对大多数常用的抗生素不敏感。按常规方法将分离菌制成油佐剂灭活苗(6×10~(11)～8×10~(11)个/mL)免疫仔猪和母猪，均可产生不同程度的保护作用，抗体检测可达2~7以上，攻毒试验证明被免疫的仔猪不发病而未免疫的仔猪发病。
贾凡[2]2007年在《胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及ELISA试剂盒的研制与应用》文中认为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae，APP)是引起猪传染性胸膜肺炎(poreine contagious pleuropneumonia，PCP)的病原。给世界养猪业带来严重经济损失。目前，共有15个血清型，该病原菌的主要毒力因子包括CPS、LPS、OMP、TBP、粘附因子、内毒素、尿素酶等。Apx毒素是APP最主要的毒力因子，现证明不同血清型的菌株可产生4种Apx，ApxⅡ除血清型10和14以外，其它血清型都分泌；任何血清型都能在体内分泌毒素蛋白ApxⅣ，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。本研究包括如下叁方面的内容：1．胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定将病料接种培养基，经过24小时的培养后将细菌进行纯化，挑单菌落革兰氏染色、镜检，将细菌接种到细菌鉴定微量反应管，同时以细菌制备模板，做apxⅣ-PCR，然后经过琼脂扩散试验确定血清型。结果从患病猪的肺、关节分离到胸膜肺炎放线杆菌6株，其中，4株4型，1株3型，1株未定型。2．胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ-ELISA抗体检测试剂盒的研制及其应用根据ApxⅡ的特点，实验室已经建立了一种能够监测疫苗免疫后的抗体水平和对疫苗免疫效果进行评估的血清学方法ApxⅡ-ELISA；本研究将该诊断方法进一步研制成试剂盒，对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试，与间接血凝试验试剂盒进行了对比研究，并用该试剂盒检测了来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清1453份，同时也制作了ApxⅡ的抗体削长规律曲线结果表明ApxⅡ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性；叁批试剂盒的批内和批间的重复性良好(变异系数均＜15％)；试剂盒在2～8℃保存9个月内稳定性良好；检测来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清的阳性率分别为49.56％、85.51％、1.92％、73.33％、1.85％和100％。从ApxⅡ抗体消长规律的曲线可以看出，疫苗免疫后3周或者4周就可以监测到ApxⅡ抗体，抗体水平达到峰值时，其值为1∶1280。ApxⅡ-ELISA试剂盒能够有效的诊断猪传染性胸膜肺炎，同时也可作为一种评价猪群免疫后免疫效果的有效方法；3．胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA抗体检测试剂盒的研制及其应用根据ApxⅣ的特点，实验室已经建立了一种能够特异性的诊断猪传染性胸膜肺炎，并且能够有效的区分感染猪与免疫猪的鉴别诊断方法ApxⅣ-ELISA。本研究将该诊断方法进一步研制成试剂盒，对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试，与间接血凝试验及IDEXX公司的CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒进行了对比研究，并用该试剂盒检测了来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清1453份，同时也制作了ApxⅣ的抗体削长规律曲线。结果表明ApxⅣ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性，与CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒的检测符合率为91.37％；叁批试剂盒的批内和批间的重复性良好(变异系数均＜15％)；试剂盒在2～8℃保存9个月内稳定性良好；App感染后3周或者4周就可以监测到ApxⅣ抗体，抗体水平达到峰值时，其值为1∶640。检测来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清的阳性率分别为22.30％、39.72％、0.64％、42.22％、1.85％和93.94％。ApxⅣ-ELISA试剂盒能够有效区分APP感染猪与叁价灭活疫苗或亚单位疫苗免疫猪。目前，胸膜肺炎放线杆菌比较难以分离，其原因有待进一步研究。本研究分离出6株APP地方分离株，对我国猪传染性胸膜肺炎的病原学与流行病学研究积累了一定的菌株资源。同时，对ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA两种抗体检测试剂盒进行了产业化研究，其中ApxⅣ-ELISA达到临床应用水平，对猪传染性胸膜肺炎的诊断与防控具有十分重要的意义。
刘军发[3]2005年在《胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统的初步建立及胸膜肺炎放线杆菌OmlA-ELISA检测方法的建立》文中进行了进一步梳理猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。 该病由Pattison等于1957年首次报道，目前流行于世界各地。胸膜肺炎放线杆菌目前已经划分了15个血清型，利用本地主要流行的血清型免疫接种是预防和控制该病的主要措施，目前我国用于预防猪传染性胸膜肺炎的主要疫苗是灭活疫苗，对全国各地的流行情况进行调查，分离各地优势流行胸膜肺炎放线杆菌血清型，有助于有效的控制该病在我国的流行和爆发；但这种由优势血清型制备的灭活疫苗对于同种血清型的感染可降低死亡率，但不能降低发病率，不能阻止肺部病变和慢性感染，更不能对异型菌的感染提供有效的交叉保护，这就迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。 要研制有效的新型疫苗，就必须对该菌的致病机理进行研究，着就需要有效的研究工具，能够高效精确的对胸膜肺炎放线杆菌的致病机理进行研究，能够成功的克服胸膜肺炎放线杆菌比较强的修饰限制系统，从而为弱毒菌及其它新型疫苗的的研制打下坚实的基础。 胸膜肺炎放线杆菌目前发现的毒素共有四种，分别是毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和毒素Ⅳ，毒素毒素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的结构及功能已经基本上研究的比较清晰，但毒素Ⅳ的功能还没有完全研究清楚，特别是毒素Ⅳ的激活基因、作用方式、结构组成都还不是非常清晰。所以非常有必要对其功能进行更为彻底的研究。 鉴于上述背景，本研究从临床上分离了胸膜肺炎放线杆菌XT0404株，通过动物回归试验复制了猪的传染性胸膜肺炎；由于临床了检测的阳性率很高而细菌的分离率却很低，为了研究其原因，研究了链球菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、变形杆菌和大肠杆菌对胸膜肺炎放线杆菌血清学检测的干扰；为提高检测的准确度，建立了基于融合表达的外膜脂蛋白上的ELISA检测方法；同时改进了链霉菌中的PCR定向突变系统，并将改进后的PCR定向突变系统应用的到胸膜肺炎放线杆菌中来失活毒素Ⅳ的ORF1，主要研究内容包括： 1．XT0404株的分离鉴定及动物回归试验 利用TSA培养基，从湖南湘潭一猪场的病料上分离出了胸膜肺炎放线杆菌，经鉴定为血清型2，命名为XT0404，研究了该菌的药物敏感性及小白鼠的半数致死量；还利用该菌人工感染胸膜肺炎放线杆菌抗体阴性的猪，复制出了典型的传染性胸膜肺炎，观测了发病猪的临床症状，制备了病理切片及电镜切片来观测其病理变化；对耐过胸膜肺炎放线杆菌XT0404株感染的猪又进行了其它血清型的人工感染试验。 2．PCR定向突变系统在胸膜肺炎放线杆菌中的建立 PCR定向突变系统是一个比较新的突变系统，主要是利用了PCR引物两端的缺
陈凯[4]2007年在《淄博地区猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及免疫预防研究》文中研究表明猪传染性胸膜肺炎(Porcine Pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae,APP)引起的一种常见的呼吸道传染病,各年龄的猪只均可感染。猪群感染胸膜肺炎放线杆菌后,当遇到气候环境突变,通风不良等应激因素时,猪只抵抗力下降,可诱发本病,主要表现为精神沉郁,体温升高,呼吸困难等临床症状,并出现特征性的出血性肺炎和胸膜炎。本病在世界各养猪国家普遍存在,近年来,流行日趋严重,成为大规模养猪的五大疫病之一。本研究共分为二部分:第一部分:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定本实验对分离自淄博市不同地区的疑似胸膜肺炎放线杆菌进行分离培养、生化鉴定、PCR鉴定、药敏试验、动物实验等研究。研究结果发现该分离菌中有20株细菌为多形态、革兰氏阴性杆菌;生化实验和PCR扩增鉴定结果表明所分离的上述20株菌株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。对确诊的20株胸膜肺炎放线杆菌进行血清型鉴定,结果发现在淄博地区流行的胸膜肺炎放线杆菌主要为血清5型和血清7型。其中,血清5型13株、血清7型7株,血清5型为相对优势的血清型。第二部分猪传染性胸膜肺炎放线杆菌油乳剂二价灭活疫苗的制备及小鼠免疫保护试验根据淄博地区猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的流行情况,制备了血清5型、7型二价灭活疫苗。以该疫苗免疫小白鼠,进行同源攻毒保护试验,结果该疫苗在0.6ml/只的免疫剂量下可对小白鼠产生较强的保护作用,用同血清型菌株对免疫后的小白鼠攻毒,仅表现肺脏轻微出血,无死亡,而对照组未经免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡,肺脏严重出血;小白鼠免疫后第5d就可以检测到抗体,并且抗体水平上升较快,到第15d抗体达到最高水平,之后,抗体水平开始下降,但下降幅度不大,可持续1个月左右;用自制的疫苗和市场上购买的疫苗同时对仔猪进行同源攻毒保护实验结果对照组表现明显的胸膜肺炎症状、肺脏严重出血且有两头死亡;市场上购买的疫苗免疫组出现出现明显的厌食、喘气、呼吸困难等急性胸膜肺炎症状;自制疫苗免疫组只有一头出现轻微症状,20h后恢复正常。上述结果表明自制的二价灭活疫苗对胸膜肺炎放线杆菌有坚强的保护作用。
陈建华[5]2005年在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及其APXⅣA基因的PCR检测》文中研究指明本研究采用以牛脑心浸液为基础的液体培养基和巧克力平板接种方法,从某猪场典型传染性胸膜肺炎症状猪的肺脏和扁桃体中分离到1株具有多形性的革兰氏阴性球杆菌。培养特性、生物学特性和生化鉴定结果表明,该分离菌为猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)。采用琼脂扩散试验(GDT)方法,血清型鉴定为1型。 致病性试验表明,分离菌对小白鼠有强致病力,LD_(50)测定为7.2×10~8CFU。滴鼻感染6头30日龄仔猪,每头7.2×10~9CFU/5Kg,症状表现为咳嗽,喷嚏,呼吸极度困难;剖检的特征性病变为肺脏萎缩,并与横隔膜粘连;心包膜与胸膜和横隔膜粘连,并与肺脏有不同程度的粘连。对试验猪进行胸膜肺炎放线杆菌分离发现,接种后60h在两头猪血液中分离到APP,72h在5头猪的血液中分离到APP,粪便里不能分离到病原。 根据GenBank上公布的猪胸膜肺炎放线杆菌的APXⅣA基因序列,设计一对引物,筛选最佳反应参数,建立了猪传染性胸膜肺炎的PCR诊断方法。以胸膜肺炎放线杆菌血清1型、3型和7型标准菌株、本研究所分离的APP,实验室保存的沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌标准株提取的DNA为模板进行PCR检测。结果表明,APP标准株、分离菌株均检测到APXⅣA基因,扩增出的特异片段大小约400bp,而其它对照菌均未检出。 提取试验猪血、粪和组织中的DNA,用PCR方法检测APXⅣA基因,结果表明,接种后36h可以在血液中用PCR方法检测到该基因,检出率4/6;60h后可以从所有接种猪体内的血液中检测到该基因,检出率6/6。粪样中不能检测到该基因。而对组织的检测表明,肺和扁桃体检出率为6/6,心脏(5/6)、心血(5/6)、气管分泌物(5/6)、肠系膜淋巴结(3/6)次之,肾脏未检出。从猪血液、组织中直接提取DNA检测猪胸膜肺炎放线杆菌的APXⅣ基因,缩短了诊断该病的时间,在国内还未见报道。
李耀坤[6]2008年在《胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建及tadD基因功能的初步研究》文中研究表明胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎的病原菌,给全球养猪业造成巨大的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。但由于APP血清型众多,而且各血清型之间交叉保护力较低,给应用传统疫苗对该病进行免疫预防带来了极大的困难。人们采取了各种灭活疫苗、亚单位疫苗的免疫措施和方法来控制和预防该病,但效果均不是十分理想。因此,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。而毒力因子的全面鉴定与功能研究是病原菌致病机理解析和防治产品开发的基础,为此,本论文开展了如下两方面的研究工作:(1) STM转座突变体的构建:信号标签突变(signature-tagged mutagenesis,STM)技术是由Holden等人于1995年建立的一种鉴定病原菌毒力基因的高通量方法。它是以整个基因组为基础的研究病原体致病机制,可在体内对毒力基因进行高通量筛选的一种新方法。本研究用STM技术构建APP的突变体库,用于该菌感染及毒力相关基因的发掘与功能研究。本文用含有Tn10转座标签质粒pLOF/Tag1-48的E.coli S17-1λpir转化子与APP-1型菌株S4074进行接合杂交,目前获得了其中4个标签(Tag3,Tag4,Tag13,Tag14)的211个APP血清1型突变体,为胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库构建和功能基因的发掘奠定了基础。(2) tadD基因的结构与功能研究:flp操纵子广泛存在于细菌和古细菌中。flp操纵子在不同的细菌中有不同的功能,主要与细菌菌落形成,细菌菌毛合成,细菌黏附于宿主特定细胞等功能有关。tadD基因是flp操纵子上的重要基因,但是人们对APP中tadD基因的功能还不清楚。本研究从APP-1型菌株S4074中扩增了tadD基因的上下游片段,将得到的上下游片段,连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEMOC2上,构建缺失tadD基因的重组自杀性质粒pEMAD。以转化了重组自杀性质粒pEMAD的大肠杆菌β2155为供体菌,APP-1型菌株S4074为受体菌进行接合转移。涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上,筛选Cm抗性(Cm~R)蔗糖敏感(Sur~S)的接合子,进一步用PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中。鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生。涂布含10%蔗糖的平皿,并转印到Cm平皿上,筛选出Cm敏感(Cm~S)蔗糖抗性(Sur~R)的克隆,用PCR和RT-PCR鉴定,以确定发生了第二次交换,重组自杀性质粒已经丢失,从而构建tadD基因缺失株。将缺失株和亲本株都进行活菌计数,绘制生长曲线,结果表明,缺失株和与亲本菌比较,生长速度没有明显的变化,说明tadD基因的缺失对S4074的生长无影响。测定亲本菌和缺失菌在Balb/C小鼠体内的毒力,计算LD_(50)的值。结果显示,与亲本菌S4074比较,tadD基因缺失株的毒力与亲本株相比没有明显的变化。本研究还将对缺失株菌毛的形成,缺失株对宿主细胞的黏附及在宿主体内的定殖情况进行研究。
黄红亮[7]2005年在《猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法和胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究》文中提出猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病。该病给集约化养殖业造成严重的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌血清型众多,目前已分离鉴定了15种血清型的APP,其毒力因子非常复杂,型间交叉免疫保护率低,因而该病的诊断与防制相当困难。APP的Apx外毒素是其主要的毒力因子。已证实了ApxⅠ、ApxⅡ与ApxⅢ的溶血活性及对巨噬细胞与嗜中性粒细胞的毒性作用,且ApxⅢ被证实有诱导细胞凋亡的活性,而ApxⅣ仅具有微弱的溶血活性,其它作用尚不清楚。敏感、特异的诊断方法将有利于猪传染性胸膜肺炎的控制。目前我国普遍应用的诊断方法为间接血凝试验(IHA),该方法具有血清型特异性,不适合于对APP的普查。最近发现的ApxⅣ存在于所有血清型APP中,且具有种特异性,适合用于建立可以普查APP的诊断方法。ApxⅣ的另一特点为体内诱导的毒素,而目前市面上用体外培养方法制备的疫苗中均不存在ApxⅣ,因此基于ApxⅣ的诊断方法可以鉴别诊断自然感染猪与疫苗免疫猪。为了建立有效的诊断方法及对APP外毒素作用机制进行深入研究提供特异性单克隆抗体,我们开展了以下工作: 1 apxⅣ基因的克隆与及其在大肠杆菌中的表达 依据APP血清1型的apxⅣ基因序列(GeneBank登陆号:AF021919)合成特异性引物,分叁段从APP 0306SYML中分别扩增了apxⅣ基因的5′-端3.6Kb、5′-端2.5Kb和3′-端3.0Kb片断,分别克隆到pMD-18T,获得重组质粒pT apxⅣ3.6、pT apxⅣA5与pT apxⅣA3,并进行了测序:将apxⅣA5与apxⅣA3分别克隆到质粒pET-28b的T7启动子下游,构建了重组原核表达质粒pET apxⅣA5与pET apxⅣA3,分别用于表达ApxⅣ N-端与C-端蛋白,转化E. coli BL21(DE3)后经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白的分子量分别为90kDa与115kDa,分别命名为rApxⅣAN与rApxⅣAC,表达产物主要以包涵体形式存在,Western blot证实表达产物具有良好的反应原性。 2 鉴别诊断方法的建立 用大肠杆菌表达的重组蛋白rApxⅣAN建立了ApxⅣ-ELISA方法。用方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为2.97μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:80。通过检测53份猪传染性胸膜肺炎阴性血清,确定该方法的临界值为0.336。该方法的重复性良好。用该方法从副猪嗜血杆菌(HPS)、产毒素巴氏杆菌(DNT~+Pm)、大肠杆菌(E. coli)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪衣原体(CP)的标准阳性血清及APP全菌灭活苗与类毒素菌苗免疫猪血清中检测不到ApxⅣ抗体,而从APP活菌感染的动物血清中能检测到ApxⅣ抗体,说明该方法不仅具有种特异性,只能用于APP感染的检测,还可以鉴别诊断全菌灭活疫苗或亚
刁有祥[8]2005年在《猪胸膜肺炎放线杆菌分子流行病学研究》文中认为猪传染性胸膜肺炎(Porcine pleuropneumonia)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度传染性、致死性呼吸道病,以急性出血和慢性的纤维素性坏死性胸膜炎病变为主要特征。本病对各种猪均易感,在新引进猪群多呈急性爆发,其发病率和死亡率常在20%以上,最急性型的死亡率可高达80%～100%。该病在我国的发生呈逐年上升趋势,已成为危害养猪业最严重的疾病之一,给我国养猪业造成严重的经济损失。本研究根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计一对引物,扩增特异的650bp 核酸片段,建立了PCR 检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明,12 个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp 特异性的核酸片段,而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR 的最低检出限量为500 个放线杆菌,表明我们建立的PCR 检测方法敏感性高、特异性强。利用建立的PCR 检测方法对22 株从山东省不同地区分离的疑似放线杆菌菌株进行检测,结果14 株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明,病变部位不同,胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同,其中以扁桃体的检出率最高。该方法的建立为胸膜肺炎放线杆菌的诊断和鉴定提供了良好的方法。利用PCR 反应扩增出胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因650bp 的DNA,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针与不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌均能发生特异性杂交,而与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌等细菌的核酸杂交均为阴性。对胸膜肺炎放线杆菌的最低检出限量为10×102个放线杆菌。对疑似胸膜肺炎放线杆菌感染病变组织DNA 检测结果表明,在扁桃体、鼻腔、气管、肺脏均可检测出胸膜肺炎放线杆菌,以扁桃体的检出率最高。该研究为猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。猪胸膜肺炎放线杆菌有12个血清型,不同国家和地区流行的APP 血清型不同,而不同血清型的APP 所产生的Apx 毒素不同。本研究从山东省不同地区采集的85 份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌(APP)的分离鉴定,采用凝集试验和PCR 方法对分离菌株进行血清型和Apx 毒素型的检测。结果从山东省不同地区分离到20 株分属5 个血清型的胸膜肺炎放线杆菌。其中,血清7 型6
朱岩昆[9]2013年在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析》文中进行了进一步梳理猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。该致病菌引起的主要病症为肺出血、坏死和纤维素性渗出等。该病于1957年首次报道，自报道以来该病已在世界范围内广泛流行，并给许多国家的养猪产业造成了严重的经济损失。针对该病治疗的越早，经济损失也越少的特点，建立一种快速、灵敏、高效的诊断方法已成为新的研究热点。本研究根据胸膜肺炎放线杆菌表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA分别设计一对引物，可以特异性扩增出637bp和431bp的目的片段。运用多重PCR技术，建立一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。结果显示，已知的胸膜肺炎放线杆菌血清1型、3型、5a型、8型、10型均能扩增出特异性的目的片段。特异性检验时，血清型5a能扩增出目的片段，而其他对照细菌均未扩增出相应的目的片段；根据该多重PCR方法对临床分离的通过生理生化分析鉴定的5株疑似猪胸膜肺炎放线杆菌进行了分子鉴定，其中有4株鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌。以血清5a型作为待检菌进行灵敏性验证时，发现最低检出菌量为50个。表明通过表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA建立的多重PCR方法灵敏度高，特异性强。该PCR方法的建立，为猪传染性胸膜肺炎的诊断提供了一种快捷高效的方法。为了指导临床用药，筛选出合适的临床药物，对以前分离的通过生理生化分析等鉴定和本次多重PCR确认的App进行了药敏试验和最小抑菌浓度（Minimum InhibitoryConcentration, MIC）试验，确认的4株App仅对10种临床常用药物中的头孢噻呋、阿米卡星、左旋氧氟沙星敏感，其它7种药物不敏感。对敏感药物进行MIC分析发现，左旋氧氟沙星对xx-1、xx-2、xx-3、xx-5四株菌株的MIC值分别为6.25/2~2、6.25/2~1、6.25/2~3、6.25/2~3，阿米卡星的MIC值分别为6.25/2~2、6.25/2~1、6.25/2~2、6.25/2~3，头孢噻呋的MIC值分别为37.5/2~2、37.5/2~2、37.5/2~3、37.5/2~4。通过药敏试验和最小抑菌浓度试验给临床用药及防治提供参考。App的毒力因子主要包括外毒素（Apx）、荚膜多糖（CPS）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（TBp）等，近年的研究热点主要集中在外毒素，所以本研究克隆并构建了pMD-ApxⅠA、pMD-ApxⅡA、pMD-OmpD15载体，为序列分析及其后续研究奠定基础。ApxⅠA和ApxⅡA蛋白结构分析发现，ApxⅠA毒素蛋白α螺旋存在于16~47aa，251~269aa，344~358aa，530~546aa，β折叠分布较均匀，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为1~185aa，407~979aa；ApxⅡA毒素蛋白α螺旋存在于70~90aa，172~190aa，248~275aa，207~431aa，446~469aa，812~834aa，β折叠除在361~406aa有较大折迭外其他折迭较小，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为418~918aa。毒力因子Omp D15（Omp D15）是App一个重要的的表面抗原蛋白，蛋白结构分析表明其存在的抗原表位比较多，具有一定免疫原性，适合作为抗原抗体检测的重要靶标。因此本文以构建的pMD-D15载体为基础，构建了pET32a-OmpD15表达载体并在Rostta细胞中得到了表达，重组蛋白以包涵体的形式存在，通过梯度透析法获得纯化的重组蛋白。用初步纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠获得抗血清，以破碎的App作为抗原用ELISA方法检测抗血清，结果显示抗OmpD15血清能识别App，且3号免疫小鼠效价最高；Western-blot分析发现该重组蛋白可与抗App血清型5a血清中的抗体发生特异性反应，结果表明本实验所获得的D15重组蛋白具有良好的抗原性。用最小致死量App攻毒Balb/c小鼠，以D15重组蛋白作为抗原，ELISA方法监测小鼠体内抗体水平变化，发现攻毒后第叁天即可在小鼠体内检测到OmpD15抗体的存在。通过OmpD15的原核表达、纯化及抗原性分析等的研究，为以表面抗原蛋白OmpD15开发亚单位疫苗、建立猪胸膜肺炎的ELISA诊断方法提供了理论基础及实验依据。
石琴[10]2007年在《胸膜肺炎放线杆菌毒素IV基因的克隆表达及间接ApxIVA3-ELISA方法的初步建立》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。大量研究工作证实，APP产生的溶血外毒素是其最重要的毒力因子和主要的保护性抗原，而只有毒素四(ApxⅣ)是所有15个血清型都分泌的，因此对其进行研究具有很重要的意义。本试验旨在应用分子生物学技术，对编码ApxⅣ3’-端的ApxⅣA部分基因片段在原核系统中进行表达，初步建立间接ApxⅣA3-ELISA方法，为猪传染性胸膜肺炎的新型诊断方法的建立奠定基础。本试验以提取的猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出ApxⅣA3特异性基因片段，PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切及序列分析鉴定后，亚克隆到原核表达载体pET-28a中，构建成重组表达质粒pET-ApxⅣA3，序列分析结果表明：Hpn-405菌株与标准8型基因同源性达99.8％。将重组表达质粒pET-ApxⅣA3转入到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中，以IPTG进行诱导重组蛋白的表达，SDS-PAGE检测结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为18Ku，与预期片段大小相符；将经过超声破碎的菌液离心取沉淀经尿素洗涤溶解后用镍金属螯合层析柱进行纯化。Western-blot分析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。在经过变性、复性及纯化后，将pET-ApxⅣA3融合蛋白作为抗原，以APP感染猪阳性血清作为抗体初步建立了间接ApxⅣA3-ELISA方法，结果证明pET-ApxⅣA3融合蛋白可以特异的与感染猪血清结合，而和免疫猪血清和阴性猪血清无论抗原抗体何种浓度都不能发生反应，说明pET-ApxⅣA3融合蛋白具有很好种特异性和生物学活性，可以用于胸膜肺炎感染的鉴定及区分感染猪和免疫猪，有很好的应用前景。
参考文献：
[1]. 胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与免疫防制[D]. 刘春花. 西北农林科技大学. 2003
[2]. 胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及ELISA试剂盒的研制与应用[D]. 贾凡. 华中农业大学. 2007
[3]. 胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统的初步建立及胸膜肺炎放线杆菌OmlA-ELISA检测方法的建立[D]. 刘军发. 华中农业大学. 2005
[4]. 淄博地区猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及免疫预防研究[D]. 陈凯. 山东农业大学. 2007
[5]. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及其APXⅣA基因的PCR检测[D]. 陈建华. 四川农业大学. 2005
[6]. 胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建及tadD基因功能的初步研究[D]. 李耀坤. 华中农业大学. 2008
[7]. 猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法和胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究[D]. 黄红亮. 华中农业大学. 2005
[8]. 猪胸膜肺炎放线杆菌分子流行病学研究[D]. 刁有祥. 山东农业大学. 2005
[9]. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析[D]. 朱岩昆. 河南师范大学. 2013
[10]. 胸膜肺炎放线杆菌毒素IV基因的克隆表达及间接ApxIVA3-ELISA方法的初步建立[D]. 石琴. 中国农业科学院. 2007
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