基于贵金属纳米材料的新型光学传感器构建及其应用于生物标志物检测研究

论文摘要

贵金属纳米材料具有极大的表面积、表面等离子体共振效应、介电限制效应等特点,这些特点使其具有优良的物理、化学、光学性能,包括稳定性好（无漂白现象）、产量高、导电能力强、催化性能高以及生物相容性好,因此被广泛用于电化学、生物传感分析以及光热治疗等领域。本论文利用贵金属纳米材料极大的表面积以及荧光、表面等离子体共振效应、等离子体共振耦合效应等特性,结合DNA放大技术,以尿嘧啶糖基化酶、miRNA、阿尔茨海默症蛋白等具有重要临床检测意义的生物标志物为研究对象,构建了以下三种基于贵金属纳米材料与DNA纳米技术有机结合的新型光学生物传感器:（1）基于三通路结构驱动的链置换反应及DNA walker驱动的G-四联体球形核酸酶的形成用于催化鲁米诺的化学发光反应,构建了一种高效、高灵敏性、高信噪比的用于尿嘧啶糖基化酶检测的化学发光传感器。该体系的组成部分有:三通路结构和球形核酸结构,其中,三通路结构包括三种链:封闭walker功能的DNA发夹、带有U碱基的探针、维持体系稳定的底物链。球形核酸结构（SNA）是以纳米金为核表面DNA为壳所形成的核壳结构,在纳米金的表面修饰有两种链,一种链用于和三通路结构中的具有walker功能的发夹杂交,另一种链为被封闭的可形成G-四联体DNA酶的发夹。目标物尿嘧啶糖基化酶特异性切除UP探针中的U碱基形成无嘌呤无嘧啶位点（AP位点）,在内切酶IV的作用下,使得UP探针断裂并暴露出位于SA链中的toehold端,此时,球形核酸中的链将和SA链杂交,引发toehold介导的链置换反应及后续的DNA walker反应,最终纳米金表面被封闭的可形成G-四联体的DNA全部被释放,在血红素和K+存在的条件下,形成G-四联体球形核酸酶,其具有非常强的类过氧化物酶活性,该结构能够在H2O2存在的条件下催化鲁米诺产生化学发光信号。与传统的DNA酶催化鲁米诺发生化学发光反应不同的是,将用于形成G-四联体的DNA链修饰到纳米金的表面,因纳米金具有很大的比表面积,起到一种富集的效果,从而显著提高所形成的G-四联体球形核酸酶的类过氧化物酶活性,使化学发光信号显著增强。该方法具有信噪比高、灵敏度优良且选择性良好的特点,为检测肿瘤细胞内尿嘧啶糖基化酶的浓度提供简单有效的平台。（2）基于DNA三通路驱动的链置换技术和light-up的银簇荧光探针结构,构建了一种灵敏、简单的用于miRNA检测的荧光生物传感器。该方法的分析单元是由封闭G-rich序列的DNA发夹、目标链的互补链、维持体系稳定的底物链以及产生荧光信号的银簇探针这四部分组成。目标物miRNA通过和其互补链的杂交引发三通路结构发生变化,从而使被封闭的位于发夹中的toehold端被暴露,银簇探针和toehold端进行杂交,引发了toehold介导的链置换反应并使得银簇部分靠近富G碱基部分,银簇荧光被显著增强。该体系借助链置换反应实现链的快速迁移,不借助于酶,既减少了成本又能有效地降低了酶对银簇发光的影响。该方法具有操作简单、信噪比高,荧光响应强等优势,为miRNA的检测提供可靠的依据。（3）基于目标物介导的等离子体耦合所产生的表面增强拉曼散射（SERS）效应,构建了一种简捷、快速、灵敏的能够同时检测两种阿尔茨海默症核心标志物的传感平台。该方法通过设计了两种标记有不同拉曼染料（DTNB和4-AATP）的纳米金,在两种纳米金的表面分别修饰有polyA封闭的目标物的适配体,其中适配体用于捕获目标物,polyA寡核苷酸序列是用来代替巯基锚定AuNPs的表面。在目标物Tau蛋白和β淀粉样肽低聚体分别和各自的适配体特异性地结合后,polyA封闭的寡核苷酸将和AuNPs表面之间的结合发生松动,导致纳米金在体系中发生团聚,产生等离子体共振耦合效应,增强AuNPs之间染料的SERS信号。这是首次将polyA封闭的AuNPs用于蛋白标志物的检测。该方法具有非常高的灵敏性和特异性,为阿尔茨海默症的早期临床诊断提供了简单可靠的方法。

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摘要

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第一章绪论

1.1 生物标志物

1.1.1 生物标志物概述

1.1.2 生物标志物检测目前存在的问题

1.2 光学生物传感器

1.2.1 光学生物传感器概述

1.2.2 常见的几种光学生物传感器的应用

1.3 贵金属纳米材料

1.3.1 贵金属纳米材料的概述

1.3.2 贵金属纳米材料的性质

1.3.3 常见的贵金属纳米材料及在光学生物传感中的应用

1.4 常见的DNA纳米技术及其应用

1.4.1 Toehold介导的链置换反应

1.4.2 DNA walker技术

1.5 本论文的研究构想

第二章基于三通路结构和DNA walker的化学发光生物传感器构建及其在尿嘧啶糖基化酶检测中的应用

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 材料和试剂

2.2.2 仪器

2.2.3 纳米金及球形核酸的制备

2.2.4 尿嘧啶糖基化酶的检测

2.2.5 尿嘧啶糖基化酶抑制剂的检测

2.2.6 细胞培养和样品制备

2.3 结果与讨论

2.3.1 实验原理

2.3.2 球形核酸的表征

2.3.3 尿嘧啶糖基化酶检测的可行性研究

2.3.4 实验条件的优化

2.3.5 尿嘧啶糖基化酶的定量检测

2.3.6 特异性验证

2.3.7 尿嘧啶糖基化酶抑制剂活性分析

2.3.8 实际样品检测

2.4 小结

第三章基于light-up银簇探针的荧光生物传感器构建及其在miRNA检测中的应用

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 材料和试剂

3.2.2 仪器

3.2.3 银纳米簇的制备

3.2.4 miR-122 的检测

3.2.5 凝胶电泳表征

3.2.6 透射电镜表征

3.2.7 细胞培养和样品制备

3.3 结果与讨论

3.3.1 实验原理

3.3.2 用于TWJ驱动的链置换反应的凝胶电泳表征

3.3.3 miR-122 检测的可行性研究

3.3.4 miR-122 的定量检测

3.3.5 特异性验证

3.3.6 实际样品检测

3.3.7 小结

第四章基于PolyAapt-AuNP交联体的拉曼生物传感器构建及其在阿尔茨海默症核心标志物检测中的应用

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 材料和试剂

4.2.2 仪器

4.2.3 Aβ1-42 低聚体的制备

4.2.4 纳米金的制备和polyA/拉曼染料/纳米金交联体的制备

4.2.5 Aβ1-42 低聚体和Tau蛋白的检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 实验原理

4.3.2 polyA适配体/染料/纳米金交联体的表征

4.3.3 Aβ1-42 低聚体和Tau蛋白检测的可行性研究

4.3.4 实验条件的优化

4.3.5 Tau蛋白和Aβ1-42 低聚体的定量检测

4.3.6 特异性验证

4.3.7 实际样品检测

4.3.8 小结

第五章结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张雪

导师: 王玉

关键词: 贵金属纳米材料,光学传感器,生物标志物,链置换技术

来源: 济南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,医药卫生科技,信息科技

专业: 生物学,材料科学,生物医学工程,自动化技术

单位: 济南大学

分类号: R318;TP212.14;TB383.1

DOI: 10.27166/d.cnki.gsdcc.2019.000246

总页数: 92

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