PEDV传统致弱试验和免疫学快速检测方法的研究

论文摘要

本研究对猪流行性腹泻病毒（PEDV）强毒株进行了细胞传代培养致弱试验。制备了抗PEDV的单克隆抗体。利用双抗体夹心法原理,运用胶体金免疫层析技术,初步建立了猪流行性腹泻（PED）的快速检测方法,取得了如下研究进展。将PEDV中国分离株CHYJ130330株从150代开始连续传代至214代,对收集的病毒液每10代测定TCID50,结果表明到TCID50随着传代下降。通过口腔灌服3日龄仔猪进行攻毒试验,结果标明,强毒组、F150组、F200组、空白组发病率依次为100%、100%、0%、0%,死亡率依次为60%、0%、0%、0%,RT-PCR PEDV病毒阳性检出率依次为100%、80%、20%、0%。结果表明病毒经传代培养后,毒力有所减弱。将猪流行性腹泻病毒（PEDV）中国南方分离株CHYJ130330株用Vero细胞扩大培养,通过硫酸铵沉淀及蔗糖密度梯度离心将PEDV纯化、浓缩。以PEDV为免疫原,免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA筛选、有限稀释法多次克隆,获得11株能稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经小鼠腹腔接种,测得8株单抗效价在1:1.6×104以上,6株有较好的特异性。对其中效价高、特异性好的几株进行了纯化,通过硫酸铵沉淀及ProteinG亲和柱层析法纯化腹水获得了高纯度的单克隆抗体。对纯化后单抗用双抗体夹心ELISA法进行配对。其中细胞株5A10和3A11分泌的抗体配对成功,在此基础上建立了胶体金免疫层析方法。通过对所建立胶体金免疫层析方法进行评价,重复性试验表明该方法重复性好;检测PEDV阳性标准样的最低检测限为7.8×103TCID50/mL,表明该方法敏感性较高;检测伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和传染性胃肠炎病毒（TGEV）结果为阴性,表明该方法特异性好。用该方法和RT-PCR方法对115份临床病料进行对比检测,结果显示两种方法阳性检出率分别为55.6%和53.9%,与RT-PCR符合率为93%。本方法的建立为开发快速检测PEDV的胶体金免疫层析试纸条产品奠定了基础。

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Abstract

第1章文献综述

1.1 猪流行性腹泻研究进展

1.1.1 猪流行性腹泻病毒形态结构

1.1.2 基因组及编码蛋白

1.1.3 猪流行性腹泻病毒的流行及危害

1.1.4 猪流行性腹泻病毒检测方法研究进展

1.2 单克隆抗体研究进展

1.2.1 单克隆抗体在临床上的应用

1.2.2 杂交瘤细胞筛选技术

1.3 研究的目的与意义

第2章 PEDV病毒的传代致弱试验

2.1 材料

2.1.1 试剂

2.1.2 仪器

2.1.3 毒株及试验动物

2.2 方法

2.2.1 Vero细胞的培养

2.2.2 PEDV病毒的培养

2.2.3 PEDV传代病毒的滴度测定

2.2.4 PEDV毒力测定试验

2.2.5 PEDV对不同细胞的适应性培养研究

2.3 试验结果

2.3.1 PEDV在 Vero上的细胞病变

2.3.2 TCID50测定结果

2.3.3 PEDV致病力检测结果

2.3.4 PEDV对不同细胞的适应性研究结果

2.4 小结及讨论

第3章单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析法的建立

3.1 材料

3.1.1 试剂

3.1.2 仪器

3.1.3 毒株、试验动物及临床病料

3.1.4 试剂配制

3.2 方法

3.2.0 免疫原的制备

3.2.1 动物免疫

3.2.2 小鼠血清效价测定

3.2.3 饲养层细胞的准备

3.2.4 细胞融合

3.2.5 筛选

3.2.6 克隆及建株

3.2.7 阳杂交瘤细胞的冻存

3.2.8 杂交瘤细胞复苏

3.2.9 腹水的制备

3.2.10 腹水的初步鉴定

3.2.11 腹水纯化

3.2.12 单抗配对及鉴定

3.2.13 胶体金免疫层析法的建立

3.2.14 胶体金免疫层析试纸条性能初步评价

3.3 试验结果

3.3.1 纯化抗原的鉴定结果

3.3.2 小鼠血清效价测果

3.3.3 阳性杂交瘤细胞建株

3.3.4 腹水初步鉴定

3.3.5 单抗配对结果及鉴定

3.3.6 胶体金免疫层析试纸条制备结果

3.4 小结与讨论

结论与展望

参考文献

致谢

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 贾宇旻

导师: 贾杏林,唐勇,贾爱卿

关键词: 猪流行性腹泻病毒,单克隆抗体,胶体金免疫层析

来源: 湖南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 湖南农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000690

总页数: 62

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