利用甲基化抑制剂研究对虫黄藻进行基因组甲基化修模式影响以及在不同光照条件下光系统基因体甲基化饰水平与甲基化转移酶基因和光系统基因表达变化

论文摘要

表观遗传学是指在不改变DNA序列的条件下,能够产生可遗传的基因表达变化,主要包括DNA甲基化修饰,siRNA干扰,组蛋白修饰等,其中DNA甲基化修饰是目前在表观遗传学中最为成熟的研究。该研究领域覆盖动物,植物,真菌等各个研究领域,但是目前在甲藻等海洋浮游植物、尤其是虫黄藻的基因组甲基化修饰方面研究很少。本次研究以虫黄藻Fiugacium kawagutii（旧名Symbiodinium kawagutii）为研究对象,主要依据虫黄藻F.kowagutii的基因组序列中广泛存在的甲基化转移酶基因（DNMT）来初步探究虫黄藻的基因组甲基化修饰模式以及依据该模式进一步探究在光照胁迫条件下与光吸收相关基因的甲基化修饰水平与调控捕光复合物基因表达之间的联系。主要研究内容与结果包括:1用不同浓度的甲基化抑制剂5-AZA-CdR（0,5μM,20μM,100μM）和Zebularine（0,100μM,200μM,500μM）处理后,观察虫黄藻细胞相关生理变化,结果发现,随着甲基化抑制剂5-AZA-CdR和Zebularine的浓度增高,细胞生长速率明显受到抑制。其中5-AZA-CdR处理后,细胞大小,内容物含量,DNA含量和光合作用效率与正常组比较均显示出明显差异。选取最高浓度药物处理的样品 5-AZA-CdR（1OOμM）)和 Zebularine（200μM,500μM）进行重亚硫酸盐测序,结果发现,两种甲基化抑制剂处理后的样品甲基化水平没有发生改变。因此,我们认为,F.kawagutii中缺乏能够与甲基化抑制剂发生反应的维持型甲基化转移酶DNMT1和典型的起始型甲基化转移酶DNMT3A和DNMT3B,且大多数甲基化区域存在于反转录转座子序列上。而药物处理后产生的生理反应则是由药物所产生的细胞毒性所引起的。2基于前面F kawagutii 的甲基化模式和特有的甲基化转移酶SymbioDIRS-DNMT3来探究在光照胁迫条件下,其捕光复合物相关基因多甲藻素和叶绿素a结合蛋白（peridinin-chlorophyll a binding protein PCP）,捕光复合物中心蛋白（intrinsic lightharvesting proteins LHC）多甲藻素-叶绿素a/c结合蛋白（peridinin-chlorophyll a/c binding protein acpPC）基因体区域甲基化水平变化与它们基因表达之间的关系。同时三个基因在低光条件下的基因体甲基化水平随着基因表达水平下调而显示增加,不变和下降的差异。而SymbioDIRS-DNMT3的转录水平则随着光照强度的增加而提高。这些结果使我们猜想外界环境因子的变化确实可以影响虫黄藻中SymbioDIRS-DNMT3的转录水平变化,从而影响到基因组甲基化水平的变化并最终调控部分相关基因的表达。

论文目录

摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 虫黄藻的生态学意义

1.2 DNA甲基化模式与研究方法

1.2.1 DNA甲基化模式

1.2.2 探索DNA甲基化的主要研究方法

'-AZA-deoxycytidine （5-AZA-CdR）和Zebularine'> 1.2.2.1 DNA甲基化抑制剂5^'-AZA-deoxycytidine （5-AZA-CdR）和Zebularine

1.2.2.2 重亚硫酸盐测序

1.2.2.3 甲基化特异性PCR （MS-PCR）与重亚硫酸盐测序PCR

1.3 虫黄藻中捕光复合物与光胁迫条件下反应

1.3.1 虫黄藻中的捕光复合物

1.3.1.1 多甲藻素和叶绿素a结合蛋白（PCP）

1.3.1.2 多甲藻素-叶绿素a/c结合蛋白（acpPC）

1.3.2 虫黄藻在光照胁迫条件下的反应

1.4 本论文研究目的与意义

第2章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 藻种以及培养条件

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验试剂配置

2.2 实验仪器

2.3 生物学信息应用软件与网站

2.4 实验方法

2.4.1 PI染色步骤

2.4.2 DNA提取步骤

2.4.3 DNA重亚硫酸盐处理步骤

2.4.4 甲基化特异的PCR（MS-PCR）

2.4.5 亚硫酸氢盐处理后的PCR（BSP）

2.4.6 RNA提取步骤

2.4.7 基因组DNA消除与cDNA合成

2.4.8 PCR反应体系

2.4.9 PCR产物的回收纯化

2.4.10 PCR产物连接与克隆

2.4.11 质粒提取与检测

2.4.12 RT-qPCR标准物的制备

2.4.13 RT-qPCR

第3章甲基化抑制剂对虫黄藻的生理及DNA甲基化修饰的影响

3.1 摘要

3.2 引言

3.3 方法与材料

3.3.1 藻种培养与试剂处理

3.3.2 细胞生长速率,细胞大小,内容物含量与DNA含量测定

3.3.3 光合效率测定

3.3.4 DNA提取进行重亚硫酸盐测序

3.4 实验结果

3.4.1 甲基化抑制剂5-AZA-CdR处理条件下细胞生长速率变化

3.4.2 甲基化抑制剂5-AZA-CdR处理条件下细胞大小,内容物含量以及细胞内DNA含量变化

3.4.3 不同浓度甲基化抑制剂5-AZA-CdR处理条件下光合作用效率

3.4.4 甲基化抑制剂Zebularine处理条件下细胞生长速率,细胞大小和内容物含量变化

3.4.5 最高浓度条件甲基化抑制剂5-AZA-CdR和Zebularine处理条件下与控制组基因组甲基化水平检测

3.5 讨论

3.5.1 虫黄藻特殊壳结构,甲基化抑制剂的药物毒性与细胞生理反应之间的关系

3.5.2 虫黄藻中是否存在能够与甲基化抑制剂发生反应的甲基化转移酶

3.6 小结

第4章在不同光照条件下探索虫黄藻光系统基因甲基化、基因表达水平、及甲基化酶的关系

4.1 摘要

4.2 引言

4.3 方法材料

4.3.1 F.kawagutii细胞培养与光合效率的测定

4.3.2 基因序列的注释与RT-qPCR引物设计

4.3.3 DNA提取,重亚硫酸盐处理

4.3.4 甲基化特异性PCR （MSP）与重亚硫酸盐测序PCR（BSP）

4.3.5 RNA的提取与cDNA合成以及基因表达分析

4.4 结果

4.4.1 细胞增长速率与光合作用测定

4.4.2 甲基化特异的PCR以及结果与P.tricornutum进行比较

4.4.3 重亚硫酸盐测序PCR （BSP）

4.4.4 不同光照条件下三个基因转录水平的差异

4.4.5 Symbio-DIRS-DNMT3基因进化树构建与基因表达分析

4.5 讨论

4.5.1 两种不同的方法探究F.kawagutii基因组甲基化水平

4.5.2 基因表达与基因体之间甲基化水平的关系

4.5.3 Symbio-DIRS-DNMT3基因表达与基因体甲基化之间的关系

4.6 小结

第5章实验结论与展望

5.1 实验结果总结

5.2 主要结果

5.3 论文特色与创新点

5.4 不足之处与展望

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨峰

导师: 林森杰

关键词: 虫黄藻,甲基化修饰,基因组甲基水平,甲基化转移酶,光照强度,捕光复合物,基因体甲基化水平

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q943.2

总页数: 94

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利用甲基化抑制剂研究对虫黄藻进行基因组甲基化修模式影响以及在不同光照条件下光系统基因体甲基化饰水平与甲基化转移酶基因和光系统基因表达变化

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