李萍[1]2004年在《人乳头瘤病毒16型（新疆株）E6基因疫苗免疫小鼠的研究》文中提出人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因疫苗免疫小鼠的研究 人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV )是人类肿瘤病毒病因中重要的DNA 病毒, 高危HPV 易引起宫颈癌等恶性肿瘤, 其中最常见的是HPV 16 型和HPV 18 型。大量研究资料证明，50%的宫颈癌与HPV16感染相关。HPV16的E6基因持续表达E6蛋白，而这种持续表达是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的，并且，正常组织中不存在这种蛋白。因此，E6蛋白就成为HPV16相关宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原。本论文研究工作主要基于本实验室研究人员从新疆维吾尔妇女宫颈癌组织中所克隆的HPV16E6基因，展开了叁个方面的工作，主要包括HPV16E6蛋白在大肠杆菌中的高效表达、HPV16E6多克隆兔抗血清的制备以及HPV16E6基因疫苗的构建及其免疫小鼠的研究。研究工作的基础为根据GenBank上已发表的标准株HPV16基因组序列，分析设计了特异性引物，分别经PCR扩增出新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中的HPV16E6基因，连接上pUCm-T载体，经DNA序列测定后，结果与GenBank中标准株HPV16E6基因进行同源性比较，确定已克隆出的新疆株HPV16E6基因序列与德国标准株的基本相同。从而为针对我国新疆地区宫颈癌患者组织中HPV16（新疆株）E6基因的疫苗研究提供了基因来源。为了得到检测小鼠抗体所需的抗原蛋白，我们用清华大学李慎涛博士惠赠的pET28a- HPV16E6原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，筛选出转化体，用IPTG诱导表达，SDS-PAGE鉴定诱导效果，发现在18kDa处有目的蛋白的表达。在大量诱导表达以后，离心法收集菌体，超声裂解细胞及溶菌酶处理后，离心获得包涵体沉淀，于适当的条件下洗涤，从包涵体中纯化E6蛋白，蛋白电泳检测后以标准蛋白MARKER为标准通过光密度扫描定量蛋白含量，结果表明每升菌液可诱导产生E6蛋白大约50mg左右，E6蛋白在包涵体中的纯
张茂祥[2]2003年在《人乳头瘤病毒16型（新疆株）E7 DNA疫苗的研究》文中研究表明人乳头瘤病毒16型E7相关DNA疫苗的研究 人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type sixteen，HPV16)是诱发妇女宫颈癌的启动因子，并与人类多种恶性肿瘤的发生密切相关。它的早期基因E7是致癌的关键基因，在宫颈癌细胞中持续表达并为其恶化表型的维持所必需。针对于HPV16E7的疫苗研究，将有可能为HPV16病毒引起的宫颈癌等疾病的预防和治疗带来新的途径。HPV16E7蛋白是肿瘤特异性排斥抗原，含多个线性B细胞表位、CD8~+T细胞表位和CD4~+CTL表位，与MHC分子亲合力高，抗原性强，是设计HPV疫苗公认的靶抗原。本研究主要开展新疆维吾尔妇女宫颈癌组织中HPV16E7基因的克隆与突变、融合蛋白的原核表达、抗血清的制备、野生型与各种突变型HPV16E7基因DNA疫苗免疫小鼠的研究。 研究工作首先根据GenBank上已发表的标准株HPV16基因组序列，分析设计了特异性引物，分别经PCR扩增出新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中的HPV16E7基因，连接上pMD18-T载体，经DNA序列测定后，结果与GenBank中标准株HPV16E7基因进行同源性比较，确定已克隆出的新疆株HPV16E7基因序列与德国标准株的相同。从而为了解我国新疆地区宫颈癌患者组织中HPV16(新疆株)E7基因的结构特点积累了资料。 为了研究HPV16E7疫苗的需要，我们利用Werner博士惠赠的pGEX-2T-E7原核表达质粒转化入大肠扪：菌BL21(DE3)中，用IPTG诱导后，裂解细胞，用SDS-PAGE鉴定诱导效果，发现在43kDa处有融合蛋白的表达。在大量诱导表达以后，用谷胱苷肽琼脂糖珠亲和纯化，蛋白电泳检测后以Bradford法定量蛋白含量，结果表明每升菌液可诱导产生融合蛋白20mg。将纯化的GST-HPV16E7蛋白联合弗氏佐剂，分数次免疫新西兰大白兔制备抗血清，以间接酶联免疫吸附(ELISA)测定最终抗血清效价是1： 新疆大学硕士论文60000。分别用毕赤酵母和大肠杆菌表达的E7蛋白为抗原，利用蛋白免疫印迹 （Western blot）检测多克隆抗体，结果表明制备的抗血清具有高的特异性。上述研究制备了高纯度的 HPV 6E7抗原蛋白，获得了高效价、高特异性的抗HPV 6E7的血清，为检测新疆株HP们 6病毒和相关疫苗的研制奠定了基础。 由于己有研究表明野生型HPV 6E7蛋白具有致癌潜力，为了去除或减弱E7的转化活性，根据HPV 6E7基因的特点，我们设计了叁对带有突变位点的引物，经过PCR反应分别对HPV16E7基因的第70位、第172位和第271位的碱基进行点突变，经分别测序鉴定比较分析，结果得到的单点、双点和叁点碱基突变的HPV 6E7的基因。上述工作为进一步研究野生型和各种突变型HPV 6E7基因的功能和DNA疫苗的研制奠定了基础。 根据制备DNA疫苗的要求，我们分别将pMD1载体上的野生型和各种突变型HPV 6E7基因定向克隆到PCDNA3刀上，通过酶切鉴定后，得到野生型、单、双允叁点突变的 HPV 6E7基因的真核表达质粒，即 pCmA3－E7（W、PCDNA3－E7（S）、PCDNA3－E7（D）、PCDNA3－E7（T）。将构建正确的各种重组质粒大量提取纯化，并分别免疫小鼠，对其免疫效果进行ELISA和细胞因子检测。结果表明野生型和各种突变型HPV 6E7基因的DNA疫茵，均能使免疫后小鼠产生明显的抗E7抗体，并且IL＊和YJFN检测结果基本相同。说明在小鼠的免疫实验中，对野生型HPV 6E7基因的突变没有改变原有E7的免疫原性。本研究工作为深入研究人乳头瘤病毒16型新型疫苗进行了有益的探索。
马彩玲[3]2004年在《新疆维吾尔妇女宫颈癌组织HPV16基因分子检测的研究》文中指出目的:人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus,HPV16)是诱发妇女宫颈癌的启动因子,并与人类多种恶性肿瘤的发生密切相关。它的早期基因E6、E7是致癌的关键基因,在宫颈细胞中持续表达并为其癌化表型的维持所必需。新疆是我国宫颈癌高发区,新疆南部维吾尔妇女宫颈癌与HPV16感染密切相关,为进行新疆妇女宫颈癌病因研究及宫颈癌的预防及早期诊断,本文对新疆维吾尔妇女宫颈癌组织进行了HPV16 E6及E7基因的分子检测研究。为进一步了解新疆妇女宫颈癌组织中HPV16E6基因的结构特点,本研究对来自新疆的宫颈癌患者手术或活检标本中的HPV16E6基因进行了克隆及一级结构分析;对新疆地区宫颈不同病变组织进行了HPV16E6、E7基因检测;荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)分析,探索新疆妇女宫颈不同病变组织中HPV16E6、E7基因的相对含量与病情变化的关系,为宫颈癌的筛查、早期诊断、预防及愈后评估提供新的分子生物学的方法。HPV16E6、E7蛋白是肿瘤特异性排斥抗原,是设计HPV疫苗公认的靶抗原。本研究开展新疆维吾尔妇女宫颈癌组织中HPV16E6、E7基因的克隆,融合蛋白的原核表达及准备抗血清的制备,为HPV16相关疾病的血清学诊断及HPV16E6、E7的疫苗研究提供物质基础。近年来,有关纳米材料的合成和应用方面的研究工作进展迅速,特别是纳米金,在分子领域的应用已成为研究的热点。研究采用固定于硅烷化片基上的捕获探针,特异性结合单链人乳头瘤病毒16型新疆株E6基新猎医科大学博士学位论文因(HPV 1 6E6)扩增片断,再与互补的纳米金颗粒标记的探针结合,通过银染加强显色,初步建立了金标银染法快速检测HPv 1 6E6 DNA的技术。从而为新疆妇女宫颈癌病因研究及宫颈癌的预防、诊断及治疗的研究提供科学的理论依据。 方法:从浸泡在福尔马林的宫颈癌组织(10例)及福尔马林浸泡后石蜡包埋的宫颈癌(59例)、宫颈上皮内瘤变(eervical intraepithelialneoplasia,CIN65例)及宫颈炎(33例)组织中提取DNA;另外对一批妇科门诊患者(96例)随机取宫颈管的脱落细胞及分泌物,作为对照,用聚合酶链式反应(PCR)检测各组宫颈组织中人乳头瘤病毒16型E6基因(HPV 1 6E6)。从19份新疆维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取组织DNA,作为模板,PCR扩增HPV 1 6E6全长基因,PCR产物直接测序或克隆后测序,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织HPV16E6基因的突变。以新疆妇女宫颈不同病变组织为源材料,以人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因(HpV 1 6E6,AF327851)及HPvl6E7基因作为扩增的靶基因,同时以人p一actin基因片段作为内参照,借助于设计的目的基因引物,两个特异的荧光探针,在筛选的FQ一PCR优化反应体系中,同时对两个基因片段进行扩增,得到HPV 1 6E6及HPV 1 6E7基因的相对含量。使用本实验室从新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中克隆的人乳头瘤病毒16型的E7基因(HPV16E7),以pGEX一ZT载体和大肠杆菌BL21(DE3)原核蛋白表达系统表达HPV16E7融合蛋白(GST,HPV16E7),经亲和纯化定量后得到大量的GsT一HPv16E7融和蛋白。根据HPV 16(新疆株)E6基因编码序列设计引物,从含有HPV 1 6E6基因的质粒中扩增出含HPV 1 6E6基因的DNA片段,将所得片段与pMD 18一T载体连接,转化到JM109大肠杆菌中,筛选的阳性克隆扩增后,提取质粒DNA,酶切,回收目的片段,定向克隆到PET28a中,转化JM109受体菌,从JM109受体菌中提出质粒,再转化到BLZI(DE3)中,筛选出转化体,用IPTG诱导表达,在PAGE上见到所表达的18kD的特异性的HPv16(新疆株)E6蛋白条带。从而为人乳头瘤病毒16型的诊断、检测、疫苗研制等方面的研究提供了物质基础。研究采用固定于硅烷化片基上的捕获探针,特异性结合单链人一2一中文摘要乳头瘤病毒16型新疆株E6基因(HPV 1 6E6)扩增片断,再与互补的纳米金颗粒标记的探针结合,通过银染加强显色,初步建立了金标银染法快速检测HPV16E6 DNA的技术,同时辅以Real一time定量PCR、地高辛斑点杂交进行平行比较和评价,确认了金标银染法检测的有效性。 结果:PCR结果宫颈癌蜡块组织59例中HPv16E6阳性37例(阳性率62.7%);宫颈上皮内瘤变(cIN)组织65例中HPv16E6阳性37例(阳性率56.92%);石蜡包埋宫颈炎组织共33例,HPV16E6阳性22例(阳性率“.67%);而宫颈管脱落细胞及分泌物共%例,HPV16E6阳性3例(阳性率3.13%)。荧光定量PCR结果宫颈癌蜡块组织59例p一actin均阳性,证实DNA提取方法可靠。从19份新疆维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取组织DNA,作为模板,P CR扩增HPV 16E6全长基因,PCR产物直接测序或克隆后测序,14个E6分离片断的测序和序列分析表明,7个(50%)分离株E6基因与原型相同,5个(35.71%)分离株发生了L83V突变;2个(14.29%)分离株发生了L83V/D63E突变,HPV16E6原型和L83V突变型在宫颈癌组织中的分布与其在北美洲的分布接近。对FQ·PCR反应结果中p一actin阳性的宫颈不同病变组织中HPV16E6阳性率及其相对含量进行统计分析,宫颈癌蜡块组织59例,HPV 1 6E6阳性率83 .05%;宫颈上皮内瘤变(CIN)蜡块组织65例,HPV16E6阳性率75.68%;宫颈炎蜡块组织33例,HPV 1 6E6阳性率93 .33%,宫颈脱落细胞标本%例,HpV 1 6E6阳性率3 .29%。pCR及F
陈邦党[4]2007年在《人乳头瘤病毒16型L1基因、小鼠及草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达》文中指出1.人乳头瘤病毒16型L1基因重组腺病毒载体的构建及表达人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV )是一种双链的小DNA病毒。高危型HPV可引起宫颈癌等恶性肿瘤,其中最常见的是HPV 16型和HPV 18型。大量研究资料证明,50%的宫颈癌与HPV16感染相关。因HPV有潜在的致癌性,故HPV疫苗的制备不能采用传统的减毒活疫苗或灭活疫苗。目前,HPV16疫苗研究集中于晚期蛋白L1及L2组成的基因工程亚单位疫苗。HPV16晚期基因L1编码病毒的主要衣壳蛋白,在真核细胞中产生的HPV16L1或L1+L2可高效自行装配成病毒样颗粒(virus like particles, VLPs)。由于VLPs不含DNA成分,且结构和天然病毒颗粒相似,能刺激机体产生抗体,保护机体不受同型别HPV感染而成为引人关注的免疫原。在前期的研究中,我们已经从新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中克隆获得HPV16 L1基因。该基因发生多位点变异,并形成突变的主流模式,这些突变引起HPV16 L1蛋白疏水性和抗原性的改变。L1基因的突变可导致HPV16逃避机体免疫识别,造成HPV16的持续感染。以新疆地区宫颈癌患者组织中的HPV16 L1基因开展疫苗研究,对预防HPV 16新疆流行株的感染将更为有效。本研究将本室克隆的新疆株HPV16 L1基因亚克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带L1基因的重组腺病毒质粒pAd-L1,以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞,获得重组腺病毒;PCR法对重组腺病毒基因鉴定表明L1基因已经整合到腺病毒基因组中,空斑法测定重组腺病毒RAd-L1的滴度为1.5×109 pfu /L,RT-PCR检测表明该重组腺病毒感染后的宿主细胞具有HPV16L1对应的mRNA表达;Western blot和间接免疫荧光检测表明L1基因在HEK293细胞能够有效的表达。制备了表达新疆人乳头瘤病毒16型L1基因的非复制型重组腺病毒,为后续进行重组腺病毒在动物体内诱导抗L1免疫应答能力的研究奠定了基础。2.小鼠、草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达哺乳动物卵透明带(zonapellucida,ZP)是由卵泡细胞和卵细胞合成和分泌的,由ZP1、ZP2、ZP3叁种硫酸化的糖蛋白组成,是受精过程中精子必须穿过的障碍。其中ZP3在受精过程中有两个重要作用:一是与精子专一性地结合;二是与精子结合后诱导精子的顶体反应。大量实验证明,阻断精子与ZP3的结合就可以阻断小鼠、猪等哺乳动物的生殖过程,因此,ZP3是利用免疫不育技术控制有害动物种群数量的理想靶抗原。重组腺病毒载体可模仿病毒天然的感染方式,有效地将外源DNA导入宿主细胞内并表达天然的、保持完整生物活性的抗原蛋白,能够诱导有效的特异性体液免疫应答和强烈的细胞免疫应答。本研究所用病毒载体为缺失E1和E3基因的人血清型5型复制缺陷性腺病毒,插入外源基因可达7.5kb;宿主范围广,可转染分化及未分化细胞;可获得高滴度的病毒,而且腺病毒并不整合到宿主基因组上,相对安全,基因转染后不会激活或者抑制宿主细胞基因的表达,因此作为免疫不育疫苗载体具有明显的优势。本研究将本室克隆的草原兔尾鼠和小鼠的zp3基因亚克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带zp3基因的重组腺病毒质粒pAd-mzp3和pAd-lzp3,以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒;PCR法对重组腺病毒基因鉴定表明mzp3和lzp3基因已经整合到腺病毒基因组中;间接免疫荧光检测表明zp3基因在HEK293细胞中能够有效表达;病毒的滴度可达1.2×109pfu /L和1.3×109pfu/L;继而用鉴定正确的重组腺病毒感染HeLa细胞,RT-PCR检测表明构建的重组腺病毒感染后的宿主细胞具有mzp3和lzp3对应的mRNA表达,Western blot检测表明感染的HeLa细胞中zp3基因能够有效表达。本研究探索制备免疫不育疫苗的新途径,获得草原兔尾鼠卵透明带3(lzp3)和小鼠卵透明带3(mzp3)重组腺病毒载体疫苗,为进一步进行重组腺病毒活疫苗免疫不育技术控制鼠害的研究奠定基础。
张婉琪[5]2018年在《新疆南疆牛乳头瘤病毒1型SY-12株全基因序列分析及蛋白表达研究》文中提出牛乳头瘤病是由牛乳头瘤病毒(Bovine papillomavirus,BPV)引起的一种肿瘤性疾病。患牛主要表现为患病处有突出体表外的赘生瘤体,且极易通过畜群间的接触引发交叉感染。已知的牛乳头瘤病毒Ⅰ型和Ⅱ型可以通过畜群混饲造成跨种间传播,主要表现为马属动物感染牛乳头状瘤病毒。因乳头瘤病毒的宿主特异性、组织局限性,以及细胞培养增殖病毒困难,目前倾向于分子水平的研究。本研究基于新疆南疆一例疑似感染牛乳头状瘤病例的样本基因分型鉴定,对牛乳头状瘤病毒1型SY-12株全长基因组序列测序及结构特征分析,并构建SY-12株L1基因的原核表达系统和E6真核表达系统,为进一步研究牛乳头瘤的基因分型、疫源追溯、病毒分子遗传演化规律、疫苗研究等提供理论依据。1.在临床诊断、病理组织学检查基础上,采用乳头瘤病毒通用引物MY11/MY09成功扩增出L1基因部分片段并测序,核苷酸同源性比较分析确定该患病动物为BPV-1型牛乳头瘤病毒感染。2.设计特异性扩增引物、测序引物,完成牛乳头瘤病毒1型SY-12全基因组序列测定。确定SY-12基因序列全长7946 bp,具有BPV的功能基因结构,包括早期编码区基因E6、E7、E1、E2、E4、E5和晚期编码区基因L1和L2,为Delta属牛乳头瘤病毒。3.以L1基因的特异性引物扩增出1488 bp目的片段,并构建BPV-1 L1基因的原核表达系统pET32a-L1,经诱导条件优化后获得分子量大小为75 KD的目的融合蛋白,与预期蛋白大小相符。4.以E6基因特异性引物,成功克隆BPV-1 E6基因,目的基因大小为414 bp,构建E6真核表达系统pEGFP-N1-E6并转染至BHK-21细胞内,倒置荧光显微镜下可见明显绿色荧光。
参考文献：
[1]. 人乳头瘤病毒16型（新疆株）E6基因疫苗免疫小鼠的研究[D]. 李萍. 新疆大学. 2004
[2]. 人乳头瘤病毒16型（新疆株）E7 DNA疫苗的研究[D]. 张茂祥. 新疆大学. 2003
[3]. 新疆维吾尔妇女宫颈癌组织HPV16基因分子检测的研究[D]. 马彩玲. 新疆医科大学. 2004
[4]. 人乳头瘤病毒16型L1基因、小鼠及草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达[D]. 陈邦党. 新疆大学. 2007
[5]. 新疆南疆牛乳头瘤病毒1型SY-12株全基因序列分析及蛋白表达研究[D]. 张婉琪. 塔里木大学. 2018
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