付朝阳[1]2004年在《J亚群禽白血病病毒分离株变异分析及重组抗原ELISA检测方法的建立》文中认为J亚群禽白血病(Subgroup J Avian Leukosis)是由反转录病毒科J亚群禽白血病病毒(AvianLeukosis Virus of Subgroup J，ALV-J)引起的一种传染性致骨髓细胞瘤疾病或成髓性白血病。该病自20世纪80年代末发现以来，以垂直和水平传播两种形式在世界各国肉种鸡及商品肉用型鸡中广泛流行，引起肉种鸡死亡和消瘦，严重生长发育不良，发生机体免疫抑制，给世界各国养鸡业带来了极大的危害。近年来，世界各国均采取措施，通过淘汰患病鸡群，减少垂直传播从而达到净化种群的目的，而我国这方面的工作相对滞后。因此，在国内进行该病的流行病学研究、分离鉴定病毒株并进行其分子生物学特性研究、建立国内适用的血清学诊断方法对国内防制该病流行、开展种群净化具有重大意义。 本研究首先采用ALV-J特异性引物，用RT-PCR检测患鸡病料、PCR检测细胞培养获取的前病毒基因组、基因序列测定、细胞培养物接种动物等方法从黑龙江省哈尔滨市以及吉林省某种鸡场送检的患病鸡体内，分离鉴定了两株ALV-J病毒，分别命名为Hrb-1和JL-2株。采用依据参照毒株HPRS-103cDNA序列设计并合成的一对引物，自Hrb-1和JL-2前病毒DNA中PCR扩增得到了Hrb-1和JL-2株囊膜基因，分别构建了重组质粒pMD18-T-Hrb-1／env和pMD18-T-JL2／env。在序列测定的基础上，对gp85和gp37基因片段的核苷酸序列及其推导氨基酸序列与国际上不同的参照毒株以及国内部分分离株进行了比较分析，结果表明Hrb-1与JL-2病毒株间gp85、gp37基因的同源率分别为91.5％和92.7％，推导的gp85氨基酸序列的同源率为85.3％，遗传变异分析结果表明JL-2和Hrb-1分别与美国病毒株ADOL-HC-1和UD3有着较大的亲缘关系。 本研究根据原核表达载体pGEX-6p-1的酶切图谱，设计了另一对特异性引物，克隆了JL-2前病毒基因组中的gp85基因片段。构建了原核表达载体PGEX-6P-1／gp85，经转化大肠杆菌BL21(DE_3)后获得高效表达。薄层扫描分析结果表明，表达产物占菌体总蛋白的31.8％。Western blott结果表明，该表达产物具有生物学反应活性，分子量约为57KD。随后，本研究以纯化后的蛋白作为抗原建立了ELISA抗体诊断方法，通过对ELISA诊断方法特异性、敏感性及对工作条件的优化试验，确定了反应的最佳程序。统计学分析51份阴性血清的检测结果，得出判定标准。相关试验结果表明，该诊断方法与鸡传染性法氏囊病等十余种禽类病毒性传染病的阳性血清无交义反应，特异性好。SPF鸡在攻毒后10天即可监测到ALV-J抗体，具有较好的敏感性。与国外试剂盒对比试验结果表明，两者具有较高的符合率。此外，同一批次抗原的批内与批间重复性试验及不同批次抗原的重复性试验结果表明，该方法具有良好的重复性。现地应用试验结果表明，某现地养鸡场3个鸡群78只、306只和92只受检鸡的检测阳性率分圳为7.6％、9.8％、59.7％；与国外ALV-J gp85 ELISA诊断试剂盒的符合率分别为89％、95.5％、86.4％。中国农业科学院博l..论文摘要 总之，本研究首次白东北地区分离鉴定了两株ALv一J病毒，通过遗传变异分析，获取了国内东北地区ALV一J的分子流行病学资料。成功地表达了JL一2株gp85基因，并以其为抗原，建立了J亚群禽白血病抗体EL工SA检测方法，为国内各养鸡场有效开展J亚群禽白血病血清学调杳、种群净化提供了有效的技术手段，同时为开展国际间ALV一J的合作研究奠定了基础。
李晓菲[2]2015年在《禽白血病病毒衣壳蛋白与囊膜蛋白单克隆抗体制备及诊断试剂盒研制》文中研究表明禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的鸡的肿瘤性疾病。它可以使鸡直接发病,产生肿瘤而死亡;也可以导致感染鸡产生免疫抑制,继发多种病原的混合感染,使病鸡对疫苗的免疫应答能力下降,严重影响鸡的生产性能。2008年以来,禽白血病尤其是J亚群禽白血病在我国大部分省份不同程度的爆发给我国养禽业造成了很大的经济损失。禽白血病目前没有有效的防治措施。预防本病的主要方法是淘汰阳性鸡,净化种群。因此利用群特异性或亚群特异性单克隆抗体(Monoclonal Antibody,MAb)建立ALV抗原诊断方法对于临床上ALV的诊断净化、防控、流行病学监测等具有重要意义。p27蛋白作为ALV的群特异性抗原,因其序列高度保守并且含有许多易于被检测的抗原位点而成为制备检测抗体的首选抗原。本研究首先对p27蛋白进行原核表达与纯化,利用杂交瘤技术制备了针对p27蛋白的4株MAb,分别命名为3A9、2E5、3D5、3H12。然后利用肽扫描(Pepscan)技术对p27蛋白的表位信息进行分析,得到一个线性p27蛋白表位181PPSAR185,该表位在ALV各个亚群之间高度保守,是群特异性表位。以制备的MAb 2E5作为捕获抗体,MAb 3D5作为检测抗体建立了禽白血病病毒群特异性抗原ELISA检测方法。通过对各项反应条件的优化,确立了该方法的最佳程序。该方法特异性好,可与家禽常见的A、B和J亚群ALV反应,但不与其他禽病病原如NDV、IBDV、MDV、AIV等反应。该方法对重组p27蛋白的最低检测量为1.25ng/m L,敏感性略高于美国IDEXX Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit(ALV Ag)试剂盒。重复性实验表明,同一样品的批内和批间变异系数均小于10%。保存期实验表明,该试剂盒在4℃保存一年后对阴阳性样品的检测结果仍然具有良好的稳定性。临床样品检测结果显示,本实验研制的试剂盒与美国IDEXX试剂盒对2555份泄殖腔拭子检测结果的总符合率为96.32%;对1141份蛋清样品检测结果的总符合率为97.20%。人工感染实验表明,PCR检测方法最早检出阳性结果为攻毒后11日,本实验研制的ELISA检测试剂盒最早检出阳性结果为攻毒后12日。gp85蛋白在ALV各亚群之间具有高度的变异性,同源性很低,约为30%,具有亚群特异性。本研究首先对gp85蛋白进行原核表达与纯化,制备了针对这个蛋白的MAb,命名为4A3。MAb 4A3不能与ALV-A和ALV-B反应,但是能够与不同国家、时间、地域分离的ALV-J毒株发生特异性反应。然后利用肽扫描(Pepscan)技术鉴定出gp85蛋白的一个线性表位134AEAELRDFI142,该表位在不同的ALV-J毒株之间高度保守,是亚群特异性表位。针对gp85蛋白的MAb和表位的研究为接下来建立以MAb为基础的J亚群ALV抗原诊断方法奠定了良好的基础。本研究共得到4株抗p27蛋白和1株抗ALV-J gp85蛋白的MAbs,鉴定出1个p27蛋白抗原表位和1个gp85蛋白抗原表位,为进一步研究蛋白结构和功能提供了有利的工具。利用MAb 2E5和3D5建立了禽白血病病毒群特异性抗原ELISA检测方法,该方法特异性好、敏感性高、与其它检测方法符合率高,可用于临床中禽白血病病毒的诊断、检测和种群净化。
王英[3]2004年在《鸡传染性贫血病毒重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制》文中研究说明鸡传染性贫血(chicken infectious anemia,CIA)是由鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)引起雏鸡的以坏疽、淋巴组织损伤和骨髓发育不全为特征的传染病，是继IBD后的一种重要的免疫抑制性疾病。目前，本病已成为世界性疾病，严重地威胁着养禽业。但在现地，由于并发继发的病毒性、细菌性传染病或球虫病升高了CIA的死亡率，而且以后者症状更为突出，导致临床对本病的忽视，并且因为传统CIA血清学方法中的血清中和试验(SN)和间接免疫荧光试验(IFA)存在着费时、费力、对操作者技术要求高和仅适于实验室诊断的问题，因此，急需一种快速、简便、敏感、廉价和能检测大批量样品的诊断方法用于免疫鸡群的抗体监测和流行病学调查。 CIAV的VP1蛋白不仅是病毒的唯一衣壳蛋白，也是主要的免疫原蛋白。本试验用生物软件分析vp1基因及其编码产物，预测了该蛋白的抗原表位，并对预测的其富含抗原表位的C末端基因进行了原核表达。根据GenBank公布的标准毒株Cux-1基因序列，设计合成了一对引物，对CIAV-M9905株的vp1基因进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条1350bp的特异带，用Pstl酶切后，将其回收，克隆到pProEXHTa载体，再亚克隆到pGEX-6p-1载体中，得到重组质粒pGEX-vp1，PCR鉴定为阳性者再用BamHI消化阳性质粒，琼脂糖凝胶试剂盒回收大片段，自连后转化感受态细胞，用BamHI鉴定为阳性者命名为pGEX-vp1(C)，得到目的克隆。 将重组刚性质粒pGEX-vp1(C)转入表达宿主菌BL_(21)中，经终浓度为0.6mmol／L IPTG诱导，成功表达了VP1 C端基因，重组蛋白表达量占菌体蛋白的39.4％。经ELISA检测表明，表达的重组蛋白能被CIAV阳性血清识别，具有良好的抗原性。 把表达的重组蛋白经初步纯化后用作包被抗原，建立了检测CIAV血清抗体的间接ELISA方法，并确定了最适封闭液、最适抗原包被浓度、最适血清稀释度、血清最适作用时间、酶标抗体最适稀释度和最适作用时间及底物最适显色时间。包被的重组抗原不与鸡新缄疫(ND)、马立克氏病(MD)、传染性支气管炎(IB)-Ⅰ型和Ⅱ型、禽流感(AI)-H9和H7型、鸡法氏囊病(IBD)、鸡网状内皮组织增生病(RE)、禽白血病(AL)-J亚群、鸡白痢阳性血清发生交叉反应，表明建立的ELISA诊断方法只有良好的特异性。用该方法可检出人工攻毒后110天81％的CIAV血清抗体，表明其具有很高的敏感性。批内重复试验，变异系数小于10％；批间重复试验，变异系数小于15％，说明具有很好的重复性。与全病毒抗原检测结果符合率为92％以上，与进口试剂盒的符合率达97％。 本研究在国内首次成功表达了CIAV VP1蛋白抗原表位优势区，并成功建立了ELISA诊断方法。CIAV重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制，为免疫鸡群抗体监测和进行CIA流行病学调查提供了一种快速简便的血清学方法。
邝爱丽[4]2009年在《抗猪传染性胃肠炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备及初步应用》文中研究指明本研究将重组猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S蛋白在E.coli中高效表达后,SDS-PAGE分析超声裂解细菌后的目的蛋白均在离心所得沉淀中。利用分步洗涤的方法提纯包涵体,采用切胶、电洗脱的方法纯化目的蛋白,再透析复性和浓缩洗脱液达到纯化回收蛋白的目的,此法获得的蛋白为免疫抗原。将提纯的包涵体用不同浓度的尿素和盐酸胍进行包涵体溶解条件的摸索,最后确定用8M尿素溶解包涵体蛋白。本试验采用分步透析复性法复性目的蛋白,并用镍离子金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白,此法获得的蛋白为检测抗原。纯化蛋白经Western blotting检测能保持其原有的反应特异性。通过在PK-15细胞上增殖猪传染性胃肠炎病毒,浓缩纯化制备了全病毒检测抗原。以重组TGEV S蛋白为检测抗原时,最终确定ELISA的最佳工作条件为:包被抗原量为4μg/mL,包被液为CBS(pH9.6、0.05M),包被条件为4℃过夜,封闭物为1%明胶,封闭时间为1.5h,一抗稀释度为1:1600,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,底物作用时间为15min。以TGEV全病毒为检测抗原时,最终确定ELISA的最佳工作条件为:包被抗原量为1:400,包被液为CBS(pH9.6、0.05M),包被条件为37℃作用1h,4℃过夜,封闭物为1%明胶,封闭时间为1h,一抗稀释度为1:200,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,底物作用时间为15min。将纯化的重组TGEV S蛋白免疫Balb/c小鼠,按常规方法进行融合,用间接ELISA方法进行筛选,采用有限稀释法,经过3次克隆,最终获得3株抗重组TGEV S蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1G6,2F8和3E5。3株杂交瘤细胞在体外长期培养和长期冻存复苏,抗体分泌能力有轻微下降,但仍能稳定地分泌抗体。间接ELISA检测3株细胞培养效价分别为1:3200、1:6400、1:6400,小鼠腹水效价分别为1:5×105、1:5×106、1:5×106。交叉试验结果显示,所制备的3株单抗与猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。Western blotting结果证实,3株单克隆抗体与重组TGEV S蛋白均能发生特异性结合。利用腹水单抗建立了检测TGEV S蛋白的单抗介导双夹心间接ELISA方法,将此法进行4次重复性试验,结果差异不显着,说明该双夹心间接ELISA方法具有良好的稳定性。所有的实验结果表明,所制备的抗重组TGEV S蛋白的单抗对病原检测具有很强的特异性,为TGE疫情监测和准确快速的病原诊断与鉴别诊断奠定了基础。
参考文献：
[1]. J亚群禽白血病病毒分离株变异分析及重组抗原ELISA检测方法的建立[D]. 付朝阳. 中国农业科学院. 2004
[2]. 禽白血病病毒衣壳蛋白与囊膜蛋白单克隆抗体制备及诊断试剂盒研制[D]. 李晓菲. 中国农业科学院. 2015
[3]. 鸡传染性贫血病毒重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制[D]. 王英. 中国农业科学院. 2004
[4]. 抗猪传染性胃肠炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备及初步应用[D]. 邝爱丽. 河南农业大学. 2009
标签：畜牧与动物医学论文; 特异性论文; elisa论文; 抗原表位论文; 抗原抗体反应论文; 血清蛋白论文; 重组蛋白论文; 抗原抗体论文; 基因合成论文; 传染病论文; 白血病论文;