论文摘要
肝素和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）是由葡萄糖醛酸（GlcA）或艾杜糖醛酸（IdoA）残基与氨基葡萄糖（GlcN）残基以1→4糖苷键连接而成的二糖重复单元组成的糖胺聚糖,因糖链长短不一、各糖单元存在可变的硫酸化、异构化等修饰,使其成为分子量、精细结构不均一的多组分混合物,并表现出多种多样的生物活性。作为有机合成中最具挑战性的研究领域之一,国内外多个研究小组已成功发展了许多肝素/HS寡糖合成的新方法和策略,实现了特定结构肝素寡糖的定向合成,但现有单纯化学合成策略存在反应步数多、合成效率极低等不足。课题组前期通过模拟肝素的体内生物合成途径,成功发展了一种以多酶催化反应为主的、温和的化学方法为辅的化学酶法合成方法,这种全新的技术具有步骤少、产率高等优点,被认为是最具有发展前途的肝素寡糖合成策略。因此,本课题以之前建立的化学酶法合成技术为基础,有针对性地引入温和的化学修饰方法对合成特定寡糖进行N-脱硫酸化修饰以突破修饰酶对底物识别的限制,从而构建结构更加丰富的肝素寡糖化合物库。此外,肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）产生的肝素酶Ⅰ（heparinase Ⅰ）是表征肝素/HS结构、制备低分子量肝素及寡糖的工具酶之一,但之前以结构不均一的肝素及其衍生物为底物确定的底物特异性不够准确,故本论文通过全面测定肝素酶Ⅰ对合成的、结构确定的肝素寡糖的降解作用,首次发现该酶对多种不同的糖苷键均具反应活性,并阐明了酶的催化活性与底物修饰模式的关系;最后利用生物膜层干涉技术（bio-layer interferometry,BLI）分析不同寡糖底物与肝素酶1的亲和力大小。本研究清晰阐明了肝素酶Ⅰ的多样化催化切割模式,为拓展肝素酶的应用奠定了基础。本学位论文取得的成果及结论包括以下几个方面:1.糖基供体与硫酸基供体的制备肝素寡糖合成需要稀有的糖基供体UDP-GlcNTFA、UDP-GlcA及硫酸基供体PAPS,均采用本实验室建立的酶法或化学酶法合成、离子交换柱层析纯化制备,所得产物的纯度均>95%,制备规模达克级以上。所用酶包括NahK、GlmU、PPA、KAST/APSK均为大肠杆菌（E.coli）表达、亲和柱层析制得。2.肝素寡糖的合成、纯化及结构表征以对硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷（GlcA-PNP）为起始原料,在糖基转移酶KfiA或PmHS2的催化作用下,于其非还原端交替添加GlcNTFA或GlcA得到肝素寡糖骨架,每步反应产率高达96%;经反相C18柱层析纯化,得到纯度高于90%的寡糖骨架。含GlcNTFA的寡糖利用LiOH脱除三氟乙酰基后,以PAPS为硫酸基供体,由N-硫酸基转移酶（NST）催化合成N-硫酸化肝素寡糖。然后在C5异构化酶的催化作用下,使寡糖链中介于两个N-硫酸化葡萄糖胺（GlcNS）的GlcA残基转变为IdOA,或者在C5异构化酶和2-O-硫酸基转移酶（2-OST）的共同催化下,使GlcA残基转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸（IdoA2S）,所得到两种寡糖的产率分别为40%和80%,纯度均高达92%以上。最后在6-O-硫酸基转移酶1/3（6-OST1/3）的催化作用下,寡糖的GlcNS发生6-O-硫酸化修饰（GlcNS6S）,得到的三种寡糖产物的产率均高于98%,纯度均高达95%以上。此外,为突破修饰酶对底物识别的限制,以温和的化学法对合成的寡糖进行N-脱硫酸化,得到四种含N-非取代GlcN（GlcNH2）的肝素寡糖,产率分别为98%、70%、73%、65%,经离子交换柱层析纯化后的寡糖纯度均高达95%以上。ESI-MS及NMR分析表明不同修饰模式的肝素寡糖产物的结构正确。3.肝素酶Ⅰ的催化切割模式的研究以合成的一系列结构确定的肝素/HS寡糖为底物,利用HPLC、ESI-MS测定肝素酶Ⅰ在不同条件下对底物的切割作用,以探究酶对不同底物的催化特性。研究结果如下:（U）肝素酶Ⅰ不能切割N-非取代GlcN（GlcNH2）与糖醛酸之间的糖苷键（GlcNH2-IdoA2S 或 GlcNH2-IdoA2S 或 GlcNH26S-IdoA 或GlcNH26S-IdoA2S）,结合文献报道-GlcNAc6S-IdoA2S能被酶切割,因此N-取代GlcN（GlcNS或GlcNAc）是肝素酶Ⅰ切割必需的。除含-GlcNS6S-IdoA2S-的肝素寡糖,我们发现肝素酶Ⅰ还能够切割含-GlcNS6S-GlcA2S-、-GGcNS-IdOA2S-、-GlcNS-GlcA2S、-GlcNS6S-IdoA-、GlcNS6S-GlcA-糖苷键的不同寡糖,这一结果表明2-6?-硫酸化糖醛酸和6-O-硫酸化葡糖胺（GlcNS6S）不是肝素酶Ⅰ切割必需的。（2）肝素酶Ⅰ对六种肝素寡糖底物的切割效率存在较大差异,其对高硫酸化寡糖底物的切割效率显著高于低硫酸化底物,对含IdoA残基的寡糖底物的切割效率高于含GlcA残基的底物。HPLC制备酶切割产生的含不饱和糖醛酸（AUA）的产物,经ESI-MS鉴定确定六种肝素寡糖的切割位点。（3）BLI结果表明不同寡糖与肝素酶Ⅰ的亲和力大小存在差异。五糖Penta-NS与肝素酶Ⅰ的亲和力最低,与其不是肝素酶Ⅰ的底物一致;五糖Penta-NS6S-IdoA2S、六糖Hexa-NS6S-GlcA2S与肝素酶Ⅰ的亲和力分别高于Penta-NS-IdoA2S、Hexa-NS-GlcA2S,表明高硫酸化底物被肝素酶Ⅰ裂解的效率高与其亲和力高有关;Penta-NS6S-IdoA比Penta-NS6S的亲和力高,证实含有IdoA的肝素寡糖与肝素酶Ⅰ亲和力更高,使其成为更好的底物;然而,反应活性较低的Hexa-NS6S-GlcA2A与酶的亲和力比Penta-NS6S-IdoA2S强,说明糖链更长的底物有助于与酶结合力,但无法提高可切割序列进入活性中心的能力。因此,肝素酶Ⅰ对不同肝素寡糖水解效率不是单纯由二者之间的亲和力差异决定的,而是由寡糖链长短、糖醛酸类型及分子电荷形成的整体构象的差异决定。总之,肝素酶Ⅰ对合成的不同肝素寡糖的催化切割模式对于更加准确地测定肝素/HS的结构、建立更可靠的LMWH生产工艺具有重要的借鉴意义。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 张成盈
导师: 刘纯慧
关键词: 化学酶法合成,肝素寡糖,肝素酶,切割模式,底物特异性
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 山东大学
基金: 山东省自然科学基金(ZR2019MH030)
分类号: Q55
总页数: 128
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