许红韬[1]2004年在《拟蜘蛛牵丝蛋白基因在大肠杆菌和小鼠乳腺表达研究》文中指出蜘蛛牵丝是目前已知的最为坚韧的天然纤维之一。它具有优异的机械特性，其超强的强度和出色的弹性是其它天然和人工材料所无法比拟的。它的强度非常高，同等重量的蜘蛛牵丝强度是钢的五倍。蜘蛛牵丝优异的机械特性使它在军工、医疗、建材和纺织等行业具有广阔的应用前景。本研究侧重于获得便于操作且高效表达的蜘蛛牵丝蛋白基因结构，继而开展大规模生产拟蜘蛛牵丝蛋白。 依据已报道的蜘蛛牵丝蛋白部分cDNA序列，设计合成了两种不同结构的拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体，大小分别为360bp和390bp。多聚化分别得到2聚体、4聚体、6聚体、8聚体和16聚体。依据已报道的蜘蛛牵丝蛋白序列设计合成一段大小为19个氨基酸的短肽。将此短肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联，免疫新西兰大耳白兔，获得抗蜘蛛牵丝蛋白血清。 将得到的两种结构8聚体和16聚体与表达载体pET-30a连接，获得四种表达载体pET30a-X8、pET30a-X16、pET30a-F8和pET30a-F16。转化大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达。用制备的抗蜘蛛牵丝蛋白血清做Western blot检测到有蜘蛛牵丝蛋白的表达。表达产物呈梯度排列，主带分别在85KD、165KD、85KD和165KD，与预计大小基本一致。表达量分别为800mg／L、500mg/L、200mg／L和200mg/L左右。 根据山羊β-酪蛋白信号肽我们设计了一段长125bp的DNA序列。将此DNA序列分别与两种拟蜘蛛牵丝蛋白基因结构4聚体和6聚体连接后，插入乳腺特异表达载体pBC1，最后得到四种乳腺表达载体pBC1-F4，pBC1-X4，pBC1-F6和pBC1-X6。 将pBC1-F4和pBC1-X6两种表达载体用显微注射法生产转基因小鼠。对于pBC1-X6，共获得58只小鼠，用PCR和Southern杂交的方法检测出10只为转基因阳性小鼠，包括5只母鼠和5只公鼠，转基因阳性率约为17％。经PCR检测，大部分原代鼠的F1代都可以检测到拟蜘蛛牵丝蛋白基因阳性小鼠。经Western blot检测，在5只阳性原代母鼠和8只F1母鼠的乳汁中，有2只原代母鼠和7只F1母鼠可以检测到拟蜘蛛牵丝蛋白的表达。除了有预计大小蛋白表达外，还有部分小鼠表达与预计大小不一致的产物。用放免方法检测表达量在11-50mg／L。 对于pBC1-F4，共出生59只小鼠，用PCR和Southern杂交的方法检测7只为转基因小鼠，包括3只母鼠和4只公鼠，基因整合率为12％。所有原代鼠的F1代都可以检测到拟蜘蛛牵丝蛋白基因阳性小鼠。经Western blot检测，在3阳性原代母鼠和6只F1母鼠的乳汁中，有2只原代母鼠和2只F1母鼠可以检测到拟蜘蛛牵丝蛋白的表达。表达产物与预计大小一致。用放免方法检测表达量在11-22mg／L。 在大肠杆菌表达和小鼠乳腺表达的结果表明，人工设计合成的两种蜘蛛牵丝蛋白基因结构完整正确。通过本研究将为进一步开展大规模生产拟蜘蛛牵丝蛋白奠定了基础。
房君[2]2014年在《拟蜘蛛牵丝蛋白基因的原核表达及多克隆抗体制备》文中认为蜘蛛牵丝因其优异的机械性能越来越多地作为材料应用于医疗、建筑等领域。但天然蛛丝产量低,利用原核生物反应器生产重组蛛丝是目前人工获得大量蛛丝的有效手段。本研究用拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体(S)和二聚体(2S)分别构建了原核表达载体pGEX-S和pGEX-2S,转化大肠杆菌并诱导其表达,用产量多的重组蛋白为抗原,免疫小白鼠以制备抗血清。通过此方法可以探索建立适宜的重组蛛丝原核表达体系,也为检测其在真核表达提供材料。主要研究结果如下：1.拟蜘蛛牵丝蛋白基因序列的合成：根据棒络新妇蛛的cDNA片段人工合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体(S),并构建了二聚体(2S)。2.原核表达载体的构建：基因单体(S)合成后与克隆载体pUC57相连,得到重组质粒pUC57-S再通过酶切、连接、转化等合成二聚体(2S)；分别将S和2S片段与表达载体pGEX-2T相连,获得可用于原核表达的重组质粒pGEX-S和pGEX-2S。3.重组蛋白的表达和纯化：将重组质粒pGEX-S和pGEX-2S转化入表达型感受态细胞BL21中,并对菌株的表达条件进行了摸索,发现0.8mmol/l的IPTG诱导4小时为最好。提取总蛋白进行Western Blot,发现S-GST的表达量明显高于2S-GST。利用亲和层析法纯化重组蛋白S-GST,用于多克隆抗体的制备。4.拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体(S)多克隆抗体的制备：取适量纯化后S-GST重组蛋白与佐剂混合乳化,利用皮下多点注射的方法免疫8只CD I小白鼠,免疫结束后经ELISA检测,发现其中的两只小鼠的抗血清浓度较高,可用于后续实验。
王海涛[3]2014年在《拟蜘蛛牵丝蛋白基因细毛羊毛囊特异表达载体的构建及其转基因细胞系的建立》文中提出蜘蛛丝是自然界具有最优异力学性能的生物纤维,主要成分为蛛丝蛋白,但是难以大量生产或收集。利用基因工程手段可实现蛛丝蛋白基因转入异源宿主中并表达。本实验通过脂质体转染法将蜘蛛牵丝蛋白基因真核表达载体pK-2S转入美利奴细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞中,筛选稳定转入蛛丝蛋白基因的细胞株,通过DNA,RNA水平的检测初步鉴定基因是否转入细胞并表达,为培育能生产含有蛛丝蛋白羊毛的绵羊新品种奠定基础。主要结果如下：1.以已发表的棒络新妇蛛cDNA片段为模板,人工合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体(S),并获得二聚体(2S)。2.建立了新疆美利奴细毛羊胎儿成纤维细胞系,细胞形态观察显示细胞形态良好,生长曲线表明细胞增殖状态较好,核型分析正常。3.克隆了绵羊毛囊特异性表达启动子Kap6.1,构建表达载体pKap-EGFP并转入细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞中并表达绿色荧光蛋白,表明启动子具有表达活性。4.以pEGFP-N1为框架,将2S与绵羊毛囊特异性启动子Kap6.1相连,构建毛囊特异表达载体pK-2S。5.质粒pK-2S线性化后,转染新疆美利奴细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞,并通过600μg/mL G418筛选单克隆。提取单克隆基因组进行PCR验证,表明了部分克隆转入蛛丝蛋白基因,对部分阳性克隆提取细胞总RNA进行RT-PCR,并以cDNA为模板进行PCR验证,表明蛛丝蛋白在RNA水平表达。
薛娜[4]2014年在《八聚体蛛丝蛋白基因毛囊特异性表达载体的构建及其转基因研究》文中认为蜘蛛丝具有质量轻、强度高及韧性大等优越特性,由于其开发利用难度大,因此借助生物工程技术生产蛛丝原材料成为首选方法。八聚体蛛丝蛋白基因是由人工合成的拟蜘蛛拖丝蛋白基因的核心序列S连接成的八聚体(Spidroinl8,8S),为了进一步探究8S基因的功能及特性,本实验构建了毛囊细胞中特异性表达8S基因的载体,并转染了小鼠表皮细胞和绒山羊胎儿成纤维细胞,验证了启动子的表达能力；通过转染小鼠胚胎干细胞获得阳性克隆,为嵌合体小鼠的制备奠定基础,并运用原核注射方法,制备了8s转基因小鼠,为研究8S对毛发特性的影响提供了研究基础。1.8S基因毛囊特异性表达载体pCDsR-K8SP的构建通过PCR扩增出PolyA片段,连接到载体pMD19T-8S上构成中间克隆载体pMD19T-8S-PolyA。分别用Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ(?)其与带有毛囊特异性启动子的载体pCDsR-KAP6-1-IGFⅠ双酶切后,重组成8S基因的毛囊特异性表达载体pCDsR-K8SP,经酶切鉴定与测序分析,结果与预期设计相符。2.8S基因毛囊特异性表达载体pCDsR-K8SP的细胞转染及鉴定在脂质体的介导下,将毛囊特异性表达载体pCDsR-K8SP分别转染入小鼠表皮细胞和绒山羊胎儿成纤维细胞中,经双重筛选获得阳性克隆。对转基因细胞基因组进行PCR特异性扩增检测,结果表明外源目的基因8S已稳定整合到转基因细胞基因组中。提取筛选得到的转基因小鼠表皮细胞及绒山羊胎儿成纤维细胞的总RNA,进行反转录PCR检测,结果表明外源基因8S在这两种转基因细胞中均呈现表达阳性。3.8S转基因小鼠胚胎干细胞的获得及转基因小鼠的制备通过转染小鼠胚胎干细胞,获得了外源基因8S已稳定整合到转基因细胞基因组中的阳性克隆,为下一步制备嵌合体小鼠奠定基础。同时使用载体pCDsR-K8SP对小鼠受精卵进行原核注射,获得67只待检原代小鼠,经PCR鉴定,共检测出6只8S转基因阳性小鼠,阳性得率为8.96%。本实验中8S转基因小鼠的制备及初步鉴定,为进一步研究人工合成蛛丝蛋白的特性以及利用生物工程方法开发蛛丝新型材料提供了研究基础。
梁洋[5]2011年在《蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroin1嵌合体小鼠的研究》文中认为蜘蛛拖丝由于具有独特的抗拉性和弹性的力学特性而备受关注。随着对蜘蛛丝的化学组成、分子结构及基因序列等了解的加深,诸多学者探讨了采用基因工程技术,通过山羊乳腺、细菌、烟草或马铃薯和家蚕等获得蜘蛛丝蛋白的方法,但均未能获得理想的效果。本研究以小鼠为实验动物模型,利用蜘蛛拖丝蛋白基因2S、pIRES2-EGF载体和PMX载体构建逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-EGFP,并经platE细胞包装获得2S假病毒,探讨了通过假病毒感染小鼠ES细胞,再通过囊胚注射制备整合有目的基因嵌合体小鼠的方法,为最终建立通过转基因动物获取蜘蛛拖丝蛋白的方法奠定基础。本研究的结果如下：1. PMX-2S-IRES-EGFP逆转录病毒载体的构建将蜘蛛拖丝蛋白基因2S与载体pIRES2-EGFP连接,酶切获得2S-IRES-EGFP片段后与逆转录病毒载体PMX相连,构建既表达蜘蛛拖丝蛋白基因2S又能表达绿色荧光蛋白基因GFP的逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-EGFP;双酶切和PCR检测及序列分析结果显示,该载体与所设计的理论序列一致。2.2S假病毒的获得及其滴度检测采用脂质体法将逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-GFP转染platE和293GP细胞后的第48h,表达GFP的platE细胞数量明显高于293GP细胞；另外,当采用磷酸钙法转染platE细胞时,在转染后的第48h约有90%的细胞表达GFP。用上述方法获得的2S假病毒感染NIH-3T3细胞,不仅能够检测到GFP的表达,而且检测到目的基因2S-IRES-EGFP在阳性NIH-3T3细胞基因组中整合。经计算2S假病毒滴度达到2×105cfu·mL-1。3.小鼠ES细胞的传代培养通过不同发育时期的胎鼠皮肤成纤维细胞、丝裂霉素C处理时间及细胞培养密度的筛选,获得了最佳的饲养层细胞,并建立了ES细胞的培养体系；利用该体系对馈赠获得的小鼠ES细胞进行培养后,其细胞形态、细胞增殖特性正常；将传代培养的ES细胞经冷冻复苏后,仍保持ES细胞形态和生长特性,且培养后的第72h,细胞克隆达培养皿面积60%以上。4.小鼠ES细胞的检测将上述培养的ES细胞用碱性磷酸酶试剂盒染色后,呈现碱性磷酸酶阳性；将ES细胞用多能性因子检测试剂盒进行免疫组化染色后,在倒置荧光显微镜下可检测到SSEA1、Oct4、Nanog和Sox2的表达。5.ES细胞2S假病毒的感染用2S假病毒感染小鼠ES细胞并扩大培养,续培养的第24h可观察到大量GFP阳性细胞克隆；经PCR鉴定,阳性细胞基因组中可检测出与与理论序列一致的2S-IRES-EGFP目的基因条带(约750bp处)；核型分析结果显示,约有70%的阳性细胞具有正常的2n=40条染色体。6.阳性ES细胞嵌合体小鼠的制作采用小鼠囊胚注射制作嵌合体方法,将阳性ES细胞注入90个来源于雄性C57BL/6和雌性ICR小鼠的囊胚,共获得77个正常的重构囊胚,将其中的70个重构胚移植于5只假孕雌性小鼠的子宫后,2只怀孕并分娩13只,其中存活11只(雄性7只,雌性4只)。在11只幼鼠中有5只尾部出现嵌合(白色斑块)。7.嵌合体小鼠的检测提取11只嵌合体小鼠的尾基因组DNA后,经PCR检测,有6只小鼠的基因组中检测到2S-IRES-GFP目的条带(约750bp),与阳性对照(PMX-质粒)扩增条带一致；在载体PMX-2S-IRES-GFP的GFP基因片段上设计探针引物并制备探针,利用制备的探针对经PCR检测为2S阳性的6只鼠尾基因组DNA进行southern blot检测,其结果,在2只鼠尾基因组中检测到了整合位点；提取经southern blot检测有目的基因整合的一只小鼠内脏和肌肉组织的基因组DNA,并利用探针引物进行PCR检测,其结果,在肌肉、心脏、肝脏、肺、胃、肠、胰腺和睾丸中检测到了的目的条带(约为250bp)。8.嵌合体小鼠F1代的检测将经鼠尾基因组PCR和southern blot检测为阳性的雄性小鼠与嵌合体雌鼠进行交配后,获得10只幼鼠(雄性6只,雌性4只)。分别提取10只幼鼠的尾基因组DNA,并采用PCR法进行检测,其结果,嵌合体小鼠的F1代中,有9只小鼠的基因组DNA中检测到2S-IRES-GFP目的条带(约750bp)。综上所述,本研究利用蜘蛛拖丝蛋白基因2S、pIRES2-EGF和PMX载体构建了PMX-2S-IRES-EGFP逆转录病毒载体,建立了通过小鼠ES细胞囊胚注射获得转蜘蛛拖丝蛋白基因2S嵌合体小鼠的方法,为进一步通过转基因动物获取蜘蛛拖丝蛋白奠定了坚实基础。
李光鹏, 张立[6]2017年在《中国转基因家畜最新研究进展》文中研究说明转基因家畜研究始于20世纪80年代,在2010年以后出现爆发式发展,尤其是中国科学家在转基因猪、牛和羊研究中取得了若干突破性进展.分别在提高繁殖力、提高抗病能力、促进肌肉生长、改良肉质与奶质、建立人类疾病模型、构建乳腺生物反应器及提高羊毛或羊绒质量等方面,取得了国际先进水平的研究成果.本文就上述成果进行简要综述,旨在为深入开展转基因家畜研究提供借鉴.
参考文献：
[1]. 拟蜘蛛牵丝蛋白基因在大肠杆菌和小鼠乳腺表达研究[D]. 许红韬. 中国农业大学. 2004
[2]. 拟蜘蛛牵丝蛋白基因的原核表达及多克隆抗体制备[D]. 房君. 内蒙古农业大学. 2014
[3]. 拟蜘蛛牵丝蛋白基因细毛羊毛囊特异表达载体的构建及其转基因细胞系的建立[D]. 王海涛. 内蒙古农业大学. 2014
[4]. 八聚体蛛丝蛋白基因毛囊特异性表达载体的构建及其转基因研究[D]. 薛娜. 内蒙古大学. 2014
[5]. 蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroin1嵌合体小鼠的研究[D]. 梁洋. 东北林业大学. 2011
[6]. 中国转基因家畜最新研究进展[J]. 李光鹏, 张立. 内蒙古大学学报(自然科学版). 2017
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