一、CD69与免疫功能的调节（论文文献综述）
耿陈露[1]（2021）在《来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究》文中研究表明T细胞是抗肿瘤免疫反应的重要组成部分,是肿瘤免疫治疗的主要作用对象。充分激活T细胞需要TCR（T cell receptor）识别MHC（Major histocompatibility complex）呈递的抗原多肽产生抗原信号,还需要一系列共刺激信号。T细胞表面的CD28共刺激受体与B7配体相互作用,激活下游共刺激信号,促进T细胞的激活和效应细胞功能,这对充分激活T细胞抗肿瘤免疫反应至关重要。但在人体衰老过程和部分实体瘤中,CD8+T细胞表面的CD28蛋白表达会逐渐缺失,CD28的缺失会导致T细胞免疫反应不足以及PD-1/PD-L1（Programmed death-1/programmed death-ligand 1）免疫检查点抑制剂失效。来那度胺（lenalidomide）是一种免疫调节药物（Immunomodulatory drugs,IMi Ds）,可以在缺少CD28和B7相互作用的情况下共刺激T细胞,但来那度胺能否在实体瘤中通过共刺激CD28-T细胞弥补CD28缺失导致的T细胞免疫反应不足以及PD-1/PD-L1抗体治疗失效并没有得到阐述。我们构建了CrbnI391V基因敲入小鼠模型,在小鼠中模拟来那度胺对人源T细胞的共刺激作用,用于探讨来那度胺的共刺激作用对实体瘤免疫治疗的意义。我们的研究结果表明,在CD28缺失的CrbnI391V小鼠中,来那度胺共刺激CD28-CD8+T细胞,增强T细胞免疫反应,可以抑制肿瘤生长并弥补CD28缺失导致的PD-1抗体治疗失效。在结直肠癌病人的肿瘤样本中,来那度胺可以共刺激CD28-CD8+T细胞,并增强这群T细胞对PD-1抗体的响应。在分子机制层面,已知来那度胺可以在T细胞中靶向CRL4CRBN E3泛素连接酶导致转录因子IKZF1（Ikaros）和IKZF3（Aiolos）泛素化降解,上调白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）。我们进一步揭示来那度胺可以在CD8+T细胞中上调一些Notch靶基因的表达,而来那度胺在Cd28-/-CrbnI391V小鼠中恢复PD-1抗体的肿瘤抑制效果需要IL-2和Notch信号的参与。这些结果提示,来那度胺有望在肿瘤中浸润有大量CD28-CD8+T细胞的实体瘤病人中增强PD-1抗体的疗效,这一发现对实体瘤的免疫治疗具有一定的临床指导意义。我们尝试进一步挖掘来那度胺的共刺激作用在实体瘤中的治疗潜力。为此,我们通过体内CRISPR文库筛选系统性地寻找能够增强结肠癌细胞对来那度胺治疗敏感性的基因突变,并发现Ptpn2、Jak1和Eef2等基因突变使得小鼠结肠癌细胞对来那度胺的治疗更加敏感。这为充分发挥来那度胺在结肠癌中的免疫治疗潜力提供了潜在的生物标志物和联合治疗靶点。最后,我们利用Cd28-/-CrbnI391V小鼠CD8+T细胞筛选了一些来那度胺类似物,并发现了两个全新的化合物可以高效地共刺激CD8+T细胞,将来可用于进一步肿瘤免疫治疗的研究。创新点:1.明确来那度胺可以在体内和体外共刺激CD28-CD8+T细胞,有望弥补CD28缺失导致的T细胞免疫反应不足。2.发现来那度胺有可能弥补CD28缺失导致的PD-1抗体治疗失效。3.发现来那度胺可以在CD8+T细胞中上调一些Notch靶基因的表达,并确定了这是来那度胺共刺激CD8+T细胞的分子机制之一。4.通过CRISPR文库筛选发现Ptpn2、Jak1和Eef2等基因突变使得小鼠结肠癌细胞对来那度胺治疗更加敏感。
路文婷[2]（2021）在《基于B细胞表面TLR9水平及移行与B细胞活化的关系研究CpG ODN发挥疫苗佐剂作用的机制》文中进行了进一步梳理CpG ODN（CpG oligodeoxynucleotide）是一类由人工合成的、含CpG二核苷酸基序的非甲基化脱氧寡核苷酸,是细胞内模式识别受体TLR9（Toll-like receptor 9）的激动剂。CpG ODN与TLR9结合后,激活下游信号级联反应,促进B细胞、浆细胞样树突状细胞（p DC）、T细胞等细胞的活化,因此具有疫苗佐剂的潜力。TLR9组成性地表达在人和小鼠的B细胞及p DC中,也表达在小鼠的树突状细胞（DC）、单核/巨噬细胞中。一般认为,当细胞处于静止状态时,TLR9主要定位在细胞内的内质网膜上,受到刺激后移行至内体,并在内体中与进入细胞内的CpG ODN结合。值得注意的是,最近的研究发现TLR9也可以表达在B细胞、中性粒细胞等细胞的细胞膜上,成为表面TLR9（surface TLR9,sTLR9）。然而,sTLR9是否受CpG ODN的调节、调节模式如何及其与CpG ODN的佐剂效应是否有关等尚不清楚。本文拟以B细胞sTLR9为切入点,用自行设计的CpG ODN作为TLR9激动剂,探究B细胞sTLR9表达、移行与B细胞活化的关系,以此对CpG ODN作为疫苗佐剂增效抗体应答提供一种新的解释。我们首先通过生物信息学方法,在所有自行设计的CpG ODN中预测出CpG5805和CpG 5801的免疫刺激性最强。随后采用VSV保护试验和Ed U掺入细胞增殖实验检测CpG ODN的生物学活性,并依此将自行设计的CpG ODN进行分型,最终确定了一个C型CpG ODN（CpG 5805）和三个B型CpG ODN,没有获得A型CpG ODN。为了探究CpG ODN是否可以调节B细胞sTLR9的表达水平,我们将所有CpG ODN分别与小鼠脾细胞共培养,使用流式细胞术分别通过表面染色及胞内染色检测其中B细胞sTLR9及总TLR9（total TLR9,t TLR9）的表达水平。结果显示,B型和C型CpG ODN对B细胞sTLR9表达水平有下调作用,而CpG ODN对B细胞t TLR9水平与sTLR9水平的调节作用是相反的。以往用作疫苗佐剂的CpG ODN通常是B型CpG ODN,考虑到C型CpG ODN不仅具有B型CpG ODN的特性,还具有诱导IFN-I的特性,后者也具有辅助体液免疫的作用。为此,我们选择CpG 5805作为研究对象,观察其对抗体应答相关免疫细胞如B细胞、树突状细胞（DC）、T细胞的增殖和活化作用。结果显示,CpG 5805可以显着促进B细胞的增殖和活化,对DC、CD4+T和CD8+T细胞的增殖没有影响,但是能够显着促进这些细胞的活化。由此可见,CpG 5805具有更强的免疫刺激活性,展现出极大的作为疫苗佐剂的潜力。为了检测CpG 5805的疫苗佐剂效应,我们分别将其与重组蛋白ΔCP疫苗、灭活流感病毒H9N2乳化疫苗、重组乙肝疫苗联合免疫小鼠,并在免疫后不同时间用ELISA检测小鼠血清中特异性抗体水平。结果显示:CpG 5805能够显着提高重组蛋白ΔCP疫苗及商品化乙肝疫苗免疫小鼠血清中的抗体水平,但对灭活流感病毒H9N2疫苗免疫小鼠的抗体应答没有明显增效作用。随后我们将CpG5805与免疫效果最好的商品化乙肝疫苗相联合,体外刺激小鼠脾细胞,检测其中B细胞表面CD80、CD86、CD40、MHC II的表达情况,进而观察CpG 5805作为佐剂对B细胞活化水平的影响。结果发现CpG 5805作为佐剂能够显着上调B细胞表面MHC II、CD80、CD86、CD40的表达,促进B细胞活化。为了检测以CpG 5805为佐剂的乙肝疫苗对免疫小鼠体内B细胞活化及其sTLR9表达水平的影响,我们从免疫后小鼠的免疫器官分离出引流区淋巴结细胞和脾细胞,检测其中B细胞上sTLR9及CD80、CD86、CD40和MHC II的表达水平。结果发现CpG 5805作为疫苗佐剂在小鼠体内能明显增强B细胞表面CD80、CD86、CD40和MHC II的表达水平,提高免疫器官中TLR9及其下游信号通路分子的m RNA表达水平。与此同时,CpG 5805作为疫苗佐剂能在小鼠体内明显下调B细胞sTLR9水平。以上结果提示,CpG 5805作为疫苗佐剂可以在小鼠体内下调B细胞sTLR9水平的同时,通过激活TLR9信号通路促进B细胞的活化。尽管CpG5805能够下调B细胞上sTLR9的表达水平,但却能够上调B细胞内总TLR9蛋白及m RNA水平,提示sTLR9的减少不能用总TLR9表达水平的变化来解释。由于TLR9具有移行（trafficking）的特性,可以从内质网移行至内体或细胞膜表面,那么,CpG 5805使sTLR9水平下降的唯一解释应该是迫使其向细胞内移行,移行最可能的目标位置应该是内体膜。为了验证这种推测,我们做了如下的研究:我们首先采用抗体喂养实验（antibody feeding assay）标记sTLR9,然后体外给予单独乙肝疫苗或联合CpG 5805刺激,最后使用共聚焦显微镜检测CD19+B细胞的sTLR9的位置。结果发现CpG 5805可以使CD19+B细胞上的sTLR9向细胞内移行并且移行至内体。与此同时,我们发现CpG 5805引起sTLR9内移的B细胞体积明显变大,由此推测发生sTLR9内移的B细胞发生了母细胞化。于是,接下来我们采用流式细胞术检测发现,CpG 5805和乙肝疫苗共同刺激后,体积变大的B细胞比例明显增多,这群B细胞上sTLR9水平明显下降,但CD40表达水平明显增高。这证明了我们的推测,即CpG 5805引起B细胞体积变大的确是B细胞活化的征象,并且B细胞活化的同时sTLR9水平降低。为了证明CpG5805的疫苗佐剂效应依赖其诱导B细胞sTLR9内移及TLR9信号活化,根据我们实验室的前期工作及相关文献报道,我们选择能特异性地抑制TLR9从内质网移出的CCT ODN（一种抑制性ODN）、抑制TLR9信号下传的MS19（也是一种抑制性ODN）、破坏内体酸化的氯喹及干扰AP2表达的si RNA作为研究工具,分别干扰TLR9移行的不同环节,观察CpG 5805对B细胞sTLR9水平及活化的调节是否受影响。结果显示:1)当用CCT ODN干扰TLR9从内质网移出时,无论CpG 5805存在与否,B细胞sTLR9水平都明显下降,同时,CpG 5805对B细胞CD40水平的上调作用也消失了,说明TLR9移行被阻断后CpG ODN刺激B细胞活化的作用不能发挥。2)当用AP2 si RNA干扰sTLR9内移时,CpG 5805诱导B细胞sTLR9水平下降的作用消失,同时其对B细胞表面CD40水平的上调作用也丧失,说明CpG ODN诱导B细胞活化与其诱导sTLR9水平下降是一致的。3)当用氯喹干扰内体酸化环境时,CpG 5805不能下调B细胞sTLR9水平,也不能上调B细胞CD40水平,说明CpG 5805诱导的B细胞活化需要以内体TLR9在酸性环境下工作为前提,并且sTLR9是否能进入内体也依赖内体的工作环境。4)当用MS19干扰TLR9信号通路时,CpG 5805仍能下调B细胞sTLR9的表达水平,但不能上调B细胞CD40水平,说明sTLR9内移后需加盟到内体TLR9介导的信号通路中才能发挥其免疫学活性。由此可见,CpG 5805引起的B细胞sTLR9水平下降及B细胞活化是通过sTLR9移行进入内体引起TLR9信号传导实现的。综上所述,我们从自行设计的CpG ODN中筛选获得一种C型CpG ODN,CpG 5805,并证明了其具有促进抗体应答的微生物疫苗佐剂效应。根据CpG 5805对B细胞sTLR9水平的调节作用,围绕TLR9移行的各个环节,证明了CpG 5805诱导B细胞sTLR9水平下降是其发挥免疫增强作用的一种机制,即被诱导下降的sTLR9移行进入内体,并加盟到内体TLR9介导的信号通路中,因此使B细胞活化成熟,抗体产生增多。这可能是阐述CpG ODN作为疫苗佐剂发挥免疫增强作用的另一机制。
黄欣[3]（2021）在《Graves病中MAIT和iNKT的频率、表型及细胞因子分析》文中提出目的:通过研究格雷夫斯氏病（Graves disease,GD）中黏膜相关恒定T细胞（Mucosal-associated invariant T cells,MAIT）和自然杀伤恒定T细胞（Invariant natural killer T cells,iNKT）的频率、表型及细胞因子,初步探讨其免疫作用,为判断病情和疗效提供新指标,并为免疫治疗GD寻找新靶点。方法:1.收集30例GD初治患者为治疗前组,其中19例131 I治疗后的GD患者为治疗后组,25例健康体检中心的健康人为健康人对照组,采集三组外周血样本;2.采用流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测三组外周血中MAIT频率、表面标志CD69及胞内产生的细胞因子干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）和颗粒酶B（granzyme B,Grz B）,同时检测iNKT频率、表面标志CD69及胞内细胞因子IFN-γ,并检测健康人对照组、GD患者治疗前组MAIT的凋亡;3.采用微量样本多指标蛋白定量技术（Cytometric Bead Array,CBA）测定血浆细胞因子IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β的浓度;4.采用多细胞因子检测技术（LEGENDplex）测定血浆细胞因子IL-12p70、IL-18的浓度;5.采用逆转录定量聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）检测IL-4 m RNA、IL-17A m RNA、IFN-γm RNA、TGF-βm RNA、IL-12p70 m RNA、IL-18 m RNA;6.体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激健康人和未治疗GD患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,体外刺激PBMCs培养24 h后,采用FCM检测健康人对照组、未治疗GD患者组MAIT表面标志CD69、胞内细胞因子IFN-γ和Grz B;7.体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激健康人和未治疗GD患者的外周血PBMCs,体外刺激PBMCs培养5天后,采用FCM检测健康人刺激组、健康人未刺激组、GD患者刺激组、GD患者未刺激组的MAIT的凋亡,并检测健康人对照刺激组和健康人对照未刺激组MAIT表面标志CD69。结果:1.与健康人对照组比较,GD患者治疗前组MAIT频率降低（P<0.01）、CD69表达上调（P<0.0001）、胞内IFN-γ产生减少（P<0.0001）、胞内Grz B增加（P<0.05）,治疗后组MAIT频率也降低（P<0.05）、CD69表达上调（P<0.001）、胞内IFN-γ产生减少（P<0.001）、胞内Grz B增加（P<0.01）;治疗后组与治疗前组相比,MAIT频率轻度升高,差异无统计学意义（P>0.05）,CD69表达轻度上调,差异无统计学意义（P>0.05）,胞内IFN-γ和Grz B轻度增加,差异无统计学意义（P>0.05）。相关性分析发现,治疗前组和治疗后组产生Grz B的MAIT频率与MAIT总体频率都呈负相关（P<0.05）,治疗前组产生Grz B的MAIT频率和年龄呈正相关（P<0.05）,治疗前组外周血表达CD69的MAIT频率与血浆TRAb呈显着正相关（P<0.01）。2.和健康人对照组相比,GD患者中重度组MAIT频率降低（P<0.01）、CD69表达上调（P<0.001）、胞内IFN-γ减少（P<0.001）、胞内Grz B增加（P<0.05）;轻度组MAIT频率轻度降低,差异无统计学意义（P>0.05）,CD69表达上调（P<0.01）,胞内IFN-γ减少（P<0.01）,胞内Grz B轻度增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与轻度组相比,中重度组MAIT频率降低（P<0.05）,CD69表达上调（P<0.05）,胞内IFN-γ轻度减少,差异无统计学意义（P>0.05）,胞内Grz B轻度增加,差异无统计学意义（P>0.05）。3.和健康人对照组相比,GD患者治疗前组iNKT频率升高（P<0.05）、CD69表达上调（P<0.01）、胞内IFN-γ产生减少（P<0.05）;治疗后组iNKT频率轻度升高,差异无统计学意义（P>0.05）,CD69表达轻度上调,差异无统计学意义（P>0.05）,胞内IFN-γ轻度减少,差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前组相比,治疗后组iNKT频率降低（P<0.05）,CD69表达轻度下调,差异无统计学意义（P>0.05）,胞内IFN-γ轻度增加,差异无统计学意义（P>0.05）。将健康人对照组的iNKT频率和健康人对照组的MAIT频率做相关性分析,结果显示呈显着正相关（P<0.01）,但在GD患者治疗前组和治疗后组外周血中,iNKT频率和MAIT频率均没有相关性（P>0.05）。4.与健康人对照组比较,GD患者中重度组iNKT频率升高（P<0.05）、CD69表达上调（P<0.01）、胞内IFN-γ减少（P<0.001）;轻度组iNKT的频率轻度升高,CD69表达轻度上调,胞内IFN-γ轻度减少,但差异无统计学意义（P>0.05）。与轻度组相比,中重度组iNKT频率轻度升高,CD69表达轻度上调,胞内IFN-γ轻度减少,但差异无统计学意义（P>0.05）。5.与健康人对照组相比,GD患者治疗前组血浆IFN-γ（P<0.0001）、IL-4（P<0.01）和IL-17A（P<0.0001）均升高,TGF-β轻度降低,差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后组血浆IFN-γ（P<0.001）、IL-17A（P<0.001）、TGF-β（P<0.0001）均高与健康人对照组,IL-4轻度升高,差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前组比较,治疗后组IL-17A降低（P<0.01）、IL-4降低（P<0.05）,TGF-β升高（P<0.0001）,IFN-γ轻度降低,差异无统计学意义（P>0.05）。三组基因水平IFN-γm RNA、IL-4 m RNA、IL-17A m RNA和TGF-βm RNA的相对表达差异与细胞因子蛋白水平基本一致。6.GD患者治疗前组血浆细胞因子IL-12p70升高（P<0.05）、IL-18升高（P<0.01）,治疗后组IL-12p70（P<0.05）和IL-18（P<0.0001）也升高,三组基因水平IL-12p70 m RNA、IL-18 m RNA的相对表达差异与细胞因子蛋白水平基本一致。治疗前GD患者MAIT凋亡率高于健康人对照组（P<0.001）。体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激未治疗GD患者与健康人的PBMCs培养24 h,结果显示,与健康人对照组相比,未治疗GD患者组MAIT表面CD69的表达轻度上调（P>0.05）,胞内IFN-γ轻度减少（P>0.05）,Grz B轻度增加（P>0.05）,差异均无统计学意义。体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激PBMCs培养5天后,健康人刺激组和GD患者刺激组MAIT凋亡率都分别高于两组对应的未刺激组（P<0.05）。健康人刺激组MAIT表面CD69的表达相比健康人未刺激组有所上调（P<0.01）。结论:1.MAIT参与抗GD,iNKT参与GD的发病。2.GD患者治疗前体内的Th1、Th2、Th17应答都显着增强,Treg应答受抑制;治疗后Th2应答减弱,偏向于Th1,Treg应答显着增强,Th17应答减弱,Th17/Treg趋向平衡。3.IL-12和IL-18可能促进了GD患者MAIT的活化及活化后凋亡,导致MAIT频率降低。4.GD患者病情越严重,MAIT频率越低,CD69表达越高;GD患者病情越严重,iNKT频率越高,CD69表达越高;MAIT或iNKT的频率及细胞表面CD69的表达可以作为判断GD病情严重程度的新指标,iNKT的频率和功能变化对于疗效判断也具有重要作用,且MAIT和iNKT可作为GD免疫治疗新靶点。
王亦心[4]（2021）在《利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答》文中研究说明研究目的:流感病毒属于正粘病毒科,分为甲、乙、丙、丁四型。甲型流感病毒（Influenza A viruses,IAVs）是导致人类流感大流行的主要原因,对公众健康造成潜在威胁。目前对于IAVs主要的预防措施是应用流感病毒疫苗,但是由于存在抗原漂移及抗原突变的情况,使得这种方式难以发挥较好的保护作用,并且一种疫苗难以针对不同种病毒毒株进行中和。很多研究发现组织定居记忆性T细胞（Tissue resident memory T cells,Trm cells）可能对于抵抗流感病毒感染有一定的作用,因此近些年针对于T细胞疫苗的研究也逐渐开展。甲型流感病毒的研究主要依赖于小鼠模型,但小鼠的肺组织结构及细胞比例与人肺脏存在一定的差异,因此小鼠的肺脏在感染后的免疫变化可能无法完全反应在人肺中的情况。而轻、中度流感病毒患者的肺组织样本往往难以取材,多数样本来源于癌旁组织及器官捐献,这些样本难以进行流感病毒感染期间肺内免疫细胞的动态观察研究。因此我们在给NCG免疫缺陷小鼠重建人的免疫系统（human immune system,HIS）的基础上,同时在鼠背部皮下移植同源HL组织,建立人免疫系统-人肺小鼠（HIS with autologous lung xenograft,HISL mice）模型。通过对移植后的人肺脏组织进行甲型流感病毒感染,来研究人肺中以及各个器官在感染之后的免疫应答情况,探究此模型的重要临床意义。研究方法:（1）通过给NCG小鼠肾被膜下移植人胚胎胸腺组织、背部皮下移植同源肺脏组织（HL）及尾静脉注射同源肝脏来源CD34+造血干细胞,建立HISL小鼠模型;（2）给予HISL小鼠皮下人肺移植物接种H1N1病毒,对照组给予PBS等体积接种,研究两组小鼠免疫细胞的变化、特异性抗体的产生、转录组的特征及差异;（3）给予HISL小鼠皮下HL预先接种H1N1病毒,再给予HISL小鼠致死剂量H1N1病毒经鼻接种,探求预先接种对于HISL小鼠接受致死剂量H1N1经鼻感染后的保护作用。研究结果:（1）给予接受全身辐照后的NCG小鼠肾被膜下胚胎胸腺组织移植、皮下同源胚胎肺组织移植、尾静脉注射同源胚胎肝脏来源的CD34+造血干细胞后,成功建立HISL小鼠模型,其人CD45+细胞嵌合比例可达90%以上,以T细胞、B细胞为主,髓系细胞、自然杀伤细胞比例较低;小鼠皮下移植的HL组织在模型建立成功后可见其具有与成人肺中相似的、完整的呼吸性气道等结构。（2）H1N1病毒感染小鼠皮下移植的人肺组织后,H1N1组HISL小鼠人肺中的HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞比例显着高于对照组,且H1N1组小鼠HL中CD4+Trm、CD8+Trm水平较PBS组显着升高,其水平与HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞的比例呈正相关;H1N1组HISL小鼠HL中HLA-A*0201限制性H1N1抗原特异性的CD8+T细胞的比例相比对照组显着升高;H1N1组HISL小鼠血清中产生病毒特异性的Ig、IgG抗体;两组小鼠人肺的转录组测序后表达基因存在显着差异,H1N1组小鼠HL中H1N1流感病毒感染相关、免疫相关的基因表达显着上调。（3）HISL小鼠皮下HL经过5000TCID50 H1N1病毒单次接种后,再次给予小鼠致死剂量（5000TCID50）病毒的经鼻接种,小鼠死亡;预先给予HISL小鼠多次500 TCID50 H1N1病毒皮下HL内接种,小鼠在经过致死剂量流感病毒经鼻感染后生存时间较对照组显着延长。研究结论:（1）HISL小鼠模型可实现对人肺脏组织结构、免疫细胞水平及变化等的研究。（2）HISL小鼠可研究人肺脏组织在流感病毒感染后人肺中的免疫细胞的变化,可进一步研究其中T细胞亚型的特点、基因组的差异以及血清中特异性抗体的产生。（3）多次低剂量H1N1病毒预先感染HISL小鼠皮下HL可提供一定的保护作用,延长该小鼠在接受致死剂量病毒经鼻感染后的生存时间,并提高其生存率。综上所述,本课题首次建立了可用于流感病毒研究的人肺脏组织及免疫系统的小鼠模型,为后期进一步研究感染后免疫系统的变化、T细胞表型特点、特异性抗体的产生、转录水平的差异等提供了有力的工具,并对后期疫苗的研发及其他肺部感染性疾病的研究等具有重要意义。
李琛[5]（2021）在《B淋巴细胞在功能性治愈的慢性乙型肝炎患者的免疫学特征》文中研究说明【目的】在全球大约有2.5亿人感染HBV（Hepatitis B virus,HBV）,慢性感染人群中HBs Ag自发清除率约为1%。核苷类似物（NAs）长期经治的患者联合聚乙二醇干扰素α（Peg-IFNα）在部分慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者实现功能治愈（发生HBs Ag阴转伴或不伴HBs Ab阳性）。本研究通过双荧光染料偶联HBV特异性B细胞,直接体外检测实现功能性治愈的CHB患者B细胞亚群及功能受体的特征,探讨实现功能性治愈的适应性免疫机制。【方法】纳入福建医科大学附属第一医院肝病中心肝内科NAs经治联合Peg-IFNα治疗的患者（IFN-α组）,共25人;未治疗CHB患者（CHB组）,共7人。根据治疗终点是否发生血清学转换,IFN-α治疗组分为:治愈组（Cure,CR组）:发生HBs Ag血清学转换,伴或不伴HBs Ab产生,HBe Ag（-）;未治愈组（Non-Cure,NCR组）:未发生HBs Ag血清学转换或HBe Ag（+）。分离患者外周血PBMC,将重组HBs Ag、HBc Ag分别与D488、D650染料结合,合成HBV特异性偶联;流式细胞术检测患者外周血总B细胞、HBs Ag/HBc Ag特异性B细胞中c MBC（CD21+、CD27+）、act MBC（CD21-、CD27+）、at MBC（CD21-、CD27-）,Ig M+、Ig G+在不同分组间细胞频数的差异,同时检测活化受体CD38、CD69以及抑制性受体Fc RL5、PD-1在HBs Ag特异性B细胞的表达,使用t检验或方差分析比较组间差异。使用pearson线性回归分析相关性。【结果】（1）总B细胞及记忆B细胞中各亚组及膜免疫球蛋白表达的比较IFNα治疗组的患者外周血总B细胞中c MBC与CHB组、HC组相比下降（p=0.12,p=0.02）。IFNα治疗组中记忆B细胞c MBC频数与HC组相比下降（p=0.002）,而act MBC、at MBC频数较CHB组及HC组升高（act MBC p=0.03,p=0.011）（at MBC p=0.019,p=0.048）。经过Peg-IFNα序贯联合NAs治疗后,IFNα组患者总B细胞中Ig G+细胞频数低于CHB组（p=0.02）。IFNα组患者记忆B细胞中Ig M+细胞频数低于CHB组、HC组（p=0.12,p=0.12）。（2）HBV特异性B细胞不同亚组及膜免疫球蛋白比较分析IFNα组中,CR组HBs Ag特异性B细胞中c MBC频数相比NCR组升高（p=0.12）,IFNα组HBs Ag特异性B细胞中c MBC频数与血清HBs Ab水平呈正相关关系（R2=0.1890,F=0.0299,p=0.03）。IFNα组HBc Ag特异性B细胞中c MBC、at MBC、Ig G+细胞频数显着低于CHB组（p=0.0002,p=0.04,p=0.0009）;Ig M+细胞频数显着高于CHB组（p=0.0009）。所有患者HBc Ag特异性B细胞频数显着高于HBs Ag特异性B细胞（p<0.001）。（3）总B细胞及HBs Ag特异性B细胞功能受体及抑制受体表达比较IFNα组总B细胞、HBs Ag特异性B细胞中CD38细胞频数相比CHB组显着升高（p=0.004,p=0.002）;IFNα治疗组HBs Ag特异性B细胞中,CD69 MFI相比CHB组显着升高（p=0.004）;IFNα组中,CR组HBs Ag特异性B细胞中CD69细胞频数较NCR组显着升高（p=0.04）。抑制受体FcRL5、PD-1在不同组间无差异,集中表达于at MBC。【结论】NAs联合Peg-IFNα治疗使患者外周血总B细胞及记忆B细胞亚群发生改变,发生抗体亚型转换的记忆B细胞增多。HBs Ag特异性B细胞表面活化受体表达增强;这在临床治愈组更显着。HBs Ag特异性B细胞中c MBC频数与血清HBs Ab水平相关,提示这一亚群在功能治愈中具有重要作用。
王晰[6]（2021）在《胃癌患者血浆外泌体PD-L1介导肿瘤细胞免疫逃逸机制的研究》文中研究说明目的:1、探究胃癌患者血浆外泌体PD-L1（ePD-L1）是否与疾病发展程度相关。2、探究胃癌患者血浆ePD-L1是否能够抑制T细胞活化。方法:1、使用外泌体纯化试剂纯化胃癌患者血浆中的外泌体。2、利用纳米粒子跟踪分析（NTA）技术和NanoSight NS300颗粒跟踪分析仪分析囊泡的数量以及大小;电镜观察外泌体超微结构;共聚焦荧光显微镜观察外泌体颗粒上特异标记的CD63和PD-L1抗原。3、利用ELISA对血浆ePD-L1进行定量检测,分析ePD-L1水平与癌症发展相关性。4、将CD8+T细胞与不同PD-L1水平的外泌体共孵育,利用流式细胞术检测PD-L1水平对CD8+T细胞表面CD69、PD-1的表达以及对TNFα、IFNγ含量的影响。结果:1、外泌体颗粒的电镜观察结果显示我们成功分离到有双层膜结构的外泌体。2、从肿瘤患者血浆中提取到的外泌体颗粒大小明显大于从正常人血浆中提取到的外泌体颗粒。3、利用共聚焦荧光观察了CD63和PD-L1在外泌体表面分布情况,通过肉眼观察可以发现患者血浆的PD-L1+外泌体明显多于对照。4、利用ELISA检测了30名患者和30名正常人血浆样品中的ePD-L1含量,检测结果显示癌症患者血浆ePD-L1的含量显着高于正常人血浆ePD-L1含量（P<0.01）。根据病例中肿瘤的TNM分期将30名患者分为3/4期（高分期）和1/2期（低分期）两组,将两组血浆样品中检测到的ePD-L1含量进行统计学分析,结果显示高分期的患者血浆ePD-L1明显高于低分期的患者（P<0.05）。根据病例信息中患者性别不同将30名患者分为两组,并对两组血浆样品中检测到的ePD-L1含量进行统计学分析,结果表明不同性别患者血浆ePD-L1的含量没有显着差异（P>0.05）。5、使用表达PD-L1的外泌体样品与CD8+T细胞共同孵育后,利用流式细胞术进行检测。结果显示,CD8+T细胞上CD69的表达、TNFα和IFNγ的含量明显降低（P<0.01）,而PD-1表达情况无明显变化（P>0.05）;使用不同PD-L1含量外泌体样品处理T细胞而后进行流式细胞术检测发现,比起PD-L1低表达的外泌体,PD-L1高表达的外泌体能够更强抑制CD8+T细胞上CD69的表达、TNFα和IFNγ的含量（P<0.05）,但PD-L1低表达和高表达的外泌体对PD-1表达造成的差异不显着（P>0.05）。结论:1、癌症患者血浆ePD-L1的水平显着高于正常人血浆ePD-L1水平,并且癌症患者血浆ePD-L1的水平与癌症分期呈正相关。2、胃癌患者血浆ePD-L1对CD8+T细胞的活化有显着的抑制作用。肿瘤细胞可能通过释放PD-L1+外泌体抑制T细胞的活化来抵抗免疫系统的抗肿瘤作用。
杜圣红[7]（2021）在《免疫蛋白酶体抑制剂诱导ITP免疫耐受机制研究》文中研究指明原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia,ITP）是一种由于自身免疫紊乱导致的出血性疾病,临床表现主要为无症状性血小板减少、皮肤粘膜出血、月经量过多、内脏出血,严重者可出现颅内出血,出血风险随年龄增大而增加,约占临床出血性疾病的30%。ITP发病机制复杂,主要包括以下几方面:1.体液免疫异常,机体免疫系统对自身抗原失耐受,产生多种抗血小板抗体,自身抗体与血小板膜糖蛋白结合,通过结合巨噬细胞表面的Fcy受体（Fc gamma receptors,FcγRs）使血小板被巨噬细胞吞噬破坏;2.细胞免疫异常,反应性T淋巴细胞和B淋巴细胞过度增殖活化,辅助性T细胞（T helper cells,Th）1/Th2、Th17/调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）亚群比例失衡,分泌多种细胞炎性因子,造成机体免疫紊乱;3.骨髓巨核细胞成熟障碍及破坏增加导致血小板生成减少等等均参与了ITP的发病。ITP的一线治疗为糖皮质激素和免疫球蛋白,激素的诸多副作用严重降低了患者的生活质量,并且约有15-20%的患者一线治疗无效。尽管有多种二线治疗药物,如CD20单克隆抗体、促血小板生成素受体激动剂（Thrombopoietin receptor agonist,TPO-RA）、重组人促血小板生成素（Recombinant humanthrombopoietin,TPO）、脾切除等,仍有约 1/3的患者对上述治疗反应不佳,发展为难治性ITP,这部分患者长期承受疾病和经济压力。因此,进一步深入探究ITP发病机制,为难治性ITP患者寻找新的治疗靶点意义重大。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）是细胞内蛋白质降解的主要途径。在蛋白质转录翻译、细胞周期调控、信号转导、细胞凋亡以及免疫应答等过程中发挥重要作用。该系统由泛素、泛素活化酶、泛素连接酶、泛素结合酶、去泛素化酶以及26S蛋白酶体组成。26S蛋白酶体由19S的帽子和20S蛋白酶体共同组成。20S蛋白酶体是一个由四个环组成的桶形复合体,两个外环由α亚基组成,两个内环由β亚基组成,形成中央蛋白水解室。β环由β1,β2,β5三个亚单位组成,是20S蛋白酶体的催化活性中心,它们在所有细胞中组成型表达。当细胞受到干扰素（Interferon,IFN）-γ、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-a、炎症反应和氧化应激等刺激后,β1,β2,β5分别被β1i[low molecular mass polypeptide（LMP）2]、β2i[multicatalytic endopeptidase complex-like（MECL）-1]和β5i（LMP7）取代,形成免疫蛋白酶体。与标准蛋白酶体相比,免疫蛋白酶体具有更高的糜蛋白酶样活性和更强的处理、呈递抗原的能力。越来越多的证据表明,免疫蛋白酶体与适应性免疫反应有关,在多种自身免疫性疾病的发病机制中起着至关重要的作用,选择性抑制免疫蛋白酶体亚单位可以改善类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、糖尿病和桥本甲状腺炎等小鼠模型的临床症状。免疫蛋白酶体抑制剂可以防止肾移植后慢性抗体介导的同种异体移植物排斥反应。应用选择性免疫蛋白酶体抑制剂可以靶向治疗具有高免疫蛋白酶体表达水平的细胞,如恶性肿瘤细胞。因此,免疫蛋白酶体抑制剂的临床应用可以降低蛋白酶体抑制的副作用,并改善未来的治疗选择。免疫蛋白酶体的功能研究最初聚焦在抗原加工处理上,它能高效产生有利于与MHC-I类分子结合的抗原肽,被CD8+T细胞识别。随着研究的深入,免疫蛋白酶体更多的功能被报道出来,包括调节T细胞存活、分化、增殖,以及影响相关细胞因子的产生,如白介素（interleukin,IL）-6、IFN-γ、TNF-α、IL-23。然而,免疫蛋白酶体在ITP中的作用及机制尚无相关报道。本研究旨在探讨免疫蛋白酶体亚单位在ITP患者中的表达情况,通过体外细胞实验和体内动物实验探讨免疫蛋白酶体抑制剂在ITP治疗中的作用。第一部分免疫蛋白酶体抑制剂对ITP患者的单核/巨噬系统及CD4+T细胞的作用机制研究研究背景:免疫蛋白酶体是蛋白酶体的一种特殊类别,主要表达在造血来源的细胞中,此外,其他非造血来源的细胞当受到IFN-γ、TNF-α等刺激后也可诱导表达免疫蛋白酶体。免疫蛋白酶体具有水解作用的亚基是LMP2、LMP10、LMP7,分别具有类半胱氨酸天冬酶活性、胰蛋白酶活性、糜蛋白酶活性。免疫蛋白酶体能够通过介导蛋白质水解发挥多种功能,如参与调节内在固有免疫和适应性免疫、有效的拮抗氧化应激、清除氧化损害蛋白、保护细胞功能等。随着研究的深入,发现适量的免疫蛋白酶体对于机体具有保护作用,然而过量的免疫蛋白酶体可能对细胞产生危害,导致一些自身免疫性疾病和肿瘤疾病的发生。研究表明,系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合症、多发性硬化症等患者的血清或者动物模型的免疫蛋白酶体亚单位表达增加,通过应用相应亚单位抑制剂或者敲除相关基因可改善上述疾病的症状。然而ITP患者免疫蛋白酶体各亚单位表达情况尚不清楚。既往实验证实,免疫蛋白酶体除了处理MHC类限制性表达的蛋白质外,还参与Th细胞分化的调节,通过抑制LMP7或敲除LMP7基因可以抑制Th1和Th17的分化,同时增强Treg细胞的产生。此外,研究发现选择性抑制免疫蛋白酶体对促炎细胞因子的产生有负性调节作用。然而,免疫蛋白酶体抑制剂在ITP中的作用机制尚有待研究。研究目的:1.检测ITP患者及健康人群外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）内免疫蛋白酶体亚基LMP2和LMP7的表达情况。2.探究免疫蛋白酶体抑制剂对纠正ITP免疫细胞功能异常的作用及机制。研究方法:1.纳入ITP患者33例,健康正常对照30例,分别收集外周血10mL,分离PBMCs,利用酶联免疫标记（enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA）测定ITP患者及正常对照LMP2、LMP7的表达,实时定量反转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测ITP患者及正常对照PBMCs中LMP2、LMP7的mRNA的相对表达水平。2.磁珠分选ITP患者外周血CD14+细胞,分别加入ML604440（LMP2抑制剂）、ONX-0914（LMP2和LMP7共同抑制剂）或DMSO处理24小时,流式细胞术检测CD16（FcγRⅢ）、CD64（FcγRI）的表达水平。3.巨噬细胞的吞噬功能:磁珠分选ITP患者外周血CD14+细胞,将ML604440或ONX-0914处理后的巨噬细胞与anti-CD41抗体包被的CMFDA（5-chloromethylfluorescein diacetate）标记的血小板共同孵育1小时,利用流式技术测定被吞噬的血小板的平均荧光强度（Mean fluorescent intensity,MFI）,并计算各处理组的吞噬指数。4.体外培养ITP患者PBMCs,分别加入ML604440、ONX-0914或DMSO处理10h,流式细胞术检测CD69的表达水平;药物处理72h,流式细胞术检测CD25的表达水平。5.磁珠分选ITP患者外周血CD4+细胞,分别加入ML604440、ONX-0914或DMSO处理72h,流式细胞术检测细胞内IFN-r、IL-17的表达水平。6.体外培养ITP患者PBMCs,分别加入ML604440、ONX-0914或DMSO处理72h,收集细胞裂解蛋白,利用Western-blot检测p-STAT1,STAT1,p-STAT3,STAT3蛋白表达情况。研究结果:1.ITP患者与正常对照相比,免疫蛋白酶体亚单位存在异常表达。1.1 在蛋白水平,ELISA结果显示ITP患者LMP2表达高于正常对照,LMP7表达在两类人群中无明显差异;1.2 在mRNA水平,ITP患者LMP2基因表达水平高于正常对照,LMP7表达水平在两类人群中无明显差异。2.ONX-0914降低ITP患者单核细胞表面激活型Fcγ受体的表达2.1 ONX-0914能够显着降低CD16表达,ML604440对于CD16表达无明显作用;2.2 ONX-0914和ML604440均未影响CD64的表达。3.ONX-0914抑制巨噬细胞吞噬血小板:ONX-0914处理后的巨噬细胞对于血小板的吞噬能力低于对照组,ML604440对于巨噬细胞的吞噬作用无明显影响。4.ONX-0914抑制T细胞活化水平:与对照组和ML604440处理组相比,ONX-0914能够降低T细胞早期活化指标（CD69）和晚期活化指标（CD25）的表达。5.ONX-0914抑制Th1亚群的分化5.1在体外培养条件下,与对照组和ML604440处理组相比,ONX-0914能够显着降低ITP患者的CD4+T细胞向Th1分化5.2 ONX-0914对于Th17亚群分化无明显影响。6.ONX-0914通过降低p-STAT1表达抑制Th1亚群的分化研究结论:1.ITP患者与正常对照相比,免疫蛋白酶体亚单位存在异常表达;2.利用ONX-0914共同抑制LMP2和LMP7可以降低ITP患者单核细胞表面FcγRⅢ（CD16）表达,抑制巨噬细胞吞噬作用,抑制T活化,抑制Th1亚群分化从而促进免疫耐受。第二部分免疫蛋白酶体抑制剂对I TP被动模型的治疗作用及机制研究研究背景及目的:通过第一部分的研究,我们发现免疫蛋白酶体亚单位在ITP患者中存在异常表达,通过体外细胞实验,发现LMP2和LMP7共同抑制剂ONX-0914可以降低激活型FcyR表达,抑制T活化,抑制Th1亚群分化,从而促进免疫耐受。为进一步研究免疫蛋白酶体抑制剂对ITP动物模型是否具有治疗作用,我们构建了ITP被动小鼠模型,给予免疫蛋白酶体抑制剂治疗,通过检测ITP小鼠血小板水平,脾脏单核细胞、肝脏单核细胞表面FcyR表达情况,脾脏M2型巨噬细胞表达以及T细胞的活化水平,进一步探究免疫蛋白酶体抑制剂对ITP的治疗作用并阐明其机制。研究方法:1.通过向C57/BL6小鼠腹腔注射抗CD41抗体构建ITP被动小鼠模型,随机分为对照组、ML604440治疗组、ONX-0914治疗组,对照组给予磷酸缓冲盐溶液（PBS）腹腔注射,治疗组分别给予ML604440（10mg/kg）、ONX-0914（10mg/kg）腹腔注射。隔天检测1次小鼠血常规。2.药物处理ITP小鼠7天后,分离小鼠脾脏细胞和肝脏细胞,利用流式细胞技术检测各组小鼠脾脏单核细胞和肝脏单核细胞表面FcyR表达情况;3.利用免疫荧光技术检测小鼠脾脏M2型巨噬细胞（F4/80+CD163+）表达情况;4.通过眼内眦取小鼠外周血,分离小鼠PBMCs,通过流式细胞技术检测CD4+T细胞表面CD25表达水平;分离小鼠胸腺细胞,检测CD4+T细胞表面CD25表达水平。研究结果:1.与对照组和ML604440治疗组相比,ONX-0914显着提高了 ITP被动模型小鼠外周血血小板水平;2.ONX-0914降低了脾脏单核细胞和肝脏单核细胞表面CD64表达;3.ONX-0914增加了脾脏M2型巨噬细胞表达;4.ONX-0914降低了小鼠外周血和胸腺CD4+T细胞活化水平。研究结论:ONX-0914对于ITP被动模型小鼠具有显着的治疗作用,可抑制单核细胞表面CD64表达,增加M2型巨噬细胞比例,抑制CD4+T细胞活化,从而促进免疫耐受,有望成为ITP患者新的治疗方案。
张鑫[8]（2021）在《五虎汤通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节RSV诱导哮喘小鼠DCs自噬对T细胞增殖活化的影响》文中认为目的:研究五虎汤通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节DCs自噬对RSV诱发的哮喘小鼠T细胞增殖活化的影响,进一步阐明五虎汤治疗RSV诱发哮喘的作用机制。方法:（1）五虎汤通过调节DCs自噬对RSV诱发哮喘小鼠Th17细胞炎性因子分泌的影响:在体内构建RSV诱发哮喘的小鼠模型,将小鼠分为正常组、模型组、五虎汤低、中、高剂量组、地塞米松组及雷帕霉素、氯喹组,每组各10只,予以相应药物干预后,ELISA检测肺泡灌洗液中IL-17A、IL-17F的表达,HE、PAS、Masson检测肺组织病理变化并计算黏液储备、胶原沉积情况,透射电镜下观察肺组织中自噬小体,Western Blot法检测DCs中自噬蛋白的表达。（2）五虎汤含药血清通过调节RSV诱导的DCs自噬对T细胞增殖活化的影响:体外原代分离小鼠骨髓源DCs与脾源CD4+T细胞,并以1:10的比例共培养,制备低、中、高剂量的五虎汤含药血清,体外构建RSV诱导DCs自噬的细胞模型,加含药血清与雷帕霉素、氯喹后,行抗鼠CD4-PE/CD3-APC抗体与CD69染色,流式细胞术分析各组CD4+T细胞的增殖与T细胞表面CD69的表达。（3）五虎汤对RSV诱发哮喘小鼠DCs自噬中PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控作用:在体内构建RSV诱发哮喘的小鼠模型,将小鼠分为正常组、模型组、五虎汤低、中、高剂量组、地塞米松组及雷帕霉素、氯喹组,予以相应药物干预后,分离肺组织中的DCs,Western Blot检测检测PI3K/Akt/mTOR信号通路上PI3K、Akt、phosph-Akt、phosph-mTOR、ULK1、phosph-ULK1、p70s6k、phosph-p70s6等蛋白表达,分析五虎汤对树突细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用。（4）五虎汤含药血清通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对RSV诱导DCs自噬的调控作用:体外原代分离DCs细胞后,构建RSV诱导DCs自噬模型,将细胞分为对照组、雷帕霉素组、氯喹组、低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清组,对各组细胞进行mRFP-eGFP-LC3质粒转染,饥饿诱导后激光共聚焦显微镜下观察自噬的发生,Western Blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路上关键蛋白的表达。结果:（1）体内实验结果显示:模型组小鼠肺泡灌洗液中IL-17A、IL-17F水平高于正常组,予以不同剂量的五虎汤干预后IL-17A、IL-17F表达水平降低;肺部病理染色显示模型组小鼠肺组织炎性渗出、管腔狭窄,黏液储备指数与胶原沉积指数水平上升,经各剂量的五虎汤治疗后改善,透射电镜与自噬蛋白检测显示模型组小鼠较正常组小鼠自噬水平上升,经五虎汤各剂量组治疗后自噬水平进一步升高。（2）体外实验结果显示:DCs与T细胞共培养感染RSV后,CD4+T细胞发生了过度的增殖与活化,雷帕霉素与氯喹,可以通过作用于DCs,使过度增殖的T细胞恢复正常。低、中、高含药血清作用于DCs后均能显着抑制异常增殖活化的CD4+T细胞,与自噬调节剂雷帕霉素、氯喹有相似的效果。（3）体内实验结果显示:在RSV诱发哮喘小鼠模型DCs中的PI3K/Akt/mT OR信号通路被异常激活,五虎汤干预后,Western Blot检测PI3K、phosph-Akt、phosph-mTOR、ULK1、phosph-ULK1蛋白的表达下降。（4）体外实验结果显示:激光共聚焦显微镜下RSV诱导DCs自噬模型中有较高的自噬水平,中、高剂量的含药血清干预后DCs的自噬水平进一步上升,Western Blot检测五虎汤含药血清可使PI3K、phosph-Akt、phosph-mTOR、ULK1、phosph-ULK1、phosph-p70s6蛋白的表达下降。结论:（1）在RSV诱导的哮喘中,DCs的自噬水平升高,IL-17A、IL-17F的表达升高,T细胞出现了过度的活化与增殖,PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活。（2）五虎汤在体内实验中能通过上调DCs的自噬水平,降低IL-17A、IL-17F表达;在体外实验中可通过DCs自噬抑制过度活化增殖的T细胞,对哮喘的气道炎症与气道重塑有改善作用。（3）五虎汤在体内、体外实验中能从上游抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路上蛋白的表达,提高DCs的自噬水平,从而影响T细胞的增殖活化与炎性因子分泌,发挥治疗作用。
朱涛[9]（2021）在《miR-15a/16-1对NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞生物学活性的影响及其机制》文中研究说明miR-1 5a/16-1基因复合体位于人13q14区域的DLEU2基因内含子内,其主要通过特异性结合多个靶基因发挥抑制肿瘤以及免疫调节的作用,miR-15a/16-1在多种类型的肿瘤疾病中处于较低水平,是一种公认的抑癌基因。NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞是一类具有免疫调节功能的细胞,其主要通过分泌TGF-β1进而抑制树突状细胞、NK细胞、和CD8+T细胞发挥免疫负调控效应。课题组前期通过模拟肿瘤微环境发现,经CD3抗体、CD3抗体+sRAE-1体外刺激后,野生型（WT）小鼠脾脏CD4+T细胞表面NKG2D的表达显着增加,同时发现miR-16-1的表达水平呈不同程度的下降趋势,并且通过CD3抗体、IL-2、IL-21、IL-15、IL-4等细胞因子模拟炎症微环境后也发现了同样的现象,初步明确miR-16-1与CD4+T细胞表面NKG2D呈负相关。此外,课题组前期引进了 miR-15a/16-1基因敲除（KO）小鼠,对该小鼠免疫功能进行初步分析发现,相较于WT小鼠,KO小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率显着增加,同时生物信息学分析显示NKG2D 3’-UTR存在miR-16-1的特异性结合区域,提示miR-16-1可能通过调控CD4+T细胞NKG2D的表达影响其功能。为了深入探讨CD4+T细胞中NKG2D表达的调控机制,以及该调控方式下是否影响CD4+NKG2D+T细胞的生物学功能,本研究拟通过流式细胞术（FCM）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、双荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-16-1是否可以特异性结合NKG2D的3’-UTR。以WT、TG、KO小鼠荷瘤模型及临床肿瘤患者样本资料为研究对象,探讨miR-15a/16-1对CD4+NKG2D+T细胞生物学活性的影响及其在结肠癌进展中的作用。研究内容分为两个部分:研究内容一:miR-15a/16-1对CD4+T细胞NKG2D表达的影响目的:分析miR-15a/16-1是否影响CD4+T细胞NKG2D的表达及其分子机制。方法:（1）应用FCM检测生理状态下KO小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率以及CD4+T细胞表面CD25,CD44,CD69,CD28活化分子的表达。（2）应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-16-1是否可以特异性结合NKG2D 3’-UTR。（3）构建miR-15a/16-1转基因（TG）小鼠;应用PCR、FCM对TG小鼠进行常规鉴定;应用RT-qPCR检测TG小鼠组织miR-16-1的表达水平;应用RT-qPCR检测生理状态下KO小鼠、TG小鼠脾脏CD4+T细胞中miR-16-1与NKG2D mRNA水平;FCM检测生理状态下TG小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率以及CD4+T细胞表面CD25,CD44,CD69,CD28活化分子的检测;通过CD3抗体、CD3抗体+sRAE-1体外诱导TG小鼠脾脏中NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞的产生,FCM检测该群细胞的频率以及CD25,CD44,CD69,CD28活化分子的变化。结果:（1）与WT小鼠相比,生理状态下KO小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率显着增加;与WT小鼠相比,KO小鼠CD4+T细胞表面CD28、CD25的表达无明显变化,而CD44、CD69的表达显着升高。（2）共转染pGL3-NKG2D-WT、pRL-TK（海肾内参质粒）和miR-16-1模拟物后,293T细胞中萤火虫荧光/海肾荧光比值显着低于对照组,而转染pGL3-NKG2D-MUT的293T细胞中该比值无明显变化,结果证实miR16-1直接特异性结合NKG2D 3’-UTR,抑制CD4+T细胞NKG2D表达。（3）与WT小鼠相比,TG小鼠PCR可以扩增出特异性的条带且鼠尾外周血GFP阳性率显着升高;TG小鼠组织miR-16-1的表达水平较WT小鼠明显上调;NKG2D mRNA水平在TG小鼠脾脏CD4+T细胞中显着下调,而其水平在KO小鼠中上调;生理状态下TG小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率无明显变化且CD4+T细胞表面活化分子CD25,CD44,CD69,CD28均无明显变化;与WT小鼠相比,经CD3抗体、CD3抗体+sRAE-1活化后,TG小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的诱生能力下降,同时相应的活化分子CD25,CD44,CD69,CD28无明显变化,提示miR-16-1通过特异性结合NKG2D 3’-UTR参与NKG2D的表达。结论:miR-16-1可特异性结合NKG2D 3’-UTR,抑制CD4+T细胞NKG2D的表达。研究内容二:miR-15a/16-1对CD4+NKG2D+T细胞的功能影响及其在结直肠癌发生发展中的作用目的:观察miR-15a/16-1是否影响CD4+NKG2D+T细胞功能,是否与结肠癌的进展有相关性。方法:（1）通过FCM检测生理状态下KO小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞IL-10、TGF-β1的分泌情况;将CD8+T细胞分别与WT,KO小鼠NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞共培养,FCM分别检测共培养体系中有或没有TGF-β1中和抗体条件下CD8+T细胞IFN-γ的分泌情况。（2）制备WTMC38荷瘤小鼠模型,将KO小鼠来源的NK1.11-CD4+NKG2D+T细胞通过尾静脉过继输入到该荷瘤小鼠模型体内,观察荷瘤小鼠的肿瘤生长情况。（3）制备WT、TGMC38荷瘤小鼠模型,记录肿瘤生长曲线,应用FCM检测WT、TGMC38荷瘤小鼠脾脏、肿瘤中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率;制备WT、TG B16BL6荷瘤小鼠模型,记录肿瘤生长曲线,应用FCM检测WT、TGB16BL6荷瘤小鼠脾脏、肿瘤中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率。（4）收集52例结直肠癌（CRC）患者临床样本,检测CRC患者外周血单个核细胞（PBMC）中CD4+NKG2D+T细胞的频率,以胞内染色法检测该细胞IL-10、TGF-β1的分泌,并分析上述指标在CRC不同临床分期中的差异;通过RT-qPCR检测11例CRC 患者 PBMC 中 CD4+NKG2D+T细胞与 CD4+NKG2D-T 细胞中 miR-16-1 的表达,分析miR-16-1与CD4+T细胞NKG2D、IL-10、TGF-β1水平的关联性。结果:（1）与WT小鼠相比,KO小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞分泌IL-10、TGF-β1的能力显着增强;相较WT小鼠而言,与KO小鼠共培养的CD8+T细胞IFN-γ的产生能力下降,当在共培养体系中加入TGF-β1中和抗体后,CD8+T细胞产生IFN-γ的能力基本得到恢复。以上结果提示miR-15a/16-1水平下调后NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞的免疫调节活性增强。（2）与PBS对照组相比,过继输入KO小鼠来源的NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞明显加剧了 WT荷瘤小鼠肿瘤的生长。进一步证实miR-15a/16-1水平下调后NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的免疫调节活性增强从而促进肿瘤的进程。（3）与WT MC38荷瘤小鼠相比,MC38细胞在TG小鼠体内形成的肿瘤略大,WT、TG MC38荷瘤小鼠脾脏和肿瘤中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞频率无明显变化;与WT B16BL6荷瘤小鼠相比,B16BL6细胞在TG小鼠体内增长的速度稍快于WT小鼠,WT、TG B16BL6荷瘤小鼠脾脏和肿瘤中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞频率无明显变化。（4）结直肠癌患者PBMC中CD4+NKG2D+T细胞的频率均显着增加,且该群细胞IL-10、TGF-β1的分泌能力较健康对照组显着增强,同时上述指标与Dukes分期呈正相关趋势（Dukes A期至D期）;同一个体CD4+NKG2D-T细胞miR-16-1的表达高于 CD4+NKG2D+T 细胞;在结直肠癌患者 PBMC 中,miR-16-1 与 NKG2D、IL-10、TGF-β1的荧光强度呈负相关。结论:低水平的miR-15a/16-1可以增强CD4+NKG2D+T细胞的负向免疫调节活性从而促进肿瘤的进展;结直肠癌患者PBMC中CD4+NKG2D+T细胞频率增加,且该群细胞低表达miR-16-1,可能与结直肠癌疾病的发生发展有一定的相关性。
刘双双[10]（2021）在《玉米赤霉烯酮对小鼠B淋巴细胞免疫功能的影响及TLR4/MAPK在其中发挥的作用》文中指出玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）主要产生于禾谷镰刀菌,是一种具有非甾体类雌激素活性的霉菌毒素,其污染范围遍布全世界,对人类和动物的健康构成极大的威胁。ZEA可对动物生殖系统、免疫系统及内分泌系统等造成损伤。近来年有许多关于ZEA对动物造成免疫抑制的相关报道,但其具体作用机制尚未完全探明,尤其对于在体液免疫应答中发挥重要作用的B淋巴细胞影响的研究较少。为了探究ZEA的免疫毒性作用机理,本试验以小鼠原代B淋巴细胞为材料,探究了 ZEA对B淋巴细胞相关免疫功能的影响,以及TLR4/MAPK在ZEA对B淋巴细胞相关免疫功能影响中的作用。1.ZEA对B淋巴细胞活性及活化的影响选取4～6周龄BALB/c小鼠,无菌摘取脾脏,研磨成单细胞悬液,采用免疫磁珠法分选出纯度在90%以上的B淋巴细胞。以0（Control组）、5 μg/mL LPS（LPS组）、5 μg/mLLPS+（10、20、30 μM）ZEA 分别处理 B 淋巴细胞 12h、24h、30h、72h 后:①CCK-8法检测ZEA对小鼠B淋巴细胞体外活性的影响;②显微镜明场下观察ZEA对B淋巴细胞活化聚团现象的影响;③流式细胞术检测ZEA对小鼠B淋巴细胞各期活化标识分子的影响。结果显示:①24h时,不同浓度ZEA均极显着的抑制了 LPS诱导的B淋巴细胞活性升高（P<0.01）;②显微镜明场下观察,与Control组相比,LPS组细胞体积显着增大,并发生活化聚团现象。U型底96孔板培养细胞24 h后,与Control组相比,LPS组细胞发生明显聚集,并有少量聚团现象;与LPS组相比,10 μM ZEA处理后,细胞的聚团现象基本消失,20、30 μM ZEA处理后,细胞状态发生明显分散;③在12h、30h、72h时,流式细胞术分别检测B淋巴细胞早、中、晚期活化标识分子 CD69、CD25、CD71,发现 LPS 组与 Control 组相比,CD69、CD25、CD71 表达量均极显着升高（P<0.01）,ZEA各染毒组与LPS组相比,CD69、CD25、CD71表达量均显着或极显着下降（P<0.05或P<0.01）,且呈剂量依赖效应。以上结果说明,ZEA可抑制LPS诱导的B淋巴细胞的活性及活化。2.ZEA对B淋巴细胞增殖、分化及吞噬能力的影响以免疫磁珠法分选的B淋巴细胞为材料,0、5 μg/mL LPS及5 μg/mL LPS+（20、30 μM）ZEA分别处理细胞48 h、72 h后:①CFSE探针法检测ZEA对B淋巴细胞增殖的影响;②流式细胞术检测ZEA对B淋巴细胞向浆细胞分化的影响以及qRT-PCR检测ZEA对小鼠B淋巴细胞分化相关调控基因表达的影响;③流式细胞术检测ZEA对B淋巴细胞吞噬能力的影响。结果显示:①在72 h时,不同浓度的ZEA均显着或极显着的抑制了LPS诱导的原代B淋巴细胞的增殖（P<0.05或P<0.01）,且呈剂量依赖效应;②不同浓度的ZEA均极显着的抑制了 LPS诱导的B淋巴细胞向浆细胞的分化（P<0.01）,且抑制了 LPS诱导的促进B淋巴细胞分化成熟相关基因XBP-1、IRF-4和Blimp-1的表达（P<0.05或P<0.01）,并可促进LPS诱导的B淋巴细胞抑分化基因BCL-6和Pax-5的表达下降,在30 μM时达到极显着水平（P<0.01）;③在48 h时,不同浓度的ZEA均极显着的抑制了 LPS诱导的B淋巴细胞吞噬能力（P<0.01）。以上结果说明,ZEA可抑制LPS诱导的B淋巴细胞的增殖、分化、及吞噬能力。3.TLR4/MAPK在ZEA对B淋巴细胞相关免疫功能影响中的作用以免疫磁珠法分选的B淋巴细胞为材料,0、5 μg/mL LPS及5 μg/mL LPS+（20、30 μM）ZEA处理细胞24 h,20 μM的ZEA与10μM的ERK抑制剂U0126单独或联合处理LPS诱导的B淋巴细胞24 h,20μM的ZEA与10 μM的JNK抑制剂SP600125单独或联合处理LPS诱导的B淋巴细胞24 h。①采用Western-blot方法检测ZEA对TLR4信号通路相关蛋白的表达水平,以及NFκB的表达;②采用Western-blot方法检测ZEA对B淋巴细胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影响,以及ZEA与U0126或SP600125单独或联合处理对FERK1/2和JNK1/2磷酸化的影响;③ELISA试剂盒分别检测ZEA与U0126或SP600125单独或联合处理对LPS诱导的细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌状况的影响。结果显示:①不同浓度的ZEA均可抑制LPS诱导的TLR4、MyD88和p-IκBα的表达,其中MyD88蛋白的表达量在30μM ZEA时呈显着下降（P<0.05）,p-IκBα的表达量呈显着或极显着下降（P<0.05或P<0.01）;与LPS组相比,ZEA各染毒组NFκB总蛋白表达量呈下降趋势,在30μM ZEA时呈极显着下降（P<0.01）,胞浆蛋白呈上升趋势,在30μMZEA时呈极显着上升（P<0.01）,核蛋白表达量下降,在30 μMZEA时呈显着下降（P<0.05）;②不同浓度的ZEA均可使LPS诱导的ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平呈显着或极显着上升（P<0.05或P<0.01）;与ZEA组相比,ZEA和U0126联合处理组的ERK1/2磷酸化水平极显着下降（P<0.01）,ZEA和SP600125联合处理组的JNK1/2磷酸化水平极显着下降（P<0.01）;③与Control组相比,LPS刺激24h后,细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均极显着升高（P<0.01）;与LPS组相比,20μM的ZEA可使细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量显着下降（P<0.05）;与单独ZEA处理组相比,ZEA和U0126联合处理组以及ZEA和SP60015联合处理组IL-1β、IL-6、TNF-α均无显着变化（P>0.05）。以上结果说明,ZEA可抑制B淋巴细胞中LPS诱导的TLR4信号途径和NFκB的激活,促进MAPK信号途径激活,并主要通过TLR4抑制了炎性细胞因子的分泌。结论:ZEA可通过抑制LPS激活的B淋巴细胞TLR4信号通路途径抑制NFκB的入核,并可导致MAPK信号途径的过度激活,从而抑制了 LPS诱导的B淋巴细胞的活性、活化、增殖、分化、吞噬等免疫功能的发挥,导致动物机体免疫应答发生抑制。
二、CD69与免疫功能的调节（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CD69与免疫功能的调节（论文提纲范文）
（1）来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 Abbreviations |
| 1 引言 |
| 1.1 肿瘤免疫循环与免疫治疗 |
| 1.1.1 肿瘤免疫循环是肿瘤免疫治疗的基础 |
| 1.1.2 肿瘤免疫循环失调限制免疫治疗效果 |
| 1.2 CD28调控抗肿瘤免疫反应和PD-1/PD-L1抗体治疗效果 |
| 1.2.1 CD28共刺激信号促进CD8~+T细胞的激活和效应细胞功能 |
| 1.2.2 CD28共刺激受体的缺失削弱抗肿瘤免疫反应 |
| 1.2.3 CD28共刺激受体的缺失导致PD-1/PD-L1抗体治疗失效 |
| 1.3 来那度胺的发现与发展 |
| 1.3.1 来那度胺的发现过程 |
| 1.3.2 来那度胺具有广谱的抗肿瘤潜力 |
| 1.4 来那度胺对T细胞的共刺激作用 |
| 1.4.1 来那度胺直接杀伤MM和MDS细胞的分子机制 |
| 1.4.2 来那度胺的抗血管生成作用 |
| 1.4.3 来那度胺增强NK细胞免疫反应 |
| 1.4.4 来那度胺具有共刺激T细胞的作用 |
| 1.4.5 来那度胺共刺激T细胞具有免疫治疗潜力 |
| 1.5 CRBN的I391V突变使得小鼠细胞响应来那度胺 |
| 1.6 来那度胺通过降解IKZF1和IKZF3共刺激T细胞 |
| 1.6.1 来那度胺通过降解IKZF1和IKZF3上调IL-2表达 |
| 1.6.2 IKZF1和IKZF3调控T细胞激活 |
| 1.7 本课题拟解决的科学问题 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 质粒和感受态细胞 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 常用的溶液配制 |
| 2.1.7 小鼠基因型鉴定引物以及Q-PCR引物 |
| 2.1.8 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Crbn~(I391V)小鼠的构建 |
| 2.2.2 MC38-OVA和B16F10-OVA细胞的构建 |
| 2.2.3 细胞培养常用技术 |
| 2.2.4 小鼠T细胞分离和激活实验 |
| 2.2.5 小鼠T细胞杀伤实验 |
| 2.2.6 在小鼠CD8~+T细胞中敲除Ikzf1和Ikzf3 |
| 2.2.7 小鼠肿瘤模型构建与给药处理 |
| 2.2.8 通过流式细胞术分析脾脏细胞中以及肿瘤中浸润的淋巴细胞 |
| 2.2.9 蛋白质免疫印记(Western Blot) |
| 2.2.10 蛋白热位移实验 |
| 2.2.11 RNA测序以及数据分析 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR(Q-PCR) |
| 2.2.13 酶联免疫吸附测定法(ELISA) |
| 2.2.14 CRISPR文库筛选 |
| 2.2.15 统计分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 来那度胺在体外共刺激Crbn~(I391V)小鼠T细胞 |
| 3.1.1 Crbn~(I391V)小鼠的构建 |
| 3.1.2 来那度胺促进Crbn~(I391V)小鼠T细胞激活与增殖 |
| 3.1.3 来那度胺增强Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力 |
| 3.2 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内增强抗肿瘤免疫反应 |
| 3.2.1 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内抑制MC38-OVA肿瘤生长 |
| 3.2.2 来那度胺抑制MC38-OVA肿瘤生长是由CD8~+T细胞介导的 |
| 3.2.3 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内促进T细胞激活、增殖和分化 |
| 3.3 来那度胺共刺激CD28~-CD8~+T细胞 |
| 3.3.1 来那度胺在CD8~+T细胞中引起的转录组变化与CD28 共刺激信号类似. |
| 3.3.2 来那度胺共刺激缺少CD28受体的Crbn~(I391V)小鼠T细胞 |
| 3.3.3 来那度胺共刺激结直肠癌病人来源的CD28~-CD8~+T细胞 |
| 3.4 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内增强抗肿瘤免疫反应 |
| 3.4.1 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内抑制MC38-OVA肿瘤生长 |
| 3.4.2 来那度胺部分弥补CD28 缺失造成的T细胞激活、增殖和分化的缺陷 |
| 3.5 来那度胺逆转CD28缺陷导致的PD-1抗体治疗失效 |
| 3.5.1 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内恢复PD-1抗体的疗效 |
| 3.5.2 来那度胺联合PD-1抗体促进结直肠癌病人来源的CD28~-CD8~+T细胞增殖 |
| 3.6 来那度胺通过上调IL-2分泌和调控细胞内在信号共刺激CD8~+T细胞 |
| 3.6.1 免疫调节药物共刺激CD8~+T细胞与其降解IKZF1和IKZF3的效率相关 |
| 3.6.2 敲除Ikzf1或Ikzf3促进小鼠CD8~+T细胞激活 |
| 3.6.3 来那度胺上调Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞中的IL-2信号 |
| 3.6.4 来那度胺部分通过上调IL-2 分泌共刺激CD8~+T细胞 |
| 3.7 来那度胺上调CD8~+T细胞中部分Notch靶基因的表达 |
| 3.7.1 来那度胺通过不依赖于IL-2的方式上调部分Notch靶基因的表达 |
| 3.7.2 在Jurkat T细胞中敲除IKZF1或IKZF3上调部分Notch靶基因的表达 |
| 3.8 上调Notch靶基因表达是来那度胺共刺激CD8~+T细胞的关键分子机制之一 |
| 3.9 阻断IL-2和Notch信号抑制来那度胺与PD-1抗体联合治疗效果 |
| 3.9.1 IL-2 抗体联合Notch抑制剂阻断来那度胺与PD-1抗体在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内的联合治疗效果 |
| 3.9.2 IL-2 抗体联合Notch抑制剂减弱来那度胺联合PD-1抗体促进T细胞激活和分化的能力 |
| 3.10 通过CRISPR文库筛选寻找增强MC38-OVA肿瘤对来那度胺敏感性的基因突变 |
| 3.10.1 CRISPR文库筛选的实验流程和筛选过程中的肿瘤生长变化 |
| 3.10.2 对CRISPR文库筛选的NGS数据进行MAGe CK分析 |
| 3.11 利用Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞筛选具有共刺激T细胞潜力的化合物 |
| 4 结论与意义 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议书 |
（2）基于B细胞表面TLR9水平及移行与B细胞活化的关系研究CpG ODN发挥疫苗佐剂作用的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.CpG ODN及其免疫学活性 |
| 1.1 CpG ODN的发现及种属特异性 |
| 1.2 CpG ODN的分型 |
| 1.3 CpG ODN作为TLR9 激动剂启动TLR9 信号转导 |
| 1.4 CpG ODN作为疫苗佐剂及其机制的研究 |
| 2.TLR9 的结构、移行和定位 |
| 2.1 TLR9 的结构 |
| 2.2 TLR9 的移行和定位及其与活化的关系 |
| 3.sTLR9 的结构、免疫学活性及与CpG ODN的关系 |
| 3.1 sTLR9 的结构 |
| 3.2 sTLR9 的免疫学活性 |
| 3.3 sTLR9与CpG ODN的关系 |
| 4.人用疫苗佐剂的研究现状 |
| 4.1 疫苗佐剂概述 |
| 4.2 几种人用疫苗佐剂的组成及作用机制 |
| 4.3 疫苗佐剂的作用途径 |
| 科学假设 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 自行设计的CpG ODN及其对B细胞sTLR9 的影响 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验动物及细胞 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.2.1 CpG ODN |
| 1.2.2 VSV病毒 |
| 1.2.3 其他试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.3.1 实验仪器 |
| 1.3.2 实验耗材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 CpG ODN二级结构预测 |
| 1.4.2 CpG ODN的免疫刺激基序分析 |
| 1.4.3 CpG ODN与病原微生物基因序列的同源性及相似性比对 |
| 1.4.4 CpG ODN的综合评分方式 |
| 1.4.5 CpG ODN的合成 |
| 1.4.6 小鼠脾细胞的分离 |
| 1.4.7 细胞培养及细胞培养上清的制备 |
| 1.4.8 细胞的荧光抗体染色及流式细胞术检测 |
| 1.4.9 Ed U掺入法检测细胞增殖 |
| 1.4.10 VSV保护实验 |
| 1.4.11 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 自行设计CpG ODN的分析评估 |
| 2.1.1 CpG ODN的 CG基序数量分析 |
| 2.1.2 CpG ODN的免疫刺激基序分析 |
| 2.1.3 CpG ODN的二级结构预测 |
| 2.1.4 CpG ODN与病原微生物基因序列的同源性及相似性比对 |
| 2.1.5 CpG ODN的综合评分 |
| 2.2 CpG ODN的合成及鉴定 |
| 2.2.1 CpG ODN的合成及基本信息 |
| 2.2.2 CpG ODN的纯度鉴定 |
| 2.3 .CpG ODN免疫学活性的验证性研究及分型 |
| 2.3.1 CpG ODN的抗病毒活性研究 |
| 2.3.2 CpG ODN对脾细胞增殖的影响 |
| 2.4 .CpG ODN对 B细胞sTLR9及t TLR9 水平的影响 |
| 2.4.1 CpG ODN对 B细胞sTLR9 水平的影响 |
| 2.4.2 CpG5805对B细胞sTLR9 水平的影响 |
| 2.4.3 CpG5805对t TLR9 表达水平的影响 |
| 2.5 CpG5805 对脾细胞中免疫细胞增殖及活化的影响 |
| 2.5.1 CpG5805 对脾细胞中B细胞增殖及活化的影响 |
| 2.5.2 CpG5805 对脾细胞中树突状细胞增殖及活化的影响 |
| 2.5.3 CpG5805 对脾细胞中CD4~+T 细胞增殖及活化的影响 |
| 2.5.4 CpG5805 对脾细胞中CD8~+T 细胞增殖及活化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 CpG 5805 疫苗佐剂效应及与B细胞活化和sTLR9 水平的关系 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.1.1 重组蛋白 |
| 1.1.2 灭活病毒 |
| 1.1.3 商品化乙肝疫苗 |
| 1.1.4 疫苗乳化剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 疫苗的配制 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 小鼠尾静脉采血及血清分离 |
| 1.2.4 抗体水平的检测 |
| 1.2.5 B细胞表面协同共刺激分子、MHC II及 sTLR9 的检测 |
| 1.2.6 小鼠淋巴器官TLR9 信号通路分子的mRNA水平检测 |
| 1.2.7 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 CpG5805 作为疫苗佐剂对抗体产生水平的影响 |
| 2.1.1 CpG5805 作为重组蛋白疫苗佐剂对抗体产生水平的影响 |
| 2.1.2 CpG5805 作为灭活病毒疫苗佐剂对抗体产生水平的影响 |
| 2.1.3 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂对抗体产生水平的影响 |
| 2.2 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外对小鼠脾细胞中B细胞活化的影响 |
| 2.2.1 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外不同时间点对小鼠脾细胞中B细胞表面CD80 的影响 |
| 2.2.2 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外不同时间点对小鼠脾细胞中B细胞表面CD86 的影响 |
| 2.2.3 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外不同时间点对小鼠脾细胞中B细胞表面CD40 的影响 |
| 2.2.4 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外不同时间点对小鼠脾细胞中B细胞表面MHC II的影响 |
| 2.3 CpG5805 为佐剂的疫苗对小鼠淋巴器官中B细胞活化及sTLR9 表达水平的影响 |
| 2.3.1 CpG5805 为佐剂的疫苗对小鼠淋巴器官内活化B细胞及sTLR9 表达细胞比例的影响 |
| 2.3.2 CpG5805 为佐剂的疫苗对小鼠淋巴器官内B细胞上活化双信号及sTLR9 表达水平的影响 |
| 2.3.3 CpG5805 为佐剂的疫苗对小鼠淋巴器官TLR9 信号通路表达的影响 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三章 CpG5805 诱导sTLR9 移行与B细胞活化的关系 |
| 1.实验方法 |
| 1.1 流式细胞术 |
| 1.2 免疫荧光 |
| 1.3 抗体喂养实验 |
| 1.4 原代小鼠脾细胞siRNA干扰 |
| 1.5 siRNA沉默AP2 表达效果的鉴定 |
| 2.结果 |
| 2.1 CpG5805对sTLR9 移行及定位的影响 |
| 2.1.1 CpG5805对B细胞sTLR9 移行的影响 |
| 2.1.2 CpG5805 诱导sTLR9 移行位置的探索 |
| 2.2 CpG5805 诱导sTLR9 移行对B细胞活化的影响 |
| 2.2.1 CpG5805 诱导sTLR9 移行对B细胞母细胞化的影响 |
| 2.2.2 CpG5805 诱导的母细胞化B细胞上sTLR9 的表达 |
| 2.2.3 CpG5805 诱导的B 细胞上sTLR9 的表达水平与B 细胞活化水平的关系 |
| 2.3 干扰TLR9 移行对CpG5805 调节B 细胞 sTLR9 表达水平及B 细胞活化水平的影响 |
| 2.3.1 阻断TLR9 移出内质网对B 细胞sTLR9 表达及B 细胞活化的影响 |
| 2.3.2 阻断sTLR9 向内体移行对B 细胞sTLR9 表达及B 细胞活化的影响 |
| 2.3.3 干扰内体对B 细胞sTLR9 表达及B 细胞活化的影响 |
| 2.3.4 干扰TLR9 下游信号通路对B 细胞sTLR9 表达及B 细胞活化的影响 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）Graves病中MAIT和iNKT的频率、表型及细胞因子分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| MAIT在恶性肿瘤中的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 甲型流感病毒的概述 |
| 2.1.1 流行病学 |
| 2.1.2 结构及致病机制 |
| 2.1.3 预防和治疗 |
| 2.2 流感病毒感染后机体的免疫应答 |
| 2.2.1 病毒如何进入宿主 |
| 2.2.2 病毒编码的几种蛋白 |
| 2.2.3 固有免疫反应 |
| 2.2.4 适应性免疫反应 |
| 2.3 人源化小鼠模型的发展和应用 |
| 2.3.1 人源化小鼠模型的发展 |
| 2.3.2 人源化小鼠模型在流感病毒研究中的应用 |
| 2.4 组织定居记忆性T细胞 |
| 2.4.1 概述 |
| 2.4.2 特征 |
| 2.4.3 发展 |
| 2.4.4 Trm与呼吸系统 |
| 第3章 人免疫系统-人肺小鼠模型的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 人胚胎组织来源 |
| 3.2.3 材料及试剂 |
| 3.2.4 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人胚胎肺脏组织处理 |
| 3.3.2 人胚胎肝脏来源CD34~+细胞的分离 |
| 3.3.3 人胚胎胸腺组织处理 |
| 3.3.4 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.3.5 HISL小鼠模型的构建 |
| 3.3.6 HISL小鼠构建后流式细胞术鉴定免疫系统重建水平 |
| 3.3.7 HISL小鼠取材检测 |
| 3.3.8 HISL小鼠各组织器官HE染色 |
| 3.3.9 流式细胞术染色方案 |
| 3.3.10 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.4.2 HISL小鼠模型构建 |
| 3.4.3 HISL小鼠免疫系统的重建水平 |
| 3.4.4 HISL小鼠建立后HL结构及其中免疫细胞的水平 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 人免疫系统-人肺小鼠流感病毒感染后的免疫应答 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 SPF鸡蛋 |
| 4.2.3 甲型流感病毒和MDCK细胞 |
| 4.2.4 材料和试剂 |
| 4.2.5 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 种蛋孵育 |
| 4.3.2 甲型流感病毒的扩增 |
| 4.3.3 甲型流感病毒血凝值的测定 |
| 4.3.4 甲型流感病毒TCID50测定 |
| 4.3.5 人免疫系统-人肺小鼠建立及鉴定 |
| 4.3.6 人免疫系统-人肺小鼠感染甲型流感病毒 |
| 4.3.7 感染甲型流感病毒后21天取材检测 |
| 4.3.8 流感病毒特异性IgM、IgG抗体ELISA检测 |
| 4.3.9 各器官组织化学染色 |
| 4.3.10 流式细胞术染色方案 |
| 4.3.11 转录组测序分析 |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 H1N1流感病毒效价及TCID50 |
| 4.4.2 HISL小鼠感染H1N1后免疫细胞的总体变化 |
| 4.4.3 HISL小鼠感染H1N1病毒后T细胞亚群的表达情况 |
| 4.4.4 HISL小鼠感染H1N1病毒后病毒特异性T细胞的产生 |
| 4.4.5 HISL小鼠感染H1N1病毒后血清特异性抗体的产生 |
| 4.4.6 HISL小鼠感染H1N1病毒后HL基因组测序分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 流感病毒预先接种对人免疫系统-人肺小鼠产生保护作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 材料和试剂 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 甲型流感病毒的扩增及TCID50 测定 |
| 5.3.2 人源化小鼠模型建立 |
| 5.3.3 人免疫系统-人肺小鼠的建立 |
| 5.3.4 甲型流感病毒经鼻接种 |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 单次H1N1病毒接种未能给予人免疫系统-人肺小鼠良好的保护作用 |
| 5.4.2 多次H1N1病毒接种可延长致死剂量H1N1病毒经鼻接种小鼠的生存时间 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）B淋巴细胞在功能性治愈的慢性乙型肝炎患者的免疫学特征（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性乙型肝炎的免疫治疗现状和机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）胃癌患者血浆外泌体PD-L1介导肿瘤细胞免疫逃逸机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 血浆外泌体纯化、鉴定及血浆外泌体PD-L1定量检测 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 血浆样品及临床相关信息 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 外泌体分离纯化 |
| 2.2 外泌体结构观察 |
| 2.3 样品粒径分析 |
| 2.4 外泌体表面抗原标记及免疫荧光观察 |
| 2.5 ePD-L1定量检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 外泌体提取鉴定 |
| 3.2 外泌体免疫荧光观察 |
| 3.3 ePD-L1定量检测及其与疾病进展的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 胃癌患者血浆外泌体PD-L1对CD8~+T细胞的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 血液样品及临床相关信息 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 T淋巴细胞培养基配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 外周血单个核细胞(PBMC)的分离 |
| 2.2 悬浮细胞培养的基本操作 |
| 2.3 T细胞与表达PD-L1的外泌体共孵育 |
| 3 结果 |
| 3.1 施加胃癌患者血浆外泌体PD-L1后CD8~+T细胞受到的影响 |
| 3.2 施加不同量的外泌体PD-L1后CD8~+T细胞活化程度的不同 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体来源PD-L1对肿瘤细胞免疫逃逸影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）免疫蛋白酶体抑制剂诱导ITP免疫耐受机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分：免疫蛋白酶体抑制剂对ITP患者的单核/巨噬系统及GD4+T细胞的机制研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分：免疫蛋白酶体抑制剂对ITP被动模型的治疗作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
| 外文论文Ⅰ-已发表 |
| 外文论文Ⅱ |
（8）五虎汤通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节RSV诱导哮喘小鼠DCs自噬对T细胞增殖活化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 五虎汤通过调节DCs自噬对RSV诱发哮喘小鼠Th17 细胞炎性因子分泌的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 五虎汤药液的制备及指纹图谱质量控制 |
| 2.2 RSV病毒滴度的测定 |
| 2.3 RSV诱发哮喘小鼠模型建立 |
| 2.4 气道反应性检测验证造模是否成功 |
| 2.5 动物分组及给药 |
| 2.6 酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠肺泡灌洗液中IL-17A和IL-17F的水平 |
| 2.7 小鼠肺组织HE、PAS、Masson病理染色 |
| 2.8 透射电镜观察各组小鼠肺组织自噬体 |
| 2.9 CD11c磁珠分选法分离肺组织树突细胞 |
| 2.10 免疫蛋白印迹法(Western Blot)检测树突细胞中自噬相关蛋白的表达 |
| 2.11 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 五虎汤质谱分析结果 |
| 3.2 两组小鼠气道阻力比较 |
| 3.3 各组小鼠肺泡灌洗液中IL-17A和 IL-17F的表达水平 |
| 3.4 各组小鼠肺组织HE、PAS、Masson染色情况 |
| 3.5 各组小鼠肺组织电镜检查情况比较 |
| 3.6 各组小鼠自噬相关蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 第二章 五虎汤含药血清通过调节RSV诱导的DCs自噬对T细胞增殖活化的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 五虎汤含药血清与空白血清的制备 |
| 2.3 含药血清的质谱分析 |
| 2.4 DCs的分离培养鉴定 |
| 2.5 CD4+T细胞的分选 |
| 2.6 CD4+T细胞CFSE标记 |
| 2.7 含药血清浓度筛选 |
| 2.8 DCs与 CD4+T细胞共培养,分组药物干预 |
| 2.9 CD4-PE/CD3-APC抗体染色后流式细胞术检测 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 五虎汤含药血清质谱分析 |
| 3.2 DCs的分离诱导培养 |
| 3.3 DCs的鉴定 |
| 3.4 CD4+T淋巴细胞的分选 |
| 3.5 含药血清浓度的筛选 |
| 3.6 DCs与T细胞共培养 |
| 3.7 流式细胞术检测各组CD4+T细胞与CD69 表达 |
| 3.8 各组CD4+T淋巴细胞CFSE染色流式结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 五虎汤对RSV诱发哮喘小鼠DCs自噬中PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 RSV诱发哮喘小鼠模型建立及气道反应性测定 |
| 2.2 动物分组及给药 |
| 2.3 CD11c磁珠分选法分离肺组织树突细胞 |
| 2.4 Western Blot检测各组PI3K/Akt/mTOR信号通路上的蛋白表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 五虎汤含药血清通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对RSV诱导DCs自噬的调控作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 树突状细胞分离、培养及鉴定 |
| 2.1.1 树突状细胞分离及培养 |
| 2.1.2 树突状细胞流式鉴定 |
| 2.2 含药血清的制备与质量控制 |
| 2.3 含药血清浓度的筛选 |
| 2.4 RSV病毒感染树突细胞模型的制备与检测 |
| 2.4.1 RSV感染树突细胞 |
| 2.4.2 OVA-17 肽刺激细胞 |
| 2.4.3 瞬时转染mRFP-eGFP-LC3 质粒 |
| 2.4.4 饥饿培养 |
| 2.4.5 各组细胞加药培养后激光共聚焦观察各组细胞自噬情况 |
| 2.4.6 WesternBlot检测各组PI3K/Akt/mTOR信号通路上的蛋白表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离培养的DCs |
| 3.2 DCs的鉴定结果 |
| 3.3 含药血清浓度的筛选 |
| 3.4 各组细胞激光共聚焦显微镜下自噬发生情况 |
| 3.5 各组细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 参考文献 |
| 综述一 细胞自噬与中医理论关联性探析 |
| 参考文献 |
| 综述二 细胞自噬与哮喘发病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）miR-15a/16-1对NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞生物学活性的影响及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究内容一: miR-15a/16-1对CD4~+ T细胞NKG2D表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 研究内容二: miR-15a/16-1对CD4~+ NKG2D~+T细胞的功能影响及其在结直肠癌发病中的作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述: miR-16参与调控炎症性疾病的研究进展 |
| 1. miR-16的概述 |
| 2. miR-16调控免疫细胞活性参与炎症性疾病的进展 |
| 3. miR-16与炎症性疾病 |
| 4. 小结与展望 |
| 5. 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）玉米赤霉烯酮对小鼠B淋巴细胞免疫功能的影响及TLR4/MAPK在其中发挥的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 上篇 文献综述 |
| 第1章 玉米赤霉烯酮毒性研究进展 |
| 1 玉米赤霉烯酮简介 |
| 2 ZEA的污染状况 |
| 3 ZEA的吸收与代谢途径 |
| 4 ZEA的毒性作用 |
| 4.1 免疫毒性 |
| 4.1.1 ZEA对免疫器官和免疫细胞的影响 |
| 4.1.2 ZEA对细胞因子的影响 |
| 4.2 生殖毒性 |
| 4.3 内分泌毒性 |
| 4.4 致肿瘤毒性 |
| 4.5 细胞毒性 |
| 4.6 遗传毒性 |
| 5 ZEA的防控 |
| 第2章 体液免疫应答与B淋巴细胞的功能 |
| 1 B淋巴细胞介导的体液免疫简介 |
| 2 B淋巴细胞的功能 |
| 2.1 B淋巴细胞的抗原递呈 |
| 2.2 B淋巴细胞的活化 |
| 2.3 B淋巴细胞活化产生的细胞因子 |
| 3 Toll样受体与B淋巴细胞 |
| 3.1 Toll样受体与NFκB |
| 3.2 TLR4信号通路与B淋巴细胞活化 |
| 4 MAPK通路与B淋巴细胞活化 |
| 本研究的目的与意义 |
| 下篇 试验部分 |
| 第3章 ZEA对B淋巴细胞活性及活化的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 溶液与试剂的配制 |
| 2.2 B淋巴细胞的原代培养 |
| 2.2.1 脾脏淋巴细胞的分离培养 |
| 2.2.2 免疫磁珠阴性分选B淋巴细胞 |
| 2.2.3 流式细胞术鉴定B淋巴细胞纯度 |
| 2.3 CCK-8法检测ZEA对小鼠B淋巴细胞体外存活的影响 |
| 2.4 显微镜下观察ZEA对B淋巴细胞活化聚团现象的影响 |
| 2.5 流式细胞术检测ZEA对小鼠B淋巴细胞各期活化标识分子的影响 |
| 2.5.1 检测ZEA对小鼠B淋巴细胞早期活化标识分子CD69的影响 |
| 2.5.2 检测ZEA对小鼠B淋巴细胞中期活化标识分子CD25的影响 |
| 2.5.3 检测ZEA对小鼠B淋巴细胞晚期活化标识分子CD71的影响 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 B淋巴细胞的纯度鉴定 |
| 3.2 ZEA对B淋巴细胞体外相对活力的影响 |
| 3.3 ZEA对小鼠B淋巴细胞体外活化聚团现象的影响 |
| 3.4 ZEA对小鼠B淋巴细胞活化早期标识分子CD69的影响 |
| 3.5 ZEA对小鼠B淋巴细胞活化中期标识分子CD25的影响 |
| 3.6 ZEA对小鼠B淋巴细胞活化晚期标识分子CD71的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 ZEA对B淋巴细胞增殖、分化及吞噬能力的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 主要溶液的配置 |
| 2.2 小鼠B淋巴细胞的提取 |
| 2.3 CFSE法检测ZEA对B淋巴细胞的体外增殖的影响 |
| 2.4 流式细胞术检测ZEA对小鼠B淋巴细胞向浆细胞分化的影响 |
| 2.5 qRT-PCR检测ZEA对小鼠B淋巴细胞分化相关调控基因的影响 |
| 2.5.1 引物设计 |
| 2.5.2 qRT-PCR检测相关基因表达量 |
| 2.6 流式细胞术检测ZEA对小鼠B淋巴细胞吞噬功能的影响 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ZEA对小鼠B淋巴细胞体外增殖影响 |
| 3.2 ZEA对B淋巴细胞分化的影响 |
| 3.3 ZEA对B淋巴细胞促分化基因的影响 |
| 3.4 ZEA对B淋巴细胞抑分化基因的影响 |
| 3.5 ZEA对B淋巴细胞吞噬功能的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第5章 ZEA对调控B淋巴细胞免疫功能相关信号通路TLR4/MAPK的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠原代B淋巴细胞的提取 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.1 蛋白样品的制备 |
| 2.3.2 SDS-PAGE电泳 |
| 2.4 ELISA试剂盒检测细胞因子 |
| 2.4.1 待测上清液的制备 |
| 2.4.2 检测步骤 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ZEA对B淋巴细胞TLR4信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.2 ZEA对B淋巴细胞核转录因子NFκB表达的影响 |
| 3.3 ZEA对B淋巴细胞MAPK通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.3.1 ZEA对B淋巴细胞ERK通路蛋白表达的影响 |
| 3.3.2 ZEA对B淋巴细胞JNK通路蛋白表达的影响 |
| 3.4 Western-blot筛选ERK抑制剂U0126和JNK抑制剂SP600125使用浓度 |
| 3.5 ZEA与U0126联合使用检测B淋巴细胞ERK通路相关蛋白 |
| 3.6 ZEA与SP600125联合使用检测B淋巴细胞JNK通路相关蛋白 |
| 3.7 ZEA与U0126单独或联合使用对小鼠B淋巴细胞细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的影响 |
| 3.8 ZEA与SP600125单独或联合使用对小鼠B淋巴细胞细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
四、CD69与免疫功能的调节（论文参考文献）
- [1]来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究[D]. 耿陈露. 浙江大学, 2021(01)
- [2]基于B细胞表面TLR9水平及移行与B细胞活化的关系研究CpG ODN发挥疫苗佐剂作用的机制[D]. 路文婷. 吉林大学, 2021(01)
- [3]Graves病中MAIT和iNKT的频率、表型及细胞因子分析[D]. 黄欣. 西南医科大学, 2021(01)
- [4]利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答[D]. 王亦心. 吉林大学, 2021(01)
- [5]B淋巴细胞在功能性治愈的慢性乙型肝炎患者的免疫学特征[D]. 李琛. 福建医科大学, 2021(02)
- [6]胃癌患者血浆外泌体PD-L1介导肿瘤细胞免疫逃逸机制的研究[D]. 王晰. 山西医科大学, 2021(01)
- [7]免疫蛋白酶体抑制剂诱导ITP免疫耐受机制研究[D]. 杜圣红. 山东大学, 2021(11)
- [8]五虎汤通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节RSV诱导哮喘小鼠DCs自噬对T细胞增殖活化的影响[D]. 张鑫. 湖南中医药大学, 2021(02)
- [9]miR-15a/16-1对NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞生物学活性的影响及其机制[D]. 朱涛. 扬州大学, 2021(08)
- [10]玉米赤霉烯酮对小鼠B淋巴细胞免疫功能的影响及TLR4/MAPK在其中发挥的作用[D]. 刘双双. 扬州大学, 2021