导读:本文包含了靶蛋白筛选论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:嗜吞噬无形体,Msp2,酵母双杂交,THP-1
靶蛋白筛选论文文献综述
郑炜,马忠臣,张辉,张丽娟,陈创夫[1]（2019）在《嗜吞噬无形体Msp2蛋白与宿主互作靶蛋白筛选及生物信息分析》一文中研究指出目的:筛选与嗜吞噬无形体Msp2蛋白互作的THP-1细胞靶蛋白,有助于理解病原体侵袭宿主的分子机理。方法:PCR获得无形体msp2基因克隆到pGBKT7载体上构建诱饵质粒并转化酵母菌株Y2HGold,营养缺陷培养基及蓝白斑实验验证诱饵质粒是否有自激活、毒性;抽提THP-1总RNA,经反转录、Long-distance PCR、同源重组等构建到pGADT7-Rec载体上并转化酵母菌株Y187,鉴定cDNA文库质量;酵母双杂交筛选与无形体Msp2互作的宿主细胞靶蛋白,生物信息学分析蛋白互作可能导致的信号通路变化。结果:成功构建诱饵质粒;cDNA文库容量达4×106克隆,插入片段大小100-3000 bp,且无污染;酵母双杂交获得宿主靶蛋白7个,分别是NADH脱氢酶(泛醌)1α亚体13(NDUFA13)、锌指蛋白36, C3H样2(ZFP36L2)、核糖体蛋白11(RPL11)、前胸腺素α(PTMA)、C19orf10、组织蛋白酶G(CTSG)、核糖体蛋白S25(RPS25);生物信息学分析,互作的宿主靶蛋白主要参与细胞增殖、细胞凋亡、溶酶体成熟及其它一些信号通路等生物学过程。结论:应用酵母双杂交系统初步筛选出与嗜吞噬细胞无形体表面蛋白Msp2互作的宿主细胞靶蛋白,并利用生物信息学初步分析了其参与的生物学过程,为进一步研究病原菌胞内生存分子机制奠定了基础。(本文来源于《现代生物医学进展》期刊2019年14期）
吴丽梅[2]（2019）在《泛素化降解靶蛋白的PROTAC嵌合体分子筛选及其构效关系分析》一文中研究指出背景:蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimera,PROTAC),利用双功能嵌合体分子同时结合靶蛋白和E3连接酶,使靶蛋白被泛素化标记,从而进入蛋白酶体途径被降解。PROTAC嵌合体分子由叁部分组成:结合靶蛋白的配体、结合E3泛素连接酶的配体、以及两者之间的连接链(linker)。本文分别以CDK4/6和EGFR为靶点合成了一系列化合物,希望从中筛选出能有效降解靶蛋白的PROTAC嵌合体分子,为肿瘤靶向治疗提供候选化合物。方法:以乳腺癌靶向治疗药物CDK4/6高选择性抑制剂Palbociclib为弹头的PROTAC嵌合体分子ZM7、ZM8、ZM9分别以梯度稀释浓度处理乳腺癌细胞或急性淋巴细胞白血病细胞72h,CCK8试剂检测细胞活率;以Western Blot法检测不同给药时间和浓度条件下ZM7、ZM8、ZM9对靶蛋白CDK4和CDK6的降解作用以及CDK4/6所在信号通路中cyclin D、Rb、phospho-Rb蛋白的表达情况。以已上市药物EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)Gefitinib为弹头的PROTAC嵌合体分子ZM3、ZM4、ZM5、ZM6分别以梯度稀释浓度处理非小细胞肺癌(NSCLC)细胞72h,WST-1试剂检测NSCLC细胞活率;以Western Blot法检测不同给药时间和浓度条件下ZM3、ZM4、ZM5、ZM6对靶蛋白EGFR的降解作用。以EGFR别构抑制剂EAI045衍生物为弹头的PROTAC嵌合体分子ZME6、ZME8、ZME11、ZME12分别以梯度稀释浓度处理NSCLC细胞72h,WST-1试剂检测细胞活率;以Western Blot法检测不同给药时间和浓度条件下ZME6、ZME8、ZME11、ZME12对靶蛋白EGFR的降解作用。结果:ZM7、ZM8、ZM9对5种乳腺癌细胞株T-47D、MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231、ZR-75-1以及急性淋巴细胞白血病细胞HAL-01均有增殖抑制作用,且具有浓度依赖性,但对乳腺癌细胞株SK-BR-3没有增殖抑制作用;在本实验给药浓度和时间条件下,ZM7、ZM8、ZM9对乳腺癌细胞株CDK4和CDK6均没有降解作用,但是在HAL-01中ZM8、ZM9可部分降解CDK6。ZM3、ZM4、ZM5、ZM6对NSCLC的Gefitinib耐药株和敏感株均有一定程度的增殖抑制作用,且对敏感株的抑制作用强于耐药株;ZM4、ZM5、ZM6对敏感株PC-9和HCC827中的EGFR有降解,且呈剂量依赖性,而对耐药株PC-9-IR、H1975以及野生型细胞株A549的EGFR并没有降解作用。ZME6、ZME8、ZME11对NSCLC细胞没有增殖抑制作用,但是ZME12在较高浓度时对细胞有增殖抑制作用;ZME6、ZME8、ZME11在5h时可显着降解EGFR。结论:ZM7、ZM8、ZM9对乳腺癌细胞CDK4和CDK6均没有降解作用,但是在HAL-01中ZM8、ZM9可部分降解CDK6;ZM4、ZM5、ZM6对敏感株PC-9和HCC827中的EGFR有降解,而对耐药株PC-9-IR、H1975以及野生型细胞株A549的EGFR并没有降解作用;ZME6、ZME8、ZME11在5h时可显着降解EGFR。(本文来源于《浙江省医学科学院》期刊2019-05-01）
党晓雪[3]（2019）在《基于分子模拟方法的甾体类化合物靶蛋白筛选研究》一文中研究指出甾体是一类生物界中广泛存在的,参与调节生物体各种生命活动的化合物,具有广泛的应用价值。目前对甾体功能的研究已深入到分子层面,但仍有很多问题亟待解决,如甾体分子生物活性的分子机制,甾体药物的副作用与多效用等。要深入研究以上问题,急需确定甾体的活性靶标。通过传统的实验方法系统地筛选甾体靶标会耗费大量的时间和财力,利用分子模拟方法虚拟筛选出潜在的候选靶标可以降低寻靶的盲目性,缩小用于分子实验的候选蛋白范围,提高筛选效率。尽管目前已有一些在线小分子靶标预测工具,但由于精度低、周期长、假阳性高等原因,预测结果不能提供有价值的参考。为了更精确地预测甾体靶标,本研究构建了一种利用反向分子对接进行甾体靶标预测的特异性靶标库,并以两类甾体分子为例进行预测精度评估和靶标预测研究,主要结果如下:(1)构建了利用反向对接方法进行甾体靶标预测的特异性靶标库,可用于所有甾体分子靶标的虚拟筛选。分别利用配体相似性及生物学过程从DrugBank和KEGG甾体通路中搜集筛选得到潜在靶标晶体共3275个,并将晶体结构根据蛋白种类聚为196类,提高了预测结果排序的有效性。对蛋白库蛋白进行功能分析发现其主要为结合蛋白及催化作用的酶。对每一类蛋白的结构冗余性分析发现,其中60类蛋白包含的晶体数多于5个,这些冗余的晶体构象在后续反向对接预测中变相考虑了蛋白的柔性。(2)利用反向分子对接方法,从靶标库中预测甘氨胆酸的靶标,基于预测结果检验靶标库的覆盖度和预测精度。甘氨胆酸已知靶标有7个,其中4个有晶体结构的靶标能够被成功预测,且排序均位于前40位;3个靶标由于无晶体结构及同源序列,暂时无法预测。而在线预测工具idTarget仅预测出了其中两个靶标,且排序十分靠后(615;2583)。这一结果表明,本靶标库的靶标覆盖度及预测精度较好。其次,通过结合模式分析,发现甘氨胆酸与其中叁个靶标(FXR,VDR,GT)在活性位点与原配体占据的空腔位置一致,且参与氢键形成的氨基酸残基相同。甘氨胆酸分子另一个靶标(PXR)的结合模式与原配体表现出差异,为了进一步确认这种结合模式的动态稳定性,动力学分析发现其均方根差(RMSD)稳定在2埃以内,说明结合过程中复合物构象较为稳定。(3)在利用本靶标库预测24-表油菜素的潜在靶标时,植物中的已知靶标BRI1-BAK复合物在预测结果中排序第一,再次说明预测结果较好。对于其他预测出的前10%的靶标,根据疾病相关性选出了5类蛋白做进一步的结合模式比较分析,并选择了结合力较强的两类蛋白(P450家族和G偶联受体蛋白)中的两个晶体(3swz,4jkv)做动力学模拟进行稳定性分析,发现复合物主链RMSD都稳定在2埃以内,说明复合物构象稳定。此外还发现SMO蛋白的跨膜区域在动态分析中比较保守,但膜两侧的蛋白片段稳定性不同。推测可能与小分子结合过程中的构象诱导变化相关,故SMO蛋白极有可能是24-表油菜素内酯的抗癌靶标。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-05-01）
涂健,张煜,祁克宗[4]（2017）在《非编码小RNA(RyhB)调控禽致病性大肠杆菌生物学表型分析及靶蛋白的筛选》一文中研究指出研究目的:本研究以实验室RyhB缺失株为基础,研究RyhB缺失条件下对细菌的生物学特性的影响,并利用蛋白质组学技术比较野生株与缺失株差异表达的蛋白,筛选出影响APEC毒力等相关特性的相关靶基因,进一步揭示了Ryh B与APEC致病力之间的关系。材料方法:通过非标记定量蛋白质组学技术结合生物学表型实验筛选影响细菌毒力的相关蛋白,找到Ryh B的调控靶点。结果:s RNA-Ryh B缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性影响表明,Ryh B缺失没有影响其生长性能;组织载菌量实验表明,缺失株组织载菌量下降;超显微结构观察实验表明,相比原始株缺失株则没有完整菌毛;生物膜试验结果表明,Ryh B基因缺失后,生物膜的形成能力减弱;环境耐受力实验表明,缺失株对氧化不敏感,热应激增强,耐酸性增强,耐碱性减弱。结合蛋白质组学技术筛选出62个差异同时从筛选得到与酸性耐受力有关的蛋白。在筛选出的差异蛋白的基础上,结合在线预测软件筛选可能直接作用的与生物膜形成有关的靶基因cys E。讨论:Ryh B缺失对细菌耐性耐受力,生物膜形成有一定的影响,其中cys E可能是Ryh B直接的调控靶点。(本文来源于《中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九次全国会员代表大会论文集》期刊2017-07-28）
大德（RAHIM,DAD,BROHI）[5]（2017）在《SUMO-1在牛精子中定位与表达及潜在靶蛋白的初步筛选》一文中研究指出公牛繁殖能力及公牛选育对畜牧行业养牛生产非常重要。因此,对公牛精子发生、精子成熟及精液品质调控机制的研究可以为提高公牛繁殖性能提供重要的理论参考。成熟精子中DNA高度浓缩,导致转录和翻译过程沉默。因此翻译后修饰方式对精子功能包括卵母细胞受精过程中精子获能和顶体反应具有重要调节作用。SUMO化修饰是重要的蛋白质翻译后修饰方式之一,参与调节多种生物学功能。为了初步阐明SUMO化修饰在水牛和奶牛精子成熟过程、获能及顶体反应过程中的可能作用。本课题对水牛和奶牛精子中SUMO-1的亚细胞定位和表达情况进行了研究;并通过免疫蛋白印迹、免疫共沉淀化和质谱法对SUMO-1在精子中潜在的靶蛋白进行了初步鉴定;通过生物信息学方法初步分析了其功能和参与调控途径;通过SUMO化修饰预测靶蛋白软件初步预测了所筛选到蛋白的潜在SUMO-1修饰位点。研究结果如下。(1).免疫荧光方法检测了 SUMO-1在水牛和奶牛精子中的定位和表达。证实SUMO-1的免疫信号主要集中在顶体中。另外,免疫印记结果发现钙离子载体A23187诱导精子发生顶体反应后,SUMO-1表达模式发生变化。精子获能后,130, 37和27 kDa附近SUMO-1结合蛋白条带强度下降,在30, 85和50 kDa附近条带增强。此外,精子获能后诱导发生顶体反应后,37 kDa条带下降,25 kDa以下条带消失。这些结果暗示精子获能和顶体反应过程中精子中SUMO-1介导的SUMO化修饰方式可能发生了变化,这些改变可能与精子获能和顶体反应的调控有关。(2).质谱方法检测了水牛精子中与SUMO-1共价结合蛋白成份。初步鉴定出包括维持精子形态和运动能力的60个蛋白,如松弛素受体和细胞骨架蛋白包括微管、微丝和动力蛋白。其中46个蛋白被SUMO化靶蛋白预测软件预测为SUMO化修饰的靶蛋白。总之,本研究结果发现SUMO-1在水牛和奶牛精子中存在,且在精子获能和顶体反应过程中表达模式改变,为研究SUMO-1在牛精子成熟、获能和顶体反应过程中的SUMO化修饰及其调控作用提供了重要理论参考。质谱法所鉴定的潜在SUMO化修饰蛋白,对理解精子功能维持过程中的SUMO化调控作用和机制提供重要参考,但是未来还需要进一步对这些潜在靶蛋白的SUMO化修饰情况进行深入鉴定和功能分析。(本文来源于《华中农业大学》期刊2017-06-01）
张煜[6]（2017）在《非编码小RNA（RyhB）调控禽致病性大肠杆菌生物学表型分析及靶蛋白的筛选》一文中研究指出禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是一种能引起家禽局部或全身性传染病的细菌,能与很多病毒性疾病和其他细菌性疾病并发。随着世界集约化养鸡行业的发展,大肠杆菌病的发病率和死亡率也逐步升高,给养禽业的发展造成了巨大的损失。在大肠杆菌研究中,人们提出了一种新的基因调节子,即为非编码小RNA(small non-coding regulatory RNA,sRNA),其在转录后可调节基因的表达水平,主要参与的调节途径包括转录翻译调控、铁代谢途径、糖代谢途径、膜蛋白生物合成、群体感应系统以及致病菌的致病力调节等。而RyhB也是小RNA的一种,在细菌致病调控网络中起到关键作用。此外,RyhB除了参与调节铁代谢外,在霍乱弧菌和痢疾志贺氏菌中,还发现RyhB的还能调控细菌动力、化学趋化、生物膜、酸性耐受力、氧化还原甚至毒力基因的表达等。因此,研究RyhB与APEC致病性之间的联系,为防控大肠杆菌病提出实验依据。本研究以实验室RyhB缺失株为基础,研究RyhB缺失条件下对细菌的生物学特性的影响,并利用蛋白质组学技术比较野生株与缺失株差异表达的蛋白,筛选出影响APEC毒力等相关特性的相关靶基因,进一步揭示了RyhB与APEC致病力之间的关系。具体研究内容和结果如下:1、sRNA-RyhB对禽致病性大肠杆菌生物学特性影响本实验分别从生长曲线实验、组织载菌量实验、菌体超显微结构观察实验、生物被膜形成能力检测实验、LPS完整性实验、环境耐受力检测实验等来研究禽致病性大肠杆菌RyhB对细菌的生物学特性影响。生长曲线实验结果表明,RyhB没有影响其生长性能;组织载菌量实验表明,注入△RyhB肝脏组织载菌量相比野生株的肝脏组织载菌量降低了6.91倍;超显微结构观察实验表明,同样的生长条件下,亲本菌AE17有完整的菌毛,而缺失株则没有完整菌毛;生物膜试验结果表明,RyhB基因缺失后,生物膜的形成能力减弱,回复株有所回复,但并没有回到野生株生物膜形成能力;LPS完整性实验结果表明RyhB缺失没有影响有LPS的完整性;环境耐受力实验表明,缺失株△RyhB对氧化不敏感,热应激增强,耐酸性增强,耐碱性减弱。2、sRNA-RyhB调控禽致病性大肠杆菌靶蛋白的筛选为探索RyhB可能调控的毒力基因。应用蛋白质组学技术,从蛋白水平比较野生株和缺失株之间差异蛋白表达情况。结果显示,与野生株相比,共发现62个差异蛋白。其中Omsc、Galu、Nlpe、Tata、GmhA、proX、inFA、cysE可能是RyhB直接调控的毒力相关基因。通过GO(Gene Ontology)分类结果显示,差异表达蛋白参与的细胞组分包括细胞膜、胞外区、细胞器、核质组成等;分子功能主要表现抗氧化功能、蛋白结合、催化活性、分子功能调节、信号传导、转运蛋白功能等;参与的生物学过程主要包括调控生物调节、运动过程、新陈代谢过程、多细胞生物学过程、应激反应、单一生物体调节过程等。通过实时荧光定量PCR技术检测其中10个差异蛋白基因的转录水平,结果与蛋白质组学一致。3、sRNA-RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力以及影响生物膜形成靶蛋白分析本实验基于蛋白质组学技术,筛选得到与酸性耐受力有关的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术对筛选的差异蛋白基因的转录水平进行检测,其结果与蛋白质组学结果一致。在筛选出的差异蛋白的基础上,结合在线预测软件筛选可能直接作用的与生物膜形成有关的靶蛋白。实验成功构建了pET28a-cysE表达载体,获得可溶性cysE蛋白,用Western Blot检测重组质粒表达产物,在蛋白大小约36kDa处有一条蛋白带,表明表达产物有良好的特异性。以上研究结果表明,RyhB的缺失能影响禽致病性大肠杆菌菌毛的表达并降低肝脏的载菌量、降低生物膜的形成、增强热应激、增强耐酸性、减弱耐碱性。表明RyhB在调控APEC毒力作用中扮演重要角色,并结合蛋白质组学技术筛选出与生物膜形成、酸性耐受力有关的蛋白。为后续研究RyhB调控靶点奠定了一些基础,同时也为进一步研究APEC的致病作用及宿主抗病机制提供一些实验依据。(本文来源于《安徽农业大学》期刊2017-05-01）
余兰[7]（2017）在《慢性肾病相关自身免疫靶蛋白的筛选》一文中研究指出本研究在大鼠双肾缺血再灌注致慢性肾病模型上,运用免疫学、蛋白组学等实验方法试图找到与慢性肾病相关的自身免疫靶抗原。首先(1)利用大鼠慢性肾病模型,在大鼠双侧肾动脉夹闭75min后导致肾脏缺血再灌注损伤。40周后监测发现疾病组出现肾功能损害,第48、52周时蛋白尿(尿蛋白/尿肌酐,g/mmol)水平达(0.94±0.15)、(1.67±0.50),与正常对照组(<0.30)相比有显着差异;免疫荧光检测疾病组肾脏有IgG抗体沉积,HE染色显示疾病组肾发生纤维化改变,提示慢性肾病动物模型建立。(2)提取正常大鼠肾脏总蛋白,以模型大鼠血清为一抗做Elisa和Westen Blot实验,验证大鼠肾脏总蛋白与疾病大鼠血清存在抗原抗体反应。Elisa实验显示疾病大鼠血清与正常大鼠肾脏总蛋白有抗原抗体反应,疾病组(平均OD值为0.5011±0.047)与对照组(平均OD值为0.2370±0.019)相比有显着性差异;疾病组血清为一抗与大鼠肾脏蛋白的Westen Blot实验有免疫印迹条带出现。然后(3)分别提取疾病组和对照组大鼠肾脏总蛋白做免疫共沉淀实验(COIP),用A/G琼脂糖磁珠-兔抗大鼠IgG来捕获肾脏中的抗原抗体复合物,经沉淀、纯化、洗脱、电泳,初步确定只在疾病组显现的37KDa条带为的目标蛋白条带。(4)切取经(3)共沉淀的凝胶电泳分离的目标蛋白做质谱检测分析,筛选出前10个可能性靶蛋白(按照氨基酸序列匹配度排名)。(5)对氨基酸序列匹配度排名前2位的丙种球蛋白IgG2a(氨基酸序列匹配率达到96.3%)和原肌球蛋白3(tropomyosin alpha-3 chain,TPM3)(氨基酸序列匹配率达到76.4%),用抗IgG2a和抗TPM3的商品化已知抗体与正常大鼠总蛋白做一维凝胶Westen Blot实验,确定符合分子量37KDa的目标蛋白为TMP3,而与IgG2a反应的条带为25KDa和50KDa。最后(6)用正常大鼠总蛋白做二维凝胶电泳,分别用已知TMP3抗体、慢性肾病大鼠血清、对照组大鼠血清为一抗做Westen Blot实验,进一步鉴定TMP3为慢性肾病相关的自身免疫靶蛋白;并且疾病肾脏中TMP3的表达水平高于正常肾脏。(7)以Elisa实验检测慢性肾病大鼠血清中抗TMP3及抗Vimentin(Vim)抗体水平,比较二种蛋白在慢性肾病中的免疫原性强弱。实验显示疾病组大鼠抗TMP3和抗Vim抗体都呈阳性反应,但疾病组TMP3抗体水平高于对照组(P(27)0.05),而疾病组Vim抗体水平与对照组无显着性差异(P>0.05)。本研究在大鼠双肾缺血再灌注致慢性肾病模型上,首次筛选到与慢性肾病相关的自身免疫靶蛋白TMP3,其具有较强的免疫原性和慢性肾病相关性。研究结果对于慢性肾病的诊断和治疗具有积极意义。(本文来源于《武汉轻工大学》期刊2017-04-01）
叶竞阳,王建云,熊小波,陈大松,谢福莉[8]（2016）在《紫云英类受体蛋白激酶Nip43靶蛋白的筛选与初步鉴定》一文中研究指出以紫云英类受体蛋白激酶Nip43的S-TKs结构域构建诱饵载体,通过酵母双杂交技术,筛选获得17个候选的阳性克隆。经过测序分析和Blast比对,最终确定了1个互作蛋白EPN。EPN蛋白是网格蛋白聚合反应中的配体蛋白,可调控网格蛋白的聚合反应。通过实验验证显示,靶蛋白EPN与Nip43蛋白互作最强的区域为ENTH/ANTH结构域。Real-time q PCR检测表明,epn基因参与了根瘤菌早期结瘤过程。(本文来源于《华中农业大学学报》期刊2016年03期）
戴梦红,涂名,邵羊阳,王旭,刘振利[9]（2015）在《喹赛多作用靶蛋白的筛选与鉴定》一文中研究指出【目的】筛选和鉴定喹赛多促生长作用的靶蛋白,分析靶蛋白的功能,并研究与靶蛋白相关基因的表达变化,以阐明喹赛多可能的促生长作用机制。【方法】在保留喹赛多母环结构的基础上,将其改造成为喹恶啉-2-甲醛-1,4-二氧,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测L-02细胞中EGF mRNA的表达水平,以验证结构改造物的生物活性。将喹恶啉-2-甲醛-1,4-二氧与富含氨基的树脂基质ToyopearlAF-Amino-650M偶联,并利用高效液相色谱(HPLC)检测偶联效率。将固定化配体喹恶啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质与L-02细胞各亚细胞组分蛋白裂解液分别进行连续亲和层析(SAC)实验,通过生物质谱技术鉴定差异蛋白,并利用WesternBlot技术验证质谱结果的可靠性。利用RT-qPCR方法检测喹赛多孵育L02细胞后hnRNPA2/B1 mRNA、原癌基因c-mycmRNA、细胞增殖抗原Ki-67蛋白的基因mki-67mRNA及细胞周期基因p21、ccnd2mRNA的表达变化。【结果】与喹赛多作用类似,2μM喹恶啉-2-甲醛-1,4-二氧孵育L-02细胞1 h后,即可显着(p<0.05)上调EGFmRNA的表达水平,而且将喹恶啉-2-甲醛-1,4-二氧作为配体与树脂基质进行偶联的效率能够达到75%以上。通过偶联得到的固定化配体捕获到5个差异蛋白,并成功鉴定3个,分别是核内不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)、核内不均一核糖核蛋白U(hnRNP U)以及核内不均一核糖核蛋白H(hnRNP H),均为细胞核蛋白。Western Blot结果显示,随着蛋白裂解液与固定化配体孵育次数的增加,hnRNP A2/B1蛋白丰度逐渐减小,因此说明hnRNP A2/B1蛋白是喹恶啉-2-甲醛-1,4-二氧的特异性结合蛋白。2μM喹赛多孵育L-02细胞1 h后,hnRNPA2/B1与mki-67基因分别出现显着性(p<0.05)下调与上调表达。10μM喹赛多作用细胞0.5 h后即可检测到mki-67 mRNA的表达水平上调显着(p<0.05),但是细胞周期蛋白D2相关基因ccnd2 mRNA在1 h时出现显着性(p<0.05)上调表达。因此我们推测喹赛多与hnRNP A2/B1蛋白结合后,通过调控细胞增殖与细胞周期等相关基因的表达,促进细胞生长。【结论】喹赛多能进入细胞核内与靶蛋白hnRNPA2/B1结合,调节下游基因的表达,从而促进细胞生长。(本文来源于《中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十叁次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会论文集》期刊2015-10-20）
冯晓辉[10]（2015）在《冷诱导RNA结合蛋白在H1N1流感病毒复制中的作用及其靶蛋白的筛选》一文中研究指出冷诱导RNA结合蛋白(Cirbp)是在哺乳动物体内鉴定的首个与冷应激相关的蛋白,广泛表达于多种组织与细胞中,在脊椎动物间高度保守。在多种应激条件下Cirbp表达升高,并发挥细胞保护作用。此外,Cirbp在胚胎发育,神经发育,生物钟调节,肿瘤发生等过程中发挥重要的调节作用;近期研究表明Cirbp介导了多种病理条件下的炎症反应,如LPS刺激,脑缺血性休克,脓毒血症,酒精刺激等。本实验室前期研究结果表明,H1N1 PR-8流感病毒感染SPF小鼠后,各组织器官中Cirbp在mRNA和蛋白水平上都有不同程度的升高;过表达的Cirbp能通过上调NF-Kappa B信号通路显着促进H1N1甲型流感病毒的复制,但Cirbp对病毒复制过程的影响还不清楚。为了进一步探讨Cirbp在病毒复制过程中的作用及机制,筛选Cirbp相互作用的靶蛋白,我们进行了以下研究,主要取得了以下成果:1 H1N1流感病毒感染细胞后Cirbp表达升高并发生核质穿梭为了搞清楚Cirbp在H1N1感染的细胞内的表达规律,本试验将H1N1流感病毒以MOI=1分别接种叁种细胞,其中BHK-21(叙利亚仓鼠肾细胞),和MH-S(小鼠肺泡巨噬细胞)接种人A/Puerto Rico/8/1934 H1N1,PUVEC(猪血管内皮细胞)接种猪A/Swine/GD/2/12 H1N1。分别于感染后0 h,4 h,8 h,16 h,24 h取样,用免疫组化法检测各细胞各时间点Cirbp的表达情况并用IPP6.0软件进行半定量分析。结果显示:感染PR-8 H1N1甲型流感病毒后8 h~24 h,BHK-21细胞中Cirbp的表达水平升高,达到了差异显着水平;感染PR-8 H1N1甲型流感后4 h~24 h,MH-S细胞中Cirbp的表达水平显着升高;感染猪H1N1流感病毒后8 h~24 h,PUVEC细胞中Cirbp的表达水平显着升高。为了探讨H1N1流感病毒感染下Cirbp在细胞内的亚定位,本试验将H1N1流感病毒以MOI=1感染BHK-21细胞,分别在感染后2 h,4 h,6 h,8 h对样品进行间接免疫荧光染色,并在激光共聚焦显微镜下观察结果。结果显示,H1N1流感病毒感染后2 h,Cirbp定位于细胞核与细胞浆中;感染后4 h Cirbp主要定位于细胞核中;感染后6 h Cirbp定位于细胞核与细胞浆中;感染后8 h,Cirbp主要定位于细胞核中。鉴于Cirbp在生理条件下存在于细胞核中,因此此结果表明在h1n1病毒感染条件下,cirbp可反复穿梭于细胞核和细胞浆之间。上述结果表明,h1n1流感病毒感染情况下,细胞中cirbp表达上调,并且发生了核质穿梭,为进一步研究cirbp在流感病毒复制过程中的最用奠定了基础。2敲低cirbp降低了h1n1流感病毒mrna的稳定性从而抑制病毒的复制为了证实cirbp对h1n1病毒mrna稳定性、rna合成以及蛋白合成的影响,本试验用real-timepcr方法检测了敲低cirbp的bhk21细胞(cirbp-bhk-21)感染h1n1病毒(moi=1)后病毒m和np基因mrna的半衰期,结果表明,敲低cirbp后h1n1病毒np基因和m基因mrna的相对半衰期分别约为7.5h和8h,对照组中m基因和np基因mrna的相对半衰期都超过了12h;同时用real-timepcr分析了h1n1流感病毒感染(moi=1)后3h,9h,15h,21h敲低cirbp对病毒m基因mrna合成的影响,结果显示,敲低cirbp显着(p<0.05)抑制了h1n1病毒m基因mrna的合成,试验组分别是对照组的21.3%,18.6%,12.4%,7.6%,感染后15h和21h,其抑制作用达到了极显着(p<0.01)水平;用real-timepcr分析了h1n1流感病毒感染(moi=1)后8h敲低cirbp对病毒m和np基因mrna,crna,vrna合成的影响,结果显示,敲低cirbp极显着(p<0.01)抑制了病毒m基因crna和vrna1、vrna2的合成,试验组分别是对照组的16.9%、5.3%、11.3%;敲低cirbp极显着(p<0.01)抑制了病毒np基因crna和vrna1、vrna2的合成,试验组分别是对照组的5.1%、2.2%、2.6%。进一步用间接免疫荧光技术分析了感染h1n1(moi=1)后3h和6h敲低cirbp对病毒np蛋白合成的影响,结果显示敲低cirbp抑制了病毒np蛋白的合成。最后在bhk-21和cirbp-bhk-21细胞上测定了h1n1病毒的tcid50效价。检测结果显示敲低cirbp后h1n1的tcid50效价显着高于正常bhk-21细胞的tcid50效价,试验组为对照组的57.54倍。上述结果表明,敲低cirbp降低了流感病毒np和m基因mrna的稳定性,进而抑制了病毒蛋白的合成,并影响了病毒crna和vrna的合成,最终抑制病毒的复制。分析上述结果表明敲低cirbp通过降低病毒mrna的稳定性抑制病毒的复制。本试验首次证实cirbp通过影响病毒mrna稳定性来影响病毒复制,丰富了机体因子与流感病毒互作的网络,为深入研究流感病毒的复制机理提供了资料。3过表达cirbp提高了h1n1病毒的复制效率cirbp在病毒感染情况下表达升高,为了探讨cirbp过表达对病毒复制的影响,本试验分别在bhk-21对照细胞和过表达cirbp细胞(cirbp+bhk-21细胞)上同时接种moi为0.001,0.01,2的h1n1病毒;分别在感染后3h,8h,16h,24h提取总rna,用荧光定量pcr检测h1n1m基因mrna的绝对表达量。结果显示,moi=0.001时,感染后3h,8h,16h,24h试验组m基因mrna的绝对表达量分别是对照组的1.28,30.78,79.05,26.89倍;moi=0.01时,试验组分别是对照组的0.85,26.95,83.84,47.88倍;moi=2时,试验组分别是对照组的4.07,6.46,5.01,3.98倍。结果表明过表达cirbp提高了h1n1病毒的复制效率,moi越低时,过表达cirbp使病毒复制效率的提高越明显。4过表达cirbp促进了h1n1病毒vrnp的出核转运cirbp在h1n1病毒感染情况下穿梭于细胞核和细胞浆之间,为了探讨cirbp在h1n1病毒转运过程中的作用,本试验利用间接免疫荧光技术研究了cirbp过表达对病毒粘附,穿入,入核转运和出核转运的影响。在研究cirbp过表达对病毒粘附和穿入时,以moi=50的感染量分别接种于试验组和对照组,以病毒感作后1h的时间点为0h,0h为病毒粘附和穿入的最佳时间,在此时间点固定样本,并进行间接免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察,结果显示:感染后0h试验组和对照组细胞膜和细胞质内的病毒颗粒无明显差异,表明cirbp过表达对h1n1病毒的粘附和穿入无明显影响。研究对vrnp入核转运和出核转运时感染量为moi=1。分别在4h,6h,8h固定样本,并进行间接免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察,结果显示:感染后4h,少量病毒vrnp已经由细胞浆进入细胞核中,且试验组和对照组无差异;感染后6h,病毒vrnp依然存在于细胞浆和细胞核中,且试验组和对照组无差异;感染后8h,试验组病毒vrnp完全由细胞核转运至细胞浆中,而对照组病毒vrnp正在从细胞核向细胞浆内转运,因此此结果表明过表达cirbp促进了病毒vrnp的出核转运。上述结果表明,过表达cirbp促进了病毒vrnp的出核转运,而对其它过程无明显影响。为深入研究流感病毒vrnp出核转运的机制提供了线索。5h1n1流感病毒感染条件下cirbp靶蛋白的筛选与初步验证为了筛选H1N1病毒感染情况下Cirbp的靶蛋白,本试验利用免疫共沉淀(Co-IP)结合质谱的方法,在病毒感染BHK-21细胞24h后,对Cirbp结合的靶蛋白进行了筛选,结果共沉淀下来了29种Cirbp的候选靶蛋白,其中27种为宿主靶蛋白,2种为病毒靶蛋白;Pathway注释结果显示候选的宿主靶蛋白主要参与了核酸代谢和蛋白质翻译信号通路,神经调节相关信号通路,感染与免疫相关的信号通路。27种候选靶蛋白中质谱得分前5的蛋白,分别为Hsp90,hnRNP R,D1Pas1,Ddx17,Cttn,质谱得分分别为1122.72,381.43,230.4,186.49,185.49。其中Hsp90和Ddx17与流感病毒的复制密切相关。Hsp90的质谱得分最高并在流感病毒复制过程中发挥重要的作用,因此我们进一步用间接免疫荧光验证Hsp90与Cirbp发生了共定位,表明Hsp90与Cirbp至少是以复合体的形式发生了结合。Hsp90与Cirbp是否直接物理结合还需要进一步的试验验证。此外,western-blot结果显示过表达Cirbp上调了Hsp90蛋白的表达,表明Cirbp对Hsp90具有调节作用。2种候选的病毒靶蛋白中,NP的质谱得分最高,为108.68。流感病毒NP蛋白在复制过程中发挥重要的作用,它与病毒RNA,其他病毒蛋白及宿主细胞的某些大分子相互作用,影响病毒的转录、复制、装配及转运功能。进一步用间接免疫荧光验证NP与Cirbp发生了共定位,表明NP与Cirbp至少以复合体的形式发生了结合。此结果为进一步研究Cirbp与H1N1互作的分子机制提供了线索。(本文来源于《西南民族大学》期刊2015-05-05）
靶蛋白筛选论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景:蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimera,PROTAC),利用双功能嵌合体分子同时结合靶蛋白和E3连接酶,使靶蛋白被泛素化标记,从而进入蛋白酶体途径被降解。PROTAC嵌合体分子由叁部分组成:结合靶蛋白的配体、结合E3泛素连接酶的配体、以及两者之间的连接链(linker)。本文分别以CDK4/6和EGFR为靶点合成了一系列化合物,希望从中筛选出能有效降解靶蛋白的PROTAC嵌合体分子,为肿瘤靶向治疗提供候选化合物。方法:以乳腺癌靶向治疗药物CDK4/6高选择性抑制剂Palbociclib为弹头的PROTAC嵌合体分子ZM7、ZM8、ZM9分别以梯度稀释浓度处理乳腺癌细胞或急性淋巴细胞白血病细胞72h,CCK8试剂检测细胞活率;以Western Blot法检测不同给药时间和浓度条件下ZM7、ZM8、ZM9对靶蛋白CDK4和CDK6的降解作用以及CDK4/6所在信号通路中cyclin D、Rb、phospho-Rb蛋白的表达情况。以已上市药物EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)Gefitinib为弹头的PROTAC嵌合体分子ZM3、ZM4、ZM5、ZM6分别以梯度稀释浓度处理非小细胞肺癌(NSCLC)细胞72h,WST-1试剂检测NSCLC细胞活率;以Western Blot法检测不同给药时间和浓度条件下ZM3、ZM4、ZM5、ZM6对靶蛋白EGFR的降解作用。以EGFR别构抑制剂EAI045衍生物为弹头的PROTAC嵌合体分子ZME6、ZME8、ZME11、ZME12分别以梯度稀释浓度处理NSCLC细胞72h,WST-1试剂检测细胞活率;以Western Blot法检测不同给药时间和浓度条件下ZME6、ZME8、ZME11、ZME12对靶蛋白EGFR的降解作用。结果:ZM7、ZM8、ZM9对5种乳腺癌细胞株T-47D、MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231、ZR-75-1以及急性淋巴细胞白血病细胞HAL-01均有增殖抑制作用,且具有浓度依赖性,但对乳腺癌细胞株SK-BR-3没有增殖抑制作用;在本实验给药浓度和时间条件下,ZM7、ZM8、ZM9对乳腺癌细胞株CDK4和CDK6均没有降解作用,但是在HAL-01中ZM8、ZM9可部分降解CDK6。ZM3、ZM4、ZM5、ZM6对NSCLC的Gefitinib耐药株和敏感株均有一定程度的增殖抑制作用,且对敏感株的抑制作用强于耐药株;ZM4、ZM5、ZM6对敏感株PC-9和HCC827中的EGFR有降解,且呈剂量依赖性,而对耐药株PC-9-IR、H1975以及野生型细胞株A549的EGFR并没有降解作用。ZME6、ZME8、ZME11对NSCLC细胞没有增殖抑制作用,但是ZME12在较高浓度时对细胞有增殖抑制作用;ZME6、ZME8、ZME11在5h时可显着降解EGFR。结论:ZM7、ZM8、ZM9对乳腺癌细胞CDK4和CDK6均没有降解作用,但是在HAL-01中ZM8、ZM9可部分降解CDK6;ZM4、ZM5、ZM6对敏感株PC-9和HCC827中的EGFR有降解,而对耐药株PC-9-IR、H1975以及野生型细胞株A549的EGFR并没有降解作用;ZME6、ZME8、ZME11在5h时可显着降解EGFR。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
靶蛋白筛选论文参考文献
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[4].涂健,张煜,祁克宗.非编码小RNA(RyhB)调控禽致病性大肠杆菌生物学表型分析及靶蛋白的筛选[C].中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九次全国会员代表大会论文集.2017
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[9].戴梦红,涂名,邵羊阳,王旭,刘振利.喹赛多作用靶蛋白的筛选与鉴定[C].中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十叁次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会论文集.2015
[10].冯晓辉.冷诱导RNA结合蛋白在H1N1流感病毒复制中的作用及其靶蛋白的筛选[D].西南民族大学.2015