多糖单加氧酶的克隆表达和性质研究及发酵条件优化

论文摘要

溶解性多糖单加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO）是一类在电子供体的存在下能够裂解结晶多糖（如纤维素或几丁质）的铜金属依赖酶;协同纤维素酶作用,能够大幅度提高纤维素酶的水解效率,具有重要的经济价值和应用前景。1.从NCBI数据库中筛选出Talaromyces atroroseus IBT 11181菌株的LPMO基因序列,送公司成功合成出编码LPMO的基因片段。选用EcoR1和Hind111为酶切位点将该基因连接到pET-28a（+）载体上,构建重组表达载体。酶学性质分析表明:该LPMO的最适反应pH是5.0,最适反应温度是50℃。2.根据测得的酶学条件为基础,研究了重组菌的发酵条件。培养基条件优化方面,最适碳源和氮源分别为葡萄糖和蛋白胨,其最适浓度都是10g/L,最适磷酸盐添加量为60 mmol/L,最适Mg2+浓度为0.25 g/L;培养环境优化部分,培养液最适接种量为2%,250 mL摇瓶中最适装液量为40 mL;诱导剂条件优化部分,诱导该LPMO表达的最适诱导温度为16℃,IPTG浓度为0.08 mmol/L。最适条件下协同相同用量的纤维素酶降解纤维素时,比单一纤维素酶的水解产物还原性糖量提高60%。

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致谢

摘要

Abstract

英文缩写词表

文献综述

1 纤维素酶简述

1.1 纤维素与纤维素酶

1.2 纤维素酶的生产方法

1.3 纤维素酶应用

2 多糖单加氧酶研究进展

2.1 多糖单加氧酶的研究过程

2.2 多糖单加氧酶的分类

3 AA9家族多糖单加氧酶的结构与功能

3.1 AA9家族多糖单加氧酶的结构

3.2 AA9家族多糖单加氧酶的催化机制

3.3 AA9家族蛋白的来源与底物多样性

4 蛋白质翻译后修饰

4.1 蛋白翻译后修饰

4.2 糖基化修饰

1 引言

1.1 选题意义

1.2 研究目的

1.3 技术路线

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

2.1.2 实验主要试剂及仪器

2.1.3 实验主要试剂的配置

2.2 LPMO基因的合成与序列分析

2.2.1 目的基因的合成

2.2.2 质粒提取与感受态制备

2.2.3 重组多糖单加氧酶的诱导表达及纯化

2.2.4 蛋白与葡萄糖标准曲线的测定

2.2.5 重组多糖单加氧酶的酶学性质

2.2.6 氧化产物的TLC分析

2.2.7 重组大肠杆菌表达多糖单加氧酶培养条件的初步研究

3 实验结果与分析

3.1 LPMO蛋白三维结构预测

3.2 LPMO基因的扩增

3.3 重组表达菌株BL21（DE3）-pET28a-LPMO的构建

3.4 LPMO基因的测序

3.5 重组菌BL21（DE3）-pET28a-LPMO的表达与纯化

3.6 蛋白与葡萄糖标准曲线

3.7 重组多糖单加氧酶的酶学性质

3.7.1 pH对酶活力的影响

3.7.2 温度对酶活力的影响

3.7.3 不同还原剂对LPMO酶活的影响

3.7.4 最适条件下LPMO与纤维素酶的协同效果

3.7.5 酶解产物的TLC分析

3.8 多糖单加氧酶培养条件的初步研究

3.8.1 重组菌在种子瓶中的生长曲线

3.8.2 重组菌培养基条件的优化

3.8.3 培养环境条件的优化

3.8.4 诱导条件的优化

4 讨论

4.1 糖基化与协同作用

4.2 小结

4.3 展望

5 结论

参考文献

个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张泽亚

导师: 薛挺

关键词: 多糖单加氧酶,氧化酶,酶学性质,协同效应,发酵条件

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,一般化学工业

单位: 安徽农业大学

分类号: Q55;TQ920.1

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000239

总页数: 67

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