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禽多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及免疫效果的研究

2020-12-08阅读(275)

禽多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及免疫效果的研究

论文摘要

禽多杀性巴氏杆菌病又名禽霍乱（Fowl Cholera）,是由禽多杀性巴氏杆菌（Avian Pasteurella multocida）是引起的出血性败血症,通常以急性禽霍乱为主。临床症状早期可能不明显,直到感染晚期才表现出精神抑郁、羽毛蓬松、发烧、厌食、口腔有粘液分泌物、腹泻和呼吸急促,最后发生衰竭,猝死,极大的危害家禽养殖行业的发展。当前,预防禽Fowl Cholera的方法主要应用抗生素、灭活苗、亚单位疫苗和弱毒苗。抗生素的滥用导致大量耐药菌产生,现有疫苗免疫效果不理想,因此研发出一种具有高免疫原性疫疫苗对家禽养殖行业有重要意义。菌影是由细菌细胞内容物外流,细菌内部形成空洞,外部形态和抗原决定簇保持完整,具有较好免疫原性的细菌空壳。本试验通过PCR扩增噬菌体裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN,采用融合PCR以15个柔性氨基酸将裂解基因串联起来形成E-15aa-SN（ES）,再克隆到温敏质粒PBV220,得到温敏裂解质粒PBV-E和PBV-ES。以PBV-ES为模板,PCR扩增温敏裂解片段,克隆到大肠杆菌—巴氏杆菌穿梭质粒中,得到温敏裂解穿梭质粒pBA1100-DLS-E和pBA1100-DLS-ES。通过电转化的方法,将温敏裂解穿梭质粒转化到制备好的禽多杀性巴氏杆菌电转感受态细胞中,得到重组菌。经上海生工测序同源性达100%。28℃低温培养重组菌,42℃诱导表达收集菌影。通过测定重组菌诱导生长曲线和活菌计数,双裂解菌影裂解效率最高达到99.9998%,说明成功构建菌影。利用改良Karber法测定禽多杀性巴氏杆菌C48-1的半数致死量LD50是0.523。在重组菌株最优裂解条件下,即单裂解重组菌在升温诱导第3 h收集菌影,双裂解重组菌在升温诱导第2 h收集菌影。以10倍LD50剂量攻毒经过甲醛灭活苗、单裂解菌影苗和双裂解菌影苗免疫2次的60日龄大小的江汉鸡,对照组注射等剂量的PBS溶液。结果显示,攻毒后对照组全部死亡,甲醛灭活苗保护率为70%,单裂解菌影苗保护率为80%,双裂解菌影苗保护率为90%,说明菌影苗对江汉鸡有一定保护作用,且免疫效果比普通甲醛灭活苗好。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 多杀性巴氏杆菌的简介
  •   1.2 多杀性巴氏杆菌的分型
  •   1.3 多杀性巴氏杆菌的流行病学
  •   1.4 多杀性巴氏杆菌的毒力因子
  •     1.4.1 荚膜（Capsule）
  •     1.4.2 脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）
  •     1.4.3 菌毛和黏附素（Fimbriae and adhesins）
  •     1.4.4 外膜蛋白（Outer membrane proteins）
  •     1.4.5 多杀性巴氏杆菌毒素（PMT）
  •     1.4.6 铁调节外膜蛋白（Iron regulated proteins）
  •     1.4.7 唾液酸（Salic）
  •   1.5 多杀性巴氏杆菌的诊断方法
  •     1.5.1 临床诊断
  •     1.5.2 实验室诊断
  •   1.6 多杀性巴氏杆菌的疫苗进展
  •     1.6.1 弱毒活菌苗
  •     1.6.2 禽霍乱灭活菌苗
  •     1.6.3 禽霍乱荚膜亚单位菌苗
  •   1.7 研究的目的与意义和主要内容
  •     1.7.1 研究的目的与意义
  •     1.7.2 研究主要内容
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株和动物
  •     2.1.2 主要设备和仪器
  •     2.1.3 主要试剂耗材
  •     2.1.4 实验试剂配制
  •   2.2 禽多杀性巴氏杆菌重组菌的构建及裂解率的测定
  •     2.2.1 禽多杀性巴氏杆菌C48-1 菌株的复苏
  •     2.2.2 重组温控双基因裂解质粒的构建
  •     2.2.3 重组温控双基因裂解穿梭质粒的构建
  •     2.2.4 禽多杀性巴氏杆菌C48-1 电转感受态细胞的制备
  •     2.2.5 电转裂解穿梭质粒
  •     2.2.6 电击转化重组质粒的筛选和鉴定
  •     2.2.7 重组禽多杀性巴氏杆菌裂解条件确定
  •     2.2.8 重组禽多杀性巴氏杆菌裂解率计算
  •   2.3 禽多杀性巴氏杆菌菌影疫苗免疫保护效果研究
  •     2.3.1 禽多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定
  •     2.3.2 禽多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备
  •     2.3.3 禽多杀性巴氏杆菌甲醛灭活疫苗的制备
  •     2.3.4 疫苗的安全性评价
  •     2.3.5 禽多杀性巴氏杆菌疫苗免疫试验
  • 第三章 试验结果
  •   3.1 目的基因E、ES扩增结果
  •   3.2 重组温控裂解质粒的酶切及PCR鉴定结果
  •   3.3 基因的测序结果
  •   3.4 温敏裂解基因的扩增
  •   3.5 温敏裂解穿梭质粒的酶切鉴定
  •   3.6 电转阳性重组子的鉴定
  •   3.7 重组菌影的生长曲线及活菌计数
  •   3.8 菌影裂解效率测定
  •   3.9 半数致死量LD50 测定结果
  •   3.10 禽多杀性巴氏杆菌疫苗无菌检验
  •   3.11 禽多杀性巴氏杆菌疫苗安全性检验
  •   3.12 禽多杀性巴氏杆菌疫苗攻毒保护试验
  • 第四章 讨论与结论
  •   4.1 重组质粒构建及裂解率测定
  •   4.2 免疫保护效果研究
  •   4.3 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 蔡萌

    导师: 江涛,罗青平

    关键词: 多杀性巴氏杆菌,裂解基因,温敏质粒,菌影疫苗,疫苗效果

    来源: 长江大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 长江大学

    分类号: S852.4

    总页数: 57

    文件大小: 1671K

    下载量: 140

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