杨玲, 申政磊, 佟力, 杨曼, 瞿晓媛[1]2004年在《P27在急、慢性白血病中表达的研究》文中研究表明目的:研究细胞周期蛋白依赖激酶抑制物P27在急性白血病、慢性髓细胞性白血病(AL、CML)患者中的表达,探讨P27在白血病中的作用机制及其临床意义。
申政磊[2]2004年在《P27在急、慢性白血病中表达的研究》文中提出[目的] 研究细胞周期蛋白依赖激酶抑制物P27在急性白血病、慢性髓细胞性白血病(AL、CML)患者中的表达，探讨P27在白血病中的作用机制及其临床意义。 [方法] 应用免疫细胞化学SP法检测43例AL患者、27例CML患者及10例对照P27的表达，并用蛋白印迹(Western-blot)(DAB显色与化学发光显示)法检测其中11例AL患者及10例对照P27的表达，分析P27在白血病中有无异常表达及其表达与病情进展和预后的关系。 [结果] 免疫细胞化学SP法检测43例AL患者P27阳性表达率(18.60％)明显低于对照组(80％)(P＜0.05)。急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞性白血病(AML)患者P27阳性表达率均低于对照组(P＜0.05)。AML患者阳性表达率(22.73％)较低，ALL患者(14.29％)更低，但两者间无明显差异；未缓解组P27阳性表达率较缓解组患者低，但两者间无明显差异。蛋白印迹法也同样提示AL病人P27低表达且有统计学意义。免疫细胞化学SP法检测27例CML患者P27阳性表达率(37.04％)明显低于对照组(80％)(P＜0.05)，但有部分病例强阳性表达。在27例CML患者中，P27阳性表达率在高危、中危、低危叁组中分别为0％、28.57％、44.44％；高一中危组与低危组间有明显差异(P＜0.05)，行Spearman秩相关系数检验提示P27可能与CML病情演变有关。AL蛋白印迹(Western-blot)DAB显色与化学发光显示法比较，化学发光显示较DAB显色法可提高实验敏感性和准确性。 [结论] 本研究显示P27在AL中低表达，但未显示与缓解相关性；在CML中总体上表达也低，但在部分病例中有强表达，而在AL中未发现；通过与危险比率(RR)比较，高一中危组与低危组有显着差异，故认为P27可能与CML预后有关。从而提示P27在白血病中可能有抑癌基因的作用，对白血病患者在监测病情进展、判断预后方面有重要的临床意义;P27在AL和CML表达差异有待进一步证实。
张莹[3]2011年在《c-myc、c-myb基因在白血病骨髓基质细胞中的表达及相关性研究》文中指出目的：了解c-myc和c-myb原癌基因在白血病细胞和白血病骨髓基质细胞(BMSCs)中的表达情况及其相关性,为研究骨髓微环境基质细胞调控造血的分子机制提供坚实的基础。方法：运用流式细胞技术、染色体显带技术、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)综合分析18例正常标本的单个核细胞和46例白血病患者(27例急性白血病(AL)、19例慢性白血病(CL))的白血病细胞及BMSCs.根据细胞免疫表型分析白血病细胞和骨髓基质细胞的膜表面抗原,采用RT-PCR技术半定量分析白血病细胞和BMSCs中原癌基因c-myc、c-myb的表达水平,同时结合染色体显带技术探索c-myc、c-myb基因在不同核型、急慢性白血病以及不同预后组骨髓基质细胞中的表达水平及其相关性。结果：c-myc和c-myb基因在病例组白血病细胞及其BMSCs中均有一定的表达,尤其是在染色体异常的白血病细胞中c-myc、c-myb基因高表达,其均值分别为1.154±0.38和1.03±0.48,与对照组比较均具有统计学差异(P<0.05),在异常染色体骨髓基质细胞中其均值分别为2.08±0.82(P<0.05)和1.46±0.29(P<0.05)。c-myb mRNA表达水平与外周血红细胞计数密切相关(P<0.05),原癌基因c-myc mRNA和c-myb mRNA在白血病细胞和白血病骨髓基质细胞的表达水平无统计学差异,但均与血小板计数具有相关性。在不同预后组中,c-myc mRNA与c-myb mRNA呈线性相关。在白血病细胞及急性组骨髓基质细胞中原癌基因c-myc、c-myb的表达存在正相关。我们率先发现白血病细胞中c-myc的表达量分别与BMSCs中c-myc、c-myb的表达量有相关性。原癌基因表达升高可能促进巨核细胞的生成和红系祖细胞的定向分化,并参与白血病的发生、发展。结论：实验数据证实,c-myc或c-myb原癌基因在白血病中的表达水平与部分临床指标有相关性。降低原癌基因表达水平将可能成为一种治疗方案,它可以减缓白血病细胞的生成。
王忠英[4]2005年在《慢性粒细胞白血病与微卫星不稳定性关系的研究》文中研究说明目的:研究慢性粒细胞白血病(chromc myeloid leukemia,CML)病人8、9和17号染色体5个微卫星位点的不稳定性改变,以发现8、9和17号染色体在所选位点是否存在与CML发生、进展相关的基因改变,并探讨其在CML急性转化过程中的作用。 方法:选取37例CML病人骨髓及口腔黏膜细胞的DNA标本,其中慢性期(chronic phase,CP)27例,加速期(accelerated phase,AP)5例,急变期(blast crisis,BC)5例。在8、9和17号染色体上共选取5个微卫星位点,即8q22上的D8S559、8q24上的D8S555、9q34上的D9S67和17p13上的TP53A1/A2和AFMa127xg9。应用PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染技术,对病人骨髓细胞DNA与自身口腔黏膜细胞DNA进行比较分析,观察电泳产物的微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)包括杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)情况,并与急性粒细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)组(20例)、良性血液病组(20例)及正常对照组(5例)进行对照。 结果:37例CML病人中有21例(56.8%)、共36例次发生MSI,9例(24.3%)发生了两个以上位点的MSI。5个微卫星位点D8S555、D8S559、D9S67、TP53 A1/A2和AFMa127xg9在CML病人的MSI发生率分别为19.0%(7/37)、27.0%(10/37)、10.8%(4/37)、10.8%(4/37)、29.7%(11/37)。在CML的CP、AP、和BC期5个微卫星位点的MSI发生率分别为7.4%(2/27)、40.0%(2/5)、60.0%(3/5);22.2%(6/27)、20.0%(1/5)、60.0%(3/5);14.8%(4/27)、0%(0/5)、0%(0/5);14.8%(4/27)、0%(0/5)、0%(0/5);29.6%(8/27)、40.0%(2/5)、20.0%(1/5)。D8S555位点在CML进展期(AP+BC)病人MSI的发生率明显高于慢性期,差异有显着性(p<0.01),而其余位点MSI的发生率在CML各期之间的差异无显着性(p>0.05)。在17号染色体的AFMa127xg9位点MSI发生率较高,且均为LOH。20例AML病人中有11例(55.0%)、共17例次发生MSI,其中4例(20.0%)发生了两个以上位点的MSI。上述5个位点在AML病人中MSI的发生率分别为25.0%(5/20)、30.0%(6/20)、5.0%(1/20)、5.0%(1/20)、20.0%(4/20)。在CML和AML病人中5位点不稳定性改变的差异无显着性(p>0.05)。良性血液病组和正常对照组均未见异常改变。 结论:CML病人在8号染色体上的微卫星位点D8S555、D8S559和17号染色
李丹[5]2005年在《CD44v6与p27～（kip1）在急性白血病中的表达及意义》文中研究表明目的:CD44是一种由20个外显子编码的穿膜糖蛋白,可通过选择性表达不同的外显子形成多种同源异构体,即CD44s与CD44v。除透明质酸外,CD44还能与多种细胞外基质成分结合,主要包括纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、骨桥蛋白、纤粘连蛋白、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素等,L-选择素及CD44本身也可以作为配体与之结合,CD44所含的外显子决定与它结合的配体类型。CD44具有多种生物学功能,如调节细胞的黏附与增殖、传递生长因子、参与细胞凋亡、介导细胞的运动与转移。CD44s在造血细胞中广泛表达,而CD44v的表达具有高度限制性,与细胞的特殊活动有关,如淋巴细胞活化、细胞恶性转化。小鼠中CD44v的表达与肿瘤细胞的淋巴道转移有关,CD44v的表达可以刺激肿瘤发展。CD44v在造血系统和非造血系统肿瘤中的表达与其不良预后及转移有关,如CD44v在非何杰金氏淋巴瘤外周血细胞中的表达与化疗疗效及肿瘤的进展有关。CD44v6是CD44v的一种,在正常骨髓造血细胞低表达,在非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤等多种恶性血液病的肿瘤细胞中表达增高,与肿瘤的发展有关。急性白血病中CD44v6表达增高,可促进白血病细胞的增殖,与急性白血病的不良预后密切相关,可能在其发病中起一定的作用。 p27~(Kipl)是细胞周期依赖性激酶抑制剂之一,主要调控G1期进展,是细胞周期负调控分子。p27~(Kipl)在G0期表达最高,与cyclin E/CDK2紧密结合,并抑制其活性。除细胞周期负调控作用外,p27~(Kipl)还是一个抑癌基因,在实体瘤中能调节耐药、促进凋亡、调节细胞分化,相当多的证据表明p27~(Kipl)失活是肿瘤发展的基本步骤。在一些上皮瘤、淋巴瘤、内分泌肿瘤的发展过程中p27~(Kipl)蛋白表达减低,而p27~(Kipl)在人类肿瘤中很少突变,主要原因是经泛素—蛋白酶体途径降解加速所致。大量研究表明,在人类实体瘤如乳腺癌、结肠癌及前列腺癌中p27~(Kipl)是一个独立的预后分子,p27~(Kipl)低表达者预后不良。有国外文献报道p27~(Kipl)与急性白血病的预后呈正相关,p27~(Kipl)高表达者无病生存期长。
王海燕[6]2005年在《TEL基因微卫星不稳定性和杂合性缺失与儿童急性淋巴细胞白血病相关性研究》文中研究指明目的 研究12号染色体TEL基因微卫星不稳定性和杂合性缺失,以探讨其与儿童急性淋巴细胞白血病发生、发展的关系以及检测的临床意义。 方法 选取53例初发儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者的骨髓及口腔黏膜细胞标本,其中52例为B-ALL,1例为混合型T-B ALL。并对其中13例病人进行了动态检测。同时收集了23例成人急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia,AML),21例成人急性淋巴细胞白血病(ALL)和15例良性血液病标本作为病例对照;5例正常儿童标本作为正常对照。选取12号染色体上TEL基因附近的4个微卫星位点(D12s89、D12s98、D12s269、D12s358),对骨髓标本和口腔粘膜标本的DNA进行多重PCR扩增,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳/银染及凝胶成像分析仪检测,观察微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)及杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)发生情况,并进行分析。 结果 53例初诊儿童ALL患者中,在TEL基因附近的4个位点(D12s89、D12s98、D12s358、D12s269)微卫星不稳定性(LOH和MSI)发生率为47.17%(25/53),LOH的发生率为43.40%(23/53),其中D12s89位点LOH的发生率最高为39.62%(21/53);MSI的发生率为3.77%(2/53)。动态检测13例儿童ALL微卫星不稳定性,初发期LOH的发生率为38.46%(5/13);缓解期为15.38%(2/13);复发期为46.15%(6/13)。1例初诊未检测出LOH及MSI的患者,复发期检测到3位点发生LOH.。2例患者在初诊、缓解和复发叁期均检测到LOH.。 病例对照组23例成人AML患者中,4个位点微卫星不稳定性(LOH和MSI)发生率为17.39%(4/23),其中LOH的发生率为8.69%(2/23);MSI的发生率为8.69%(2/23)。病例对照组21例成人ALL患者,4个位点微卫星不稳定性(LOH和MSI)发生率为23.81%(5/21),其中LOH的发生率为9.52%(2/21),MSI的发生率为14.29%(3/21)。初诊儿童ALL在位点D12s89、D12s98和D12s358的LOH发生率与成人AML和成人ALL的LOH发生率比较均差异显着(P<0.05)。5例正常对照和15例良性血液病对照均未检测到LOH及MSI的发生。 结论 儿童ALL初发患者12号染色体上TEL基因微卫星可检测到高频率的LOH和一定发生率的MSI,提示TEL基因是与儿童急淋密切相关的抑癌基因,
王蔷[7]2011年在《慢性髓细胞白血病急变期的APCcdh1生物学行为研究》文中提出[背景与目的]Exosome是由十余种具有3’→5’RNA核酸外切酶活性组分组成的蛋白复合体,是基因转录后调控的重要机制,被誉为“RNA的蛋白酶体”,它可以严密调节目的基因mRNA的稳定性。CML28是核酸外切酶体exosome的核心组分之一,是利用SEREX技术从慢性髓细胞白血病(CML)细胞的cDNA表达文库中筛选出来的肿瘤抗原,相对分子量为28kD,基因全长1126bp,定位于19号染色体长臂1区3带(19q13)。CML28抗原在正常组织除睾丸外基本不表达,而在肿瘤细胞中高表达,在黑色素瘤、肺癌和前列腺癌等实体瘤患者中有10%～33%的患者体内可以检测到高滴度的CML28特异性抗体,从以上特征中可以推测CML28可能是一个新的肿瘤/睾丸抗原。我们的前期研究显示CML28在CML-急变期(BC)高表达,而且可能与CML细胞的增殖调控密切相关。生物信息学初步结果显示CML28与APCcdh1之间可能存在相互作用,这为exosome与APC/C这两个在细胞增殖代谢中扮演重要角色的蛋白复合体之间建立了一座桥梁。泛素-蛋白酶体通路(Ubiquitin-proteasome Path-way,简称UP通路)是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一,该通路调控着动植物体内几乎所有的生命活动,包括细胞增殖、分化、凋亡、DNA复制和修复、转录和蛋白质质量控制等,并参与病原体的入侵、致病和人类机体的免疫应答等过程。它掌控着从生殖、发育、生长到衰老等各种重大生命过程。泛素介导的蛋白质降解通路是蛋白质功能的主要调节者和终结者,它由底物蛋白质泛素化和蛋白酶体降解两个过程组成。泛素是一条由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链,因其广泛分布于各类细胞而得名。泛素与其底物蛋白质的赖氨酸残基共价结合的过程称为泛素化。泛素化是一个主要有泛素激活酶E1、泛素载体蛋白E2和泛素连接酶E3等介导的多酶级联反应。泛素可以直接从E2转移至特定的靶蛋白形成泛素-蛋白复合物,而在大多数情况下,靶蛋白先与E3特异性结合,E3可使E2和靶蛋白相互接近,继而靶蛋白与E2所连接的泛素结合,这样就完成了靶蛋白的泛素化。在此过程中,E3起着极其重要的作用,它决定了底物泛素化的时间性和特异性。在人类基因组中,只有一种编码E1的基因,少于60种编码E2的基因,以及多余400种编码E3的基因,E3使泛素对底物蛋白的选择具有特异性。在大部分泛素化过程中,底物蛋白的选择以及泛素的连接都是通过特异的E3来实现的,所以E3也被认为是泛素化过程中最为关键的酶,而被称为泛素化系统中的“脑”。许多以复合体形式存在的E3逐渐被人们所发现,主要有APC/C和SCF复合物两大类,它们对基因转录、细胞周期、信号转导等过程具有重要的调控作用。APC/C多聚E3泛素连接酶有两个作用底物链接蛋白APCcdc20和APCcdh1,二者在细胞周期调控中扮演重要角色。有丝分裂晚期至G1期之间,APCcdh1处于活化状态,参与调控细胞的有丝分裂,特别在细胞周期G1/S期转换过程中起关键作用,作为细胞周期调控蛋白参与调控G1期至S期期间精细的DNA修复功能。而APCcdc20在G1、S、M期起重要作用。精确的DNA复制过程以及染色单体分离过程在细胞分裂及维持基因稳定性中极为关键。有研究报道在滋养层细胞及纤维母细胞中APCcdh1与维持基因稳定性密切相关,相反,APCcdc20的激活与基因畸变之间可能有关联,在成人T淋巴细胞白血病中APCcdc20可被Tax激活,并使细胞有丝分裂出现异常,出现非整倍体的复杂核型,形态上表现为多核细胞或胞核盘绕的细胞。APCcdh1在非小细胞癌、胃间质性肿瘤、乳腺癌及直肠癌等实体肿瘤细胞中均有所表达外,在血液肿瘤,特别是包括慢性髓系白血病细胞中为高表达,显示APCcdh1在包括实体瘤和血液肿瘤的发生发展中发挥重要调控作用。近年来APCcdh1蛋白已成为肿瘤发生发展中的研究热点,如前所述已有多家研究其在实体肿瘤中的作用。但尚无研究证实APCcdh1在慢粒急变病程中对维持基因稳定性的作用以及酩氨酸激酶抑制剂及蛋白酶体抑制剂对APCcdh1-Skp2-p27通路的影响。Skp2是SCF (Skp1/Cull/F-box protein)泛素连接酶复合物的亚基之一,在多种人类肿瘤中表达量上调,所以被认为是一种潜在的癌蛋白,它的过表达与许多肿瘤的发生具有相关性,如乳腺癌、胃癌、肺癌等。SCF/Skp2通过诱导细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p27和p21的降解从而参与调控细胞周期。而不同的E3彼此之间也会存在相互制约的关系,已有研究表明在许多肿瘤中, APCcdh1可以通过调节Skp2-p27通路来影响肿瘤的发生和进展,如胃间质细胞瘤、乳腺癌及结肠肿瘤。本课题研究根据前期研究结果,CML28参与了K562细胞的增殖调控,我们拟：①应用生物信息学的方法寻找与CML28相互作用的蛋白,为进一步探讨CML急变期的作用机制以及相关的信号通路提供一些有益的方向性的提示；②根据生物信息学预测及初步验证结果,检测与CML28相互作用的后期促进复合物底物链接蛋白APCcdh1在K562细胞及CML-BC原代细胞中的表达；③分别应用酪氨酸激酶抑制剂及蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理K562、K562/IM细胞及CML-BC原代细胞,研究处理后APCcdh1-Skp2-p27通路、APCcdh1蛋白的表达及其在细胞内定位的变化情况,以及细胞周期、凋亡的变化,探讨伊马替尼和硼替佐米对CML细胞生物学的影响及其作用机理；④靶向沉默APCcdh1的表达,研究APCcdh1在K562细胞中对APCcdh1-Skp2-p27通路以及对APCcdc20的调控作用。[方法]1、我们借助生物信息学的方法,采用UCSC人类基因组数据库、InterProScan、ProtoNet、Motifscan、ELM及PDB等生物信息学在线软件工具对CML28的性质、功能和结构域进行了预测研究分析,寻找可能与之相互作用的蛋白,并进一步运用CO-IP及免疫荧光的方法对二者之间的相互作用进行验证。2、根据生物信息学预测及初步验证的结果,应用Western-blot方法从蛋白表达的水平检测APCcdhl在对伊马替尼耐药或敏感及伴/不伴有附加染色体核型表达的CML-BC细胞中的表达情况,应用免疫荧光技术从蛋白定位的水平检测APCcdhl和Skp2在CML-BC细胞中的定位情况。3、分别应用伊马替尼或尼罗替尼和硼替佐米处理K562细胞、K562-IM细胞及CML-BC原代细胞,运用Western-blot方法检测APCcdh1-Skp2-p27通路中各蛋白表达水平的变化,采用FACS检测伊马替尼和硼替佐米对K562细胞的凋亡及细胞周期的影响,探讨酪氨酸激酶抑制剂及硼替佐米如何通过影响APCcdh1-Skp2-p27通路来发挥杀伤CML肿瘤细胞效应的。4、根据APCcdh1和Skp2的cDNA全长分别设计和合成靶向针对APCcdh1和Skp2的siRNA靶序列,序列如下：APCcdh1 siRNA:5'-UGAGAAGUCUCCCAGUCAG-3'Skp2 siRNA:5'-GCAUGUACAGGUGGCUGUU-3'运用Western-blot及免疫荧光的方法分别检测APCcdh1和Skp2干扰片段对于K562细胞APCcdh1和Skp2的沉默效率；采用FACS检测沉默APCcdh1后K562细胞的细胞周期变化情况；采用免疫荧光技术观察干扰APCcdh1后K562细胞核形态的变化,并应用Western-blot方法检测干扰APCcdh1后K562细胞中APCcdh1-Skp2-p27通路蛋白及APCcdc20的表达变化。[结果]1、我们借助生物信息学的方法,采用UCSC人类基因组数据库、InterProScan、ProtoNet、Motifscan、ELM及PDB等生物信息学在线软件工具对CML28的性质、功能和结构域进行了预测研究分析,分析结果显示：CML28蛋白存在多个(Motif:126-131/210-215/222-227/257-262)可被APC/C底物链接蛋白APCcdhl/APCdcc20识别及相互作用的高度保守结构域D-box, CML28可能与APCcdh1存在相互作用及相互调控关系。并应用CO-IP及免疫荧光的方法初步验证了APCcdh1与CML28之间可能存在某种相互作用。2、APCcdh1在K562细胞以及CML-BC原代细胞中有不同程度的表达,在K562细胞株中APCcdh1高表达,在对伊马替尼耐药并伴有附加染色体核型改变的CML-BC原代细胞中APCcdh1相对低表达,而在对伊马替尼敏感及不伴有附加染色体核型改变的CML-BC原代细胞中,APCcdh1的表达相对较高。3、伊马替尼或硼替佐米可促进K562细胞的凋亡,并分别使细胞静止在G0/G1期或停滞在G2/M期。二者作用于K562细胞后均可上调APCcdh1的表达,同时下调Skp2并募集p27,应用尼罗替尼或硼替佐米处理K562/IM细胞也可得到相同的结果。同时还发现,伊马替尼及硼替佐米处理后,K562细胞中APCcdh1的分布从胞浆转至胞核。4、应用siRNA瞬时干扰APCcdh1的表达,Western-blot及免疫荧光检测结果显示其表达明显下调。FACS结果显示干扰APCcdh1可加快细胞从G1期向S期的转化,并伴随着细胞核形态花样改变。Western-blot结果还显示,APCcdh1表达下降的同时可明显促进Skp2和APCcdc20的募集、下调p27,从而影响K562细胞增殖动力学。[结论]1.采用多种生物信息学在线软件工具对CML28的性质、功能和结构域进行分析,发现CML28与APCcdh1之间可能存在相互作用。进一步应用免疫共沉淀以及共定位分析的方法,从内源性和外源性两方面初步验证了APCcdh1与CML28之间的相互作用。2.在伊马替尼耐药并伴有附加染色体核型异常的CML患者中APCcdh1的表达较低,而在对伊马替尼敏感同时不伴附加遗传学改变的患者中APCcdh1高表达。3.酪氨酸激酶抑制剂及硼替佐米可以诱导APCcdh1的表达及定位发生变化,通过APCcdh1-Skp2-p27这一独立于bcr-ab1激酶途径以外的通路对CML-BC细胞起到调控作用。4.硼替佐米处理IM耐药的CML-BC细胞可以诱导APCcdh1的表达上调,并诱导细胞凋亡。5.干扰APCcdh1后可上调Skp2的表达,下调p27的表达,而干扰Skp2后可上调p27,说明在K562细胞中存在APCcdh1-Skp2-p27通路,并参与影响细胞增殖动力学效应。
马劼[8]2002年在《细胞周期素A（cyclinA）对白血病细胞增殖调控的临床及实验研究》文中进行了进一步梳理细胞周期素A(cyclinA)是细胞周期的一种正性调节因子，是人类cyclins家族中的一个主要成员，它首先是在原发性肝癌细胞中与HBV DNA整合部位上检测到的，并认为这种整合作用有致癌性。cyclinA在DNA合成前的G1晚期出现，存在于细胞核内，作为调节亚基与相应的催化亚基—细胞周期素依赖性激酶(cyclins dependent kinases，CDK)中的CDK2、CDC2结合，参与细胞DNA复制、合成，并促进细胞进入有丝分裂，是细胞越过并顺利完成S期、G2／M期等各程序所必须的因子，它的正常表达代表正常的细胞增殖活性。 若cyclinA异常表达，则使错配或合成不完整的DNA丧失修复时间而直接进入细胞周期引起异常的细胞增殖，是肿瘤发生的原因之一。目前认为cyclinA在多种肿瘤中有异常高表达，而且是肿瘤细胞恶性增殖及预后不良的指标。对于cyclinA在白血病患者中的表达及其作用国内外的报道不多，仅认为cyclinA在白血病细胞中有高表达并且与细胞的S期及G2／M期细胞所占的比例有明显的正相关性，是白血病细胞增殖的一种新的指标，可能对判断预后有帮助。因此我们的实验通过探讨cyclinA在急慢性白血病患者中的表达，希望明确其在白血病发病过程中所起的作用，与其他细胞周期调控因子(cyclinA1、cyclinB1、cyclinG1及P21cipl)之间的关系，了解其表达异常与临床白血病患者的分型、分期及预后(复发、耐药、缓解)的关系：希望为临床诊断、化疗药物的选择及判断预后提供帮助。 反义核酸技术是利用反义RNA抑制或封闭目的基因的表达，现该技术已被广泛应用于肿瘤及遗传性疾病的研究之中，它可通过封闭特异的癌基因达到基因导向治疗肿瘤的目的。cyclinA在白血病细胞中有高表达是众所周知的，我们希望设计一个特异的cyclinA反义脱氧寡核苷酸(antisense oligodexynucleotide，ASON)封闭cyclinA的表达，探讨cyclinA ASON对体外培养的白血病细胞增殖、凋亡的调控作用，并用 中文摘要脂质体转染提高细胞内摄取反义核酸的浓度，比较两种导入方法的抑制效率，选取效率高的导入方法在体内进行裸鼠成瘤实验进一步证实其功能，从分子水平揭示CyClinA对白血病细胞恶性增殖的作用，希望为基因治疗白血病提供一个新的思路。l 细胞周期素A在成人急性白血病思者中的表达与意义 目的 探讨细胞周期素A＊yClind）在成人急性白血病（AL）患者中的表达及其临床意义。 方法 采用流式细胞术及 RTICR法对 100例 AL患者及 10例正常人进IT cyclinA、cyclinAI、cyclinBI． cyclinGI、PZlc…蛋白水平及mRNA水平的检测，并对其中cycliM阳性表达的患者的PCR扩增产物进行DNA测序分析。 结果 门）在AL＄者中CyClinA蛋白水平在细胞周期中的分布无异常，即 GO／GI期出现，在 S期增加，于 GZ／M期达到高峰，与正常细胞中的CyClinA的分布一致，经测序分析发现CyCliM阳性扩增片段与基因库中的目标完全一致；CyClinA蛋自及InRNA的阳性率 （66．70，59．0O）和中位表达水平（18．50，0．539土 0．990）明显高于正常人T＜0刀 1＼ Q）CyClinA蛋白表达与其 InRNA水平之间有明显的正相关性（，叩．597，P司刀00L 说明CyClinA基因在转录水平上是可以调控的；臼）CyClinA蛋白及mlLvA水平与S期、GZ／M期细胞所占的比例呈正相关性（P＜0刀1人 N）cyclinA蛋白表达与AL ＄者中外周血WB C计数呈负相关性（，一o．295，P二0．mo人而与患者的年龄、性别、幼稚细胞所占的比例、FAB分型等无关0＞0刀5人 u）CyCliM的阳性率及表达水平在初治及复发的AL 患者之间无明显差异 0＞0刀5人 但两组患者的cyclinA表达水平均明显高于缓解期AL患者和正常对照组T＜0刀1人 对不同FA B分型的＊L患者进行分析，发现复发组 ALL患者的CyClinA蛋白表达水平门．4％）明显低于初治组（2．5％）k二 14．418，P二0＊22）；（6）CyCli帆高表达患者的 CR率 （87．9O，85．7o）明显高于低 表达患者（38．2o，53．3O）（P＜0．05），用多因素逻辑回归分析发现cyclinA蛋白、S期及GZ／M期细胞所占的比例、cyclinA mRNA是影响AL患者CR率的独立因素（其相对危险度分别为 10 石3、5．70、4．71；P＜0＊5）；（）在 AL患者中，cyclinA与 2 中文摘要 CyClinAI的InRNA表达水平之间无相关关系（，一0刀32，P＝0．801＊ 说明两者在AL中的作用不同，不能相互替代。CyCliMl基因的表达与 AL患者的FAB分型密切相关，即在AML患者中CyClinAI的表达水平 （0．7103士0．7241）明显高于ALL患者（0．2969士0．5358），而且尤其 是在AML（M3）型患者中CyCli“l的表达门．194士0尸357）明显高 于其他FAB分型组o功刀1人CyClind与CyClindl两者同时高表达的 10例患者全部 CR，而两者同时阳性低表达的 5例患者仅一例 CR；抢） CyClinA在AL患者中与
张翼[9]2014年在《miR-302b介导表阿霉素抗骨肉瘤作用及机制研究》文中研究表明骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,以产生不成熟的骨及骨样组织为基本特点。75%的病人年龄在10-30岁,恶性程度高,易早期局部侵袭或远处转移,预后差,是危害青少年健康的主要肿瘤性疾病之一。目前骨肉瘤的致病基因和发病机制研究成为骨肉瘤基础研究中的重点和热点,这些研究可以为临床实践中早期诊断和治疗骨肉瘤发挥重要的指导作用,以后也将成为骨肉瘤诊断和治疗的关键。近十余年以来,研究人员发现microRNA(miRNA)广泛参与原核和真核生物体内基因表达和功能调节。目前研究结果证实,miRNA广泛参与细胞内基因转录调节、信号转导调控,与炎症、肿瘤、内分泌疾病的发生、发展密切相关。miRNA是基因表达和蛋白翻译阶段重要的内源性调节RNA,通过特异性改变靶基因表达水平和功能状态,在肿瘤的发生过程中起到关键的调控作用。本文以表阿霉素(Epirubicin, EPI)抗骨肉瘤过程为基本研究模型,首先确定并量化表阿霉素抑制骨肉瘤增殖的效果,以miRNA表达谱芯片寻找在表阿霉素抗骨肉瘤过程中差异性表达的miRNA,并确认这些miRNA的表达水平。其次根据这些差异性miRNA的功能状态,利用外源性miRNA模拟物在体外研究中有目的性的改变这些miRNA的表达水平,同时联合使用表阿霉素,检测该miRNA在骨肉瘤细胞中的表达水平,以确认其在表阿霉素抗骨肉瘤过程中的作用。最后,我们利用体外miRNA表达调控技术,调节目的miRNA表达,检测其下游可能的多种mRNA表达水平,并检测骨肉瘤细胞凋亡和周期变化,从而确定目的miRNA在表阿霉素抗骨肉瘤过程中的作用,并确定靶基因蛋白在表阿霉素抗骨肉瘤过程中的表达变化和作用。第一部分miRNA在表阿霉素抗骨肉瘤过程中的差异性表达目的：研究表阿霉素处理后骨肉瘤细胞中miRNA表达谱变化,并对其变化趋势进行确证,寻找感兴趣的miRNA以进行功能学研究。方法：首先利用CCK-8法检测表阿霉素对骨肉瘤MG-63和SAOS-2细胞增殖抑制作用,观察表阿霉素处理后骨肉瘤细胞形态学变化。其次应用miRNA表达谱芯片检测表阿霉素处理前后骨肉瘤细胞中miRNA表达水平,寻找出差异性表达的miRNA.然后通过生物信息学研究和现有文献总结,选择部分差异性miRNA作为感兴趣的miRNA。最后以实时定量PCR法确证骨肉瘤中感兴趣miRNA在表阿霉素处理前后差异性表达,为进行下一步功能学研究提供基础。结果：1μg/ml及以上浓度表阿霉素可以明显降低骨肉瘤细胞增殖,且这种抑制作用具有浓度依赖性。以lug/ml表阿霉素处理骨肉瘤MG-63和SAOS-2细胞后,细胞形态发生明显改变,骨肉瘤细胞miRNA表达谱发生显着改变,筛选后共发现40个差异性miRNA,其中包括16个上调性表达,24个下调性表达。miR-302b在表阿霉素处理骨肉瘤细胞后呈显着上调性表达；根据生物信息学研究和现有文献查阅,miR-302b可能在骨肉瘤细胞凋亡和周期分布中发挥重要作用。结论：表阿霉素可以通过改变骨肉瘤中miRNA表达谱抑制细胞增殖,共有40个可能的差异性miRNA参与调节这一过程,其中上调性表达miR-302b可能具有重要功能学意义。第二部分miR-302b在表阿霉素抗骨肉瘤过程中功能和作用机制目的：上调骨肉瘤细胞中miR-302b表达水平,研究其单独或与表阿霉素协同抗骨肉瘤作用。方法：利用Lipo2000和miR-302bmimics对骨肉瘤MG-63和SAOS-2细胞进行转染,转染之后通过实时定量PCR检测骨肉瘤细胞在不同因素处理后miR-302b表达水平。在不同因素处理骨肉瘤细胞后,以CCK-8法检测骨肉瘤细胞增殖率；以AnnexinV-PE和7-AAD双标法检测骨肉瘤细胞凋亡率；以碘化丙啶(PI)染色法确定骨肉瘤细胞周期分布变化；以酶切后产物比色法检测Caspase-3活性变化；以Western-blot法检测骨肉瘤细胞内凋亡和周期相关调控蛋白表达水平。结果：以miR-302b模拟物转染骨肉瘤细胞后发现miR-302b表达上调可以明显抑制骨肉瘤细胞增殖,且与表阿霉素具有协同作用；miR-302b表达上调可以明显促进骨肉瘤细胞凋亡,并促使细胞周期G1阻滞,抑制骨肉瘤细胞增殖；miR-302b通过激活Caspase-3,降低AKT、pAKT、Bcl-2、Cyclin D1、CDK2/4并提高Bim表达诱导骨肉瘤细胞凋亡和周期阻滞。结论：上调miR-302b表达可以调节多种凋亡和周期调控蛋白表达水平,从而促进骨肉瘤细胞凋亡且进入细胞周期G1阻滞,抑制骨肉瘤细胞体外增殖,介导表阿霉素抗骨肉瘤过程。
刘张玲[10]2014年在《LY294002对慢粒白血病急变期K562细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响及其效应》文中进行了进一步梳理慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia, CML)是起源于骨髓造血干细胞的恶性克隆性疾病，它以9号和22号染色体发生相互易位形成的BCR/ABL融合基因为发病特征，该基因编码的BCR/ABL癌蛋白具有高酪氨酸激酶活性，能够激活细胞内多条信号通路，从而使白血病细胞恶性增殖和凋亡受阻。CML分为慢性期，加速期和急变期，急变期由于其生存时间短，病死率高，缺乏有效的治疗策略而备受关注。β-catenin在CML急变过程中发挥着重要作用，而其受BCR/ABL及其下游信号通路调控的具体分子机制尚未完全阐明。在CML急变期细胞中，PI3K-AKT信号通路和Wnt/β-catenin信号通路有共同的靶基因c-myc和cyclinD1，他们共同调节白血病细胞的恶性增殖和抑制细胞凋亡。而GSK-3β作为它们的连接桥梁使我们推测这两条信号通路可能存在着交互作用。本课题的研究思路是首先检测β-catenin在CML慢性期和急变期的表达变化，以证实β-catenin在CML急变期高表达；其次采用PI3K-AKT信号通路的特异性抑制剂LY294002作用于慢粒急变期K562细胞，检测其对K562细胞增殖和周期的影响；最后探讨PI3K-AKT信号通路对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，以明确LY294002抑制慢粒增殖的作用机制，为慢粒急变的发病机制及其靶向治疗提供新的思路。实验方法如下：1.采用定量PCR和Western blot检测临床CML病人慢性期和急变期中BCR/ABL和β-catenin表达变化。同时检测CML相关细胞株中β-catenin的蛋白表达情况。2.采用不同浓度的LY294002作用于K562细胞，MTT法检测其对K562细胞增殖的影响，克隆形成实验检测LY294002对细胞克隆形成能力的影响，流式细胞术检测LY294002对细胞周期的影响。3.采用20μM的LY294002处理K562细胞24h，Western blot检测pβ-catenin（S33/S37/T41）,总β-catenin, pGSK-3β(S9)的蛋白表达；定量PCR检测β-catenin的mRNA表达；免疫荧光和提取胞浆胞核蛋白检测β-catenin在胞浆胞核中的定位变化；放线菌酮联合处理检测β-catenin的蛋白稳定性；Western blot和qPCR检测Wnt/β-catenin下游靶基因c-myc和cyclinD1的mRNA和蛋白表达变化。通过以上实验，得到的实验结果如下：1.成功检测到CML急变期病人骨髓单个核细胞中BCR/ABL和β-catenin的mRNA和蛋白表达明显高于慢性期病人；检测到CML急变期细胞株K562、KU812中β-catenin的蛋白表达明显高于CML转化细胞株BP210、32DP以及BCR/ABL阴性细胞株BaF3、32D。2. MTT和细胞集落形成实验结果显示LY294002作用K562细胞24h后，抑制了K562细胞的增殖能力以及克隆形成能力，并且随着药物浓度的增加，抑制效应逐渐增强。流式细胞术发现LY294002能够抑制细胞周期进程，将K562细胞阻滞于G1期，G1期细胞比例增加，S期和G2期细胞比例下降。3. Western blot发现LY294002处理K562细胞24h后，pβ-catenin（S33/S37/T41）,总β-catenin, pGSK-3β(S9)的蛋白表达减少；β-catenin的mRNA水平没有明显变化；β-catenin在胞浆和胞核中的定位同等程度地减少；β-catenin的蛋白稳定性下降；c-myc, cyclinD1的mRNA和蛋白表达减低。综上所述，实验结果证实CML中BCR/ABL和β-catenin的表达在急变期明显升高；PI3K-AKT抑制剂LY294002能够抑制CML急变期K562细胞的增殖及细胞周期，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路相关。
参考文献：
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