王海龙, 王春芳, 赵嘉惠, 殷国荣, 乔中东[1]2006年在《大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因的改造及在大肠杆菌中的表达》文中研究说明目的通过将发生点突变的两个大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因进行改造,获得具有正确序列的OSCP基因,在大肠杆菌中表达并进行活性鉴定。方法通过限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶将发生错义突变的两个OSCP基因的DNA克隆进行改造,获得具有正确核苷酸序列的OSCP基因;然后将该片段连接进原核表达载体pET-28c(+),构建成重组质粒PET-28c(+)-OSCP;用该重组质粒转化E.coli,转化子在37℃诱导表达相应的融合蛋白,通过Western-blot鉴定。结果酶切及测序显示对OSCP基因错义突变的纠正获得成功。酶切结果显示成功构建了原核表达载体pET-28c(+)-OSCP。IPTG诱导表达4h后,SDS-PAGE及Western-blot显示诱导表达出分子量约23000的大鼠寡霉素敏感相关蛋白,且该蛋白具有免疫活性。结论在国内初次表达出大鼠OSCP,表达产物具有免疫反应性,为OSCP的结构及功能研究奠定了基础。
范海鸣[2]2008年在《大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及原核表达载体的构建》文中提出目的:心肌梗死已经成为严重危害人类健康的主要心血管疾病之一。心肌梗死早期心肌缺血预适应主要通过改善心肌细胞的能量代谢对心肌产生保护作用。ATP合酶是细胞能量代谢中最重要的酶,寡霉素敏感相关蛋白(oligomycinsensitivity-conferring protein,OSCP)作为ATP合酶上受到寡霉素调节的部位,直接参与能量代谢的调节。因此,通过对OSCP敏感部位基因转录及表达调控的研究可能为从调节能量代谢角度研究预适应心肌保护作用的机制提供新的方向。故本实验旨在通过克隆大鼠OSCP基因全长cDNA,并构建重组原核表达载体,为后续OSCP蛋白表达、活性鉴定及抗体制备等方面的研究工作奠定基础。方法:本实验采用RT-PCR等分子生物学技术对OSCP基因进行了扩增和克隆方面的研究,具体如下:1.提取大鼠脑组织总RNA:采用一步法从新鲜大鼠脑组织中提取总RNA。紫外分光光度计测量其在260 nm和280 nm波长的光密度,计算A_(260)/A_(280)比值确定总RNA的纯度;根据测定的A_(260)值计算RNA的浓度;甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。2.RT-PCR:根据GeneBank中大鼠OSCP基因序列,采用国际通用的分子生物学软件Primer 5.0和Oligo 4.01分别设计上、下游引物:上游引物为:5′-AGGATCCATGGCCGCACCAGCAAC-3′下游引物为:5′-AGTCGACTCAGAGCAGATCCCGCATG-3′其中上游引物中引入了限制性内切酶BamH I的识别位点GGATCC,下游引物中引入了限制性内切酶Sal I的识别位点GTCGAC。引物的合成由上海生工生物公司完成,用于RT-PCR反应。采用Oligo(dT)_(15)为逆转录引物,以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成与mRNA互补的单链DNA。用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增目的基因OSCP,以增加扩增基因的保真性。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。3.重组克隆载体的构建及鉴定:将PCR产物回收纯化后,将其与克隆载体pTA2进行连接。将连接产物转化感受态细菌E.coli DH5α。扩增转化后的细菌,碱裂解法提取质粒,用EcoR I进行酶切鉴定及PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒。进行基因序列测定,测序结果用Gene Runner、BLAST软件进行分析。4.重组表达载体的构建及鉴定:重组质粒pTA2-OSCP经BamH I和Sal I双酶切后进行纯化,将回收的目的片段OSCP与经同样酶切和纯化的原核表达载体pQE30-Xa片段用T_4 DNA连接酶连接。将连接产物转化感受态细菌E.coli DH5α。扩增转化后的细菌,碱裂解法提取质粒,用BamH I和Sal I进行双酶切鉴定及PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒。进行基因序列测定,测序结果用Gene Runner、BLAST软件进行分析。结果:本实验对总RNA、RT-PCR产物、重组克隆载体和重组表达载体均进行了检测和鉴定,如下:1.总RNA的纯度、浓度及完整性检测:总RNA的OD_(260nm)/OD_(280nm)为1.87,纯度较好;RNA浓度为2989.8μg/ml;甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果表明所提总RNA完整性较好。2.目的基因片段的RT-PCR扩增:RT-PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳,在约700 bp处出现一清晰的特异性条带,与已发表的OSCP基因序列大小相同。3.重组克隆载体的鉴定:重组质粒pTA2-OSCP经EcoR I单酶切鉴定,得到约3000 bp的线性片段和约700 bp的插入片段,结果与预期设计大小相符;重组质粒pTA2-OSCP经PCR鉴定,得到约700 bp的PCR产物,结果与预期设计大小相符;选取阳性重组质粒进行测序,测序结果与GeneBank数据库进行比较分析,显示与已公布的大鼠OSCP基因序列同源性为100%。4.重组表达载体的鉴定:pQE30-Xa-OSCP经BamH I、Sal I双酶切鉴定,得到约为3500 bp和约700 bp的两条线性片段,结果与预期设计大小相符;pQE30-Xa-OSCP经PCR鉴定,得到约700 bp的PCR产物,结果与预期设计大小相符;选取阳性重组质粒进行测序,测序结果与GeneBank数据库进行比较分析,显示与已公布的大鼠OSCP基因序列同源性为100%。结论:本实验成功克隆了大鼠OSCP基因全长cDNA序列,并构建了重组克隆载体pTA2-OSCP和重组原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。
张建红[3]2008年在《大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建》文中进行了进一步梳理目的:心血管疾病由于其发病率和病死率很高,已成为危害人类健康的头号杀手,而细胞能量代谢障碍又是引发心血管疾病的重要原因,寻求有效治疗细胞能量代谢障碍的药物,是当前研究的热点。寡霉素敏感相关蛋白(oligomycinsensitivity-conferring protein,OSCP)作为ATP合酶的一个重要亚基,在细胞能量代谢中发挥着重要作用。缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)对缺血心肌的保护作用与ATP合酶活性的升高有密切关系。本实验采用基因工程的方法克隆ATP合酶中的OSCP基因,并构建其真核表达载体,这为以后对该基因在真核细胞中过表达、蛋白活性的检测以及研究OSCP在细胞能量代谢、IPC中的作用奠定了基础。方法:1.扩增大鼠OSCP基因:首先取SD大鼠脑组织50 mg左右,依照Trizol试剂说明书中步骤提取总RNA。根据OSCP基因的开放阅读框设计合成一对引物。用RT-PCR方法扩增出编码OSCP基因的全长序列,分离纯化PCR产物。2.构建重组克隆载体pTA2-OSCP:将PCR产物与pTA2克隆载体连接,连接产物转化入E.coli JM109感受态细菌,摇菌扩增,提取质粒DNA,用EcoR I进行酶切鉴定,筛选出阳性重组质粒进行DNA序列测定,测序结果用GeneRunner软件分析。3.构建重组表达载体pEGFP-N_1-OSCP:重组质粒pTA2-OSCP和真核表达载体pEGFP-N_1分别经BglⅡ/EcoR I酶切,然后通过T_4连接酶连接,转化入E.coliDH5α感受态细菌,摇菌扩增,提取质粒DNA。经BglⅡ/EcoR I酶切鉴定,筛选出阳性重组质粒进行DNA序列测定,测序结果用Gene Runner软件分析。结果:1.OSCP基因的的RT-PCR扩增:总RNA的OD_(260nm)/OD_(280nm)为1.87,纯度符合实验要求;甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果表明所提总RNA的完整性好;琼脂糖凝胶电泳结果显示RT-PCR产物的长度约为700 bp,与预期结果相符。2.重组克隆载体pTA2-OSCP的鉴定:重组克隆载体pTA2-OSCP经EcoR I限制性内切酶鉴定,得到约3000 bp的线性片段和约700 bp的插入片段,与预期结果相符;选取阳性克隆载体进行测序,与已公布的大鼠OSCP基因序列比较分析,同源性为100%。证明pTA2-OSCP重组克隆载体构建成功。3.重组表达载体pEGFP-N_1-OSCP的鉴定:重组表达载体pEGFP-N_1-OSCP经BglⅡ/EcoR I双酶切得到约为4700 bp的线性片段和约700 bp的插入片段,与预期结果相符;选取阳性重组表达载体进行测序分析,与已公布的大鼠OSCP基因序列比较,同源性为100%。证明重组表达载体pEGFP-N_1-OSCP构建成功。结论:1.通过RT-PCR扩增出了大鼠OSCP基因。2.重组克隆载体pTA2-OSCP构建成功。3.重组真核表达载体pEGFP-N_1-OSCP构建成功。
王海龙[4]2003年在《大鼠寡霉素敏感相关蛋白（OSCP）基因在大肠杆菌中的克隆和表达》文中研究表明经典的固醇类激素的作用是通过核受体途径发挥的。但越来越多的证据表明，固醇类激素还可通过所谓的膜受体途径激活胞内信号分子而发挥作用，所以研究固醇类激素的膜受体就显得特别有意义。 寡霉素敏感相关蛋白(oligomycin sellsitivity-conferring protein, OSCP)是ATP合成酶／ATP酶的一个亚单位。ATP合成酶／ATP酶是一个跨膜的多亚基复合体，广泛存在于线粒体、细菌、叶绿体的胞壁膜上，包括位于膜外的F1、位于膜内的FO以及连接二者的OSCP叁部分组成。F1是ATP合成酶／ATP酶的活性中心，它可以催化ATP的合成和分解；FO作为质子通道，参与光合磷酸化和氧化磷酸化中能量的转化。OSCP作为联系FO和F1的桥梁，在生物体能量转化中发挥重要作用。寡霉索可与OSCP特异结合，抑制质子流通过FO，使ATP的生成受到阻抑。 1996年，Ramirez等分离、纯化雌性大鼠脑神经细胞膜组分，使其通过填充有雌二醇的亲和层析柱，然后将吸附于亲和柱上的物质洗脱，进行SDS-PAGE。其中只有突触膜组分的洗脱液经过SDS-PAGE后，在23KD(a)处发现一特异条带，经蛋白质测序分析，确定此物质为OSCP。表明雌性大鼠神经细胞突触膜上存在有OSCP，并与雌二醇有高度亲合力，随后的实验进一步证明该蛋白很可能是一种雌激素膜表面受体。另有报道称，线粒体蛋白ATP合成酶／ATP酶的活性可被雌激素快速抑制，很可能是雌激素通过与OSCP结合，调节质子流的跨膜运动，从而调节细胞能量代谢。由此可 Sha队i卜I匕dieaIL下niversityl!le、、，‘，一kfo一卜laster见，某些情形下，雌激素发挥其功能与OSCP有着密切关系，故深入研究OSCP的结构和功能就有特别的意义。目的本实验选取了OSCP基因的开放启司读框共684个核首酸序列，进行体外扩增和克隆，随后成功地表达出了大鼠的OSCP，为进一步{J};究这一:l丁能的雌激素膜受体的结构和功能及其作用力一式创造了条件。方法(l)构建大鼠OSCP基因重组质粒:分离3周龄雌性SD大鼠脑组织，提取总R刊A。根据OSCP基因的开放阅读框设砂「合成1对引物。用RT一PCR方法扩增出编码OSCP基因的全长序列，分离纯化PCR产物，将其与pGEM一T easy质粒连接，并转化入JM 109感受态细胞，摇菌妇L增，提取质粒DNA。酶切鉴定，DNA序列分析，用以检测所克隆的大鼠OSCP基因重组质粒pGEM一T easy一OSCp。 (2)通过基因改造获取正确的OSCP基因亚组体:通过DNA序列分析发现所得克隆发生J点突变，造成编码氨基酸的叁联体密码子发生有义突变。选取两克隆，采用限制性内切酶将发生突变的部位切除，然后通过T4DNA连接酶将未突变序列连接起来，经酶切鉴定，ONA序列分析，)}J以证明所获得的大鼠OSCP基因重组体是否改造成功。 (3)构建大鼠OSCP基因的原核表达菌株，并进行蛋自表达及活性柴定:将正确的OSCP基因重组体亚克隆入融合表达载体PET一28c(+)中，转化BLZI感受态细胞，摇菌扩增，提取质粒DNA，酶切鉴定，检测是否构建成功大鼠OSCP基因的原核表达菌株PET一28。(+)一OSCP。IPTG诱导表达后，经505一PAGE分离所表达出的融合蛋自。随后通过将SDS一PAGE所分离出的融合蛋白转移到硝酸纤维素膜上，先后川兔抗大鼠OSCP的多克隆抗血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔!gG对峭酸纤维素膜进行封闭，最后进行X片曝光、显影、定影的蛋自印迹技术进行鉴定S】lanxi入Iedieal Universit、l】一e认，01长for Master结果oscP基因的开放阅读框全长684bp，根据其序列设计的PcR引物包含了该阅读框起始密码子及其终止密码子后的16bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示RT一PCR产物的长度为700bp，与顶J明结果相符。将RT一PcR产物纯化、连接入pGEM一T easy质粒载体，提取质粒DNA，酶切结果提示获取了大鼠oSCP基因重组质粒pGEM一T easy一oscP。但DNA序列分析结果提示，克隆Cl在第99bp处的碱基A突变为G，克隆CZ在300bp处缺失一碱基A。为了纠正上述突变，将克隆CZ下游的部分多克降位点(主要是EcoRI酶切位点，目的是为下一步亚克隆pGEM一T easy一OSCP中插入片段与原核表达载体PET一25。(+)的连接准备条科几)jl]spel+Pstl双酶切删除，然后通过Klenow片段补平、T4DNA连接酶连接，制备得到亚克隆CZ。再用Sacl以及插入片段，}，的PPuMI分别共同消化亚克隆CZ和克隆cl，去掉突变部位重新连接，以制备亚克隆pGEM一T easy一OscP。提取质粒DNA，酶切及ONA序列分析结果提示，得到一有正确OSCI〕基因序列的新克隆。然后将有正确序列的新克隆中的插入少日没亚克隆入原核表达载体PET一28c(+)，提取质粒DNA，酶切结果提示，构建成功了大鼠OsCP基因的原核表达菌株PET一28c(+)一oscl〕。经Il，TG诱导表达，12%的SDS-PAGE呈现出一约23KD(a)的特异表达带，再将融合蛋自转移到硝酸纤纤i:素膜上，用兔抗大鼠OSCP的多克隆抗血i青及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔lgG检测，经x片曝光、显影、定影，可见一oSCI，的特异条洲;:。结论在国内初次克隆了大鼠OSCP基因，并成功构建了大鼠OSCP白勺基因重组质粒;通过基因改造成功地进行了大?
参考文献：
[1]. 大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因的改造及在大肠杆菌中的表达[J]. 王海龙, 王春芳, 赵嘉惠, 殷国荣, 乔中东. 热带医学杂志. 2006
[2]. 大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及原核表达载体的构建[D]. 范海鸣. 天津医科大学. 2008
[3]. 大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建[D]. 张建红. 天津医科大学. 2008
[4]. 大鼠寡霉素敏感相关蛋白（OSCP）基因在大肠杆菌中的克隆和表达[D]. 王海龙. 山西医科大学. 2003
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