孙砚[1]2003年在《利用拟南芥遗传资源构建植物人工染色体》文中提出真核生物中DNA与多种特异的蛋白质结合组成遗传物质的载体——染色体。在细胞分裂过程中，染色体首先进行DNA复制，产生染色单体并排列于赤道板上，然后在纺锤丝的牵引下染色单体两两分离，移向细胞两极。为了保证细胞分裂周期中染色体行为的正确和其结构的稳定，生物必须有一套复杂、有效、有条不紊的机制做保障。在这一保守系统中，染色体上的着丝粒、端粒和复制起点是叁个关键成分。 1983年，Murray和Szostak在大肠杆菌质粒pBR322中加入酵母的着丝粒，ARS序列及四膜虫核糖体RNA基因rDNA(Tr)末端序列，构建了长度为10.7kb的短着丝粒的环状质粒。用这一质粒转化酵母菌，质粒变为线状，成为第一个酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome YAC)。YAC的成功构建为我们理解着丝粒、端粒等功能组分在酵母染色体中的作用提供了依据，同时也对有丝分裂、染色体断裂机制的研究、细胞同步研究和染色体进化等方面的研究有着重大的意义。不仅如此，YAC的出现还为基因克隆提供了新型载体，为构建高等生物的基因组文库提供了技术支持。YAC虽然在文库构建、基因克隆和细胞分裂机制的研究等领域起了巨大的作用，但YAC只能在低等单细胞生物酵母中稳定存在，难以用来转化高等生物。人类人工染色体(HAC)的组成成分都可以是来源于人类自身的基因组，因此可以同细胞中正常的染色体一样分裂复制，稳定遗传并且不会对受体产生毒害，所以通过应用HAC有可能解决基因治疗中的难题。1997年，美国的Case Western Reserve宣布构建成功第一代HAC。 在植物细胞中构建人工染色体将为植物染色体的结构和功能以及染色体的各必须组分的研究提供有效的工具和手段。成功构建的植物人工染色体也可以作为一种新型的载体用来克隆和转化长达几百Kb到一个Mb的外源DNA进入植物细胞。因为拟南芥的全基因组测序已经完成，而且拟南芥含有所有绿色植物中最完整最连续的着丝粒区的已知序列，所以我们选用这种模式植物作为基础构建植物人工染色体。我们通过PCR和序列分析，选择了含有拟南芥着丝粒区178bp串连重复序列的YAC克隆作为构建人工染色体的基础，同时也克隆了拟南芥的端粒和ARS等序列。拟南芥的端粒是利用端粒的重复序列进行无模板的PCR扩增得到的；约2000bp的ARS片段是从拟南芥的BAC克隆T14A4中用限制性内切酶C1a1切下，然后亚克隆到通用载体Pbluescript上。 为了构建植物人工染色体，我们构建了可以和含有着丝粒序列的YAC载体的左臂和右臂进行同源重组的质粒载体。与右臂同源重组的载体包含了端粒，用于在酵母中筛选的G418的抗性基因kanMX4和用于与YAC DNA同源重组的TRP1基因片段；华中农业大学硕L学位论文2的3年5月与左臂同源重组的载体包含了端粒，用于在酵母中筛选的A珑2基因，用于在植物中筛选的份毕万基因，用于同源重组的乙厉洲3基因片段和人Rs片段。这两个载体都被转入含有YAC克隆的酵母菌株AB1380，在酵母细胞中完成了与YAC克隆的同源重组，从而使拟南芥的着丝粒区的两端都与端半妇字列连接起来，在酵母细胞中形成了植物人工染色体的雏形。用脉冲电泳将经过同源重组的修饰的YAC克隆分离出来通过脂质体转化植物的原生质体，希望得到在植物细胞中稳定存在的植物人工染色体。
钱前, 瞿礼嘉, 袁明, 王小菁, 杨维才[2]2013年在《2012年中国植物科学若干领域重要研究进展》文中研究说明2012年中国植物科学研究继续快速发展。中国科学家在植物科学多个领域中取得了大量的原创性、高水平研究成果,包括植物基因组研究、植物天然免疫抗性及其应答环境的信号转导机制以及植物去甲基化作用和DNA双链断裂修复机制研究等,受到国内外的高度评价。该文对2012年中国本土植物生命科学若干领域取得的重要研究进展进行概括性评述,旨在全面追踪当前中国植物科学领域发展的最新前沿和热点事件,并展现我国科学家所取得的杰出成就。
邢继红[3]2006年在《拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析》文中认为灰霉病是一种世界性的重要病害,病原为灰葡萄孢(Botrytis cinerea),其寄主范围广,常造成严重的经济损失。本论文在研究拟南芥不同生态型对不同病原菌抗性反应的基础上,探讨了拟南芥抗灰葡萄孢侵染的表型特征、细胞学证据和生化机制,对拟南芥抗灰葡萄孢基因进行了连锁分析和定位,应用抑制性消减杂交(SSH)和mRNA差异显示—PCR(DDRT-PCR)技术获得了大量拟南芥抗灰葡萄孢的相关基因片段,克隆了2个拟南芥抗灰葡萄孢相关基因,同时通过原核基因的表达初步验证其中1个抗病相关基因对灰葡萄孢的生长有一定的抑制作用。为更好地利用模式植物拟南芥的遗传资源和信息,促进植物抗病基因的克隆和相关作物的遗传改良奠定了良好的基础。 1.通过对拟南芥11个生态型对不同植物病原菌的抗病性反应测定,筛选出了具有抗/感差异表现的拟南芥—病原菌组合。供试40个菌株中,有19个菌株对拟南芥的11个生态型都表现抗/感差异,其中10株为灰葡萄孢菌株。试验选择灰葡萄孢菌株BC18为供试菌株,确定对其表现抗病的Col-0、Ws-0生态型和对其表现感病的Ler生态型为供试拟南芥。Col-0、Ws-0生态型接种灰葡萄孢菌株BC18后表现的抗病症状不同。Col-0生态型接种后表现免疫,Ws-0生态型接种后则出现过敏性坏死斑点。 2.试验对3个拟南芥生态型的细胞组织形态进行显微观察,比较在3个拟南芥生态型的叶片上,病菌的萌发、侵入及扩展的情况,获得了拟南芥Col-0和Ws-0生态型抗灰葡萄孢以及Ler生态型感灰葡萄孢的细胞学证据。同时,试验通过比较拟南芥抗病生态型Ws-0和感病生态型Ler接种灰葡萄孢后寄主防御酶系活性和非酶类物质丙二醛的含量变化,探讨了防御酶系和非酶类物质与拟南芥抗灰葡萄孢侵染的关系。确定了POD、CAT、PPO和PAL活性及MDA含量与拟南芥对灰葡萄孢的抗性密切相关:SOD活性与拟南芥对灰葡萄孢的抗性关系不密切。 3.本研究将抗灰葡萄孢拟南芥生态型Col-0与感病生态型Ler进行杂交,分析F_1和F_2代对灰葡萄孢的抗病表现,确定了拟南芥对灰葡萄孢的抗性受2个基因控制。应用图位克隆技术,确定了与2个抗病基因连锁的分子标记,将抗灰葡萄孢基因(暂命名为BC1和BC2)分别定位于拟南芥第4染色体和第5染色体上。BC1位于CCR1和DHS1之间,分别与CCR1和DHS1相距1.2cM和1.6cM;BC2位于CA72/NGA151和NGA106之间,分别与CA72/NGA151和NGA106相距1.4cM和2.4cM。 4.利用抑制性消减杂交(SSH)技术,获得拟南芥不同生态型接种灰葡萄孢后基因表达的差异cDNA片段。同源性分析表明,接种灰葡萄孢后,诱导了一些与转录、膜内外物质转移、蛋白合成、信号转导等有关的基因表达,并有可能启动多种调控机制,尤其是转录过程中的调控。片段AM-2含有GAF保守区域,与组氨酸激酶传感器有较高的同源性,与拟南芥的乙烯信号转导有关,因此初步判断AM-2序列可能与
杨淑华, 王台, 钱前, 王小菁, 左建儒[4]2016年在《2015年中国植物科学若干领域重要研究进展》文中研究指明2015年中国植物科学研究处于飞速发展的态势,主要表现在中国植物生命科学家在国际顶级学术刊物发表文章的数量呈现出明显的优势。中国科学家在植物学诸多领域取得了骄人的成果,如高等植物PSI与捕光天线的超分子复合物晶体结构的解析、水稻感知和耐受寒害机制、乙烯信号转导分子机制研究等。2015年中国生命科学领域十大进展中,植物科学领域有两项成果入选。值得一提的是,中国本土科学家因青蒿素的发现与抗疟疾药物新疗法的开创首次获得自然科学领域的诺贝尔奖,标志着中国植物化学和中药学对人类健康事业的巨大贡献受到国际高度关注,也标志着中国科学家围绕国家重大需求开展科学技术问题研究模式的有效性和影响力。中国植物科学从跟踪、并行,逐渐迈入领跑学科发展的方阵。该文对2015年中国本土植物科学若干领域取得的重要研究成果进行了概括性评述,旨在全面追踪当前中国植物科学领域发展的最新前沿和热点事件,并与国内读者分享我国科学家所取得的杰出成就。
沈国新[5]2005年在《拟南芥蛋白质的互作机制及桑树同源基因功能的研究》文中提出植物学的研究已进入后基因组时代。基因组测序计划鉴定出大量的有待明确其功能的基因。一项研究蛋白质互作作图的重要技术是酵母双杂系统。这项技术的应用,需要一系列酵母菌及大肠杆菌转化,而后在营养缺陷型培养基上筛选阳性克隆。该技术1989年问世,在短短的10余年时间内,已成了研究蛋白质互作的重要手段,并揭示了生命体内大量的蛋白质互作关系。 拟南芥基因AtCHIP是一个与动物(人类、老鼠)基因CHIP有相似结构、功能和非常高的碱基同源性的植物基因,被证明是E3结合蛋白酶,参与泛素-蛋白酶体系的蛋白质降解作用。AtCHIP表现出与植物逆境胁迫如高温、低温、高盐的应答有关。为进一步探索AtCHIP的功能及其机理。本文以AtCHIP为研究对象,利用酵母双杂系统,从拟南芥cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质,从而进一步研究了其互作基因的功能。研究得到了以下主要结果。 1.利用酵母双杂技术,筛选得到了1036个与AtCHIP有互作的候选克隆,经营养缺陷型培养基筛选,共获得了111个阳性克隆,对质粒DNA进行了测序,测序结果提交拟南芥genebank分析,有29种蛋白与AtCHIP有相互作用(同源性达98%以上),有12种基因序列未在genebank中找到同源序列,可能为新的拟南芥基因。AtCHIP互作蛋白中重复频率最高的有UBC家属酶蛋白,Htransporting ATP synthesizing chain 9,叶绿体蛋白酶等。 2.证实了AtCHIP与缀合酶E2及泛素分子有专一性的互作关系。在已经被证实的40种拟南芥缀合酶E2中,UBC8、UBC9和UBC10 3种与AtCHIP有互作关系;同样,在已发现的15种泛素分子中,UBQ1、UBQ5二种与AtCHIP有互作关系。证明AtCHIP的这种互作关系是一种特导性的反应。 3.生物体外试验证实叶绿体蛋白酶Clpe4,FtSH1是以AtCHIP为E3的泛素-蛋白酶体系的底物。首先,利用PET系统,成功地表达了AtCHIP,UBC8,ClpP4等3个基因的蛋白质,并加以提纯。以此为材料进行了泛素化体外反应试验,以AtCHIP为E3,UBC8为E2,ClpP4为底物的体外反应试验结果表明,至少有3个泛素分子被结合到ClpP4分子上。 4.生物体内分子生物学检测(Western Blot)也证实ClpP4,FtSH1是AtCHIP
王志平[6]2017年在《植物基因组和碱基编辑工具箱的创制及功能验证》文中提出对于生命规律的探究很大程度上依赖于基因功能的阐释,而全基因组测序及基因组学的发展使得对强大的基因组编辑工具的需求更为迫切。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以其设计原理简单、技术门槛低、操作便捷、通用性强等特点在2013年初迅速成为基因组编辑研究领域的关注焦点。为了测试CRISPR/Cas9在植物中的应用效果,建立全面的CRISPR/Cas9工具系统,助力植物基因功能的研究,加快对植物功能基因的挖掘,本研究工作首先基于CRISPR/Cas9技术创制了植物的基因组编辑工具箱,涵盖各种双元载体和sgRNA模板载体以及相应的sgRNA组装方法。工具箱包括适用于双子叶植物的双元载体pHSE401、pBSE401、pKSE401和适用于单子叶植物的双元载体pHUE411、pBUE411。通过在玉米和拟南芥中对CRISPR/Cas9工具箱进行功能验证,证明该CRISPR/Cas9工具箱在双子叶和单子叶植物中均能高效诱导基因组编辑,因此可为相关研究人员提供更为简单、便捷的工具平台,实现高效的突变体创制目的。在应用CRISPR/Cas9工具时,我们发现以胚性愈伤为转化受体的单子叶植物玉米可以在T0代高效产生纯合或双等位突变体,但转化方法最简单高效的模式植物拟南芥的T1代突变体却存在严重的嵌合现象,影响了突变传递到下一代的效率。我们猜测转基因T1代嵌合体的形成可能是与使用的CaMV 35S等组成型启动子在卵细胞或者单细胞期胚中的活性较低有关。为此,本研究采用卵细胞特异性启动子驱动Cas9,创制了卵细胞特异性表达的CRISPR/Cas9系统,即EPC(egg cell-specific promoter-controlled)CRISPR/Cas9 系统,接着对EPC CRISPR/Cas9 进行了功能测试,结果表明使用该系统在拟南芥的转基因T1代成功地实现了两基因(CHLI1 CHLI2)和叁基因(TRY CPC ETC2)的纯合突变,解决了CRISPR/Cas9技术在拟南芥中应用时遇到的T1代突变体嵌合严重的问题。上述叁基因和两基因同时发生纯合或双等位突变的的株系占相应的全部T1代转基因植株的比例可以分别达到8.3%和13.1%。通过对叁种启动子(EC1.2p/35Sp/EC1.1p)和两种终止子(E9t/Nost)进行组合,比较相应载体的打靶效率发现,Cas9终止子的选择对于EPC CRISPR/Cas9发挥作用至关重要。此外,为了进一步提高EPCCRISPR/Cas9系统的基因打靶效率,采用启动子融合策略对EPC CRISPR/Cas9系统进行了优化尝试。通过尝试不同的增强子与EC1.2或Ec1.1的启动子进行融合,发现将EC1.2的增强子与EC1.1的启动子融合后显着提高了EPC CRISPR/Cas9系统对靶基因的纯合突变效率(17.0%),达到了优化的目的。CRISPR/Cas9和胞嘧啶脱氨酶介导的碱基编辑系统,最先在动物中得到成功应用。为了测试碱基编辑系统在植物中的应用效果,本研究创制了一个适用于双子叶植物(pHSE901、pBSE901、pKSE901、pHEE901)和单子叶植物(pHUE911、pBUE911)的碱基编辑工具箱并在拟南芥中进行了测试。通过对T1代和T2代靶基因AtALS的编辑效果分析发现,在T1代得到靶基因编辑的株系占全部株系的1.7%(4/240);在T1代得到编辑的靶点可以高效地传递到T2代,其中叁个T1株系的T2代植株中,获得除草剂抗性的碱基编辑植株的平均比例达84.1%。此外,研究结果提示在植物中,PAM区可能是一个新型的"脱氨酶作用窗口"。总之,本研究中建立的植物基因组编辑和碱基编辑系统无论在基础理论研究还是作物改良中都有很好的应用前景。
孙玉燕[7]2012年在《利用拟南芥BOUNTIFUL和HARDY基因以及表皮蜡质合成基因提高番茄耐旱和耐盐性》文中指出全球气候环境的极端变化，特别是干旱频繁发生和土壤盐渍化逐年加剧，导致粮食作物大幅减产。为应对未来的双重压力，人们采用基因工程对作物进行遗传改良，基因工程不仅省时省力，且避免了遗传连锁累赘；可将多个抗逆基因快速聚合，为作物遗传改良提供了一条有效的途径。番茄（Solanum lycopersicum）作为一种重要的蔬菜作物，在人们的日常生活中发挥着重要作用。然而，多数栽培种番茄对干旱敏感，对盐中度敏感。本研究通过农杆菌介导法将BOUNTIFUL和HARDY转入番茄,并对转基因番茄进行耐旱耐盐鉴定，为番茄的耐旱耐盐遗传改良奠定基础；另外，对SHN1、CER6、CER1、WAX24个表皮相关基因的转基因番茄自交后代进行了耐旱和耐盐性鉴定，并接种灰霉（Botrytis cinera）和晚疫（Phytophthora infestans）病病菌，验证表皮和蜡质改变对生物和非生物胁迫的响应。主要研究内容和结果如下：1.将拟南芥BOUNTIFUL通过农杆菌介导法转入番茄栽培种Moneymaker和M82中。转基因植株具有株型紧凑、植株挺立、叶片丛生具皱、叶片变小和变厚的表型。转基因植株的叶片表皮细胞面积增大。通过GUS染色、PCR、RT-PCR、Southern blot，证明BOUNTIFUL已整合到番茄基因组中并表达。对获得的转基因植株进行耐旱和耐盐性鉴定，在干旱胁迫下，Moneymaker转基因植株的存活率、植株水分含量和生长参数比野生型均有显着提高；M82转基因植株的存活率和水分含量在一次干旱胁迫下比野生型有显着提高，大部分生长参数与野生型没有差异，叁次干旱胁迫下，M82转基因植株的存活率、水分含量和生长参数与野生型没有差异。盐胁迫下，M82转基因植株的存活率、水分含量和生长参数均比野生型显着提高；Moneymaker转基因植株的存活率、植株水分含量和大部分生长参数与野生型没有差异。所以转BOUNTIFUL基因的耐旱耐盐性表现为基因型依赖性。2. HARDY，拟南芥AP2/ERF转录因子。通过农杆菌介导法转到番茄栽培种Moneymaker，并进行分子检测和耐旱、耐盐性鉴定。通过PCR、RT-PCR、Southern blot证明，HARDY已整合到番茄基因组中并表达。干旱胁迫下，转基因植株的存活率、植株水分含量和生长参数均与野生型存在显着差异；盐胁迫下，转基因植株的存活率比野生型提高，水分含量和生长参数与野生型却无差异。3.将获得的BOUNTIFUL植株和HARDY植株杂交，获得BFL+HRD二价植株，并进行耐旱和耐盐性鉴定。BFL+HRD二价转基因植株的耐旱性比野生型Moneymaker有显着提高，但提高水平不如单价转基因植株。250mM NaCl胁迫下，二价转基因植株的存活率和一些生长参数均高于野生型Moneymaker；在300mM NaCl胁迫下，存活率和生长参数与野生型Moneymaker无差异。4.对SHN1、CER6、CER1、WAX24个表皮相关基因的番茄自交后代接种B. cinerea和P. infestans，并进行耐旱和耐盐性鉴定。转基因植株侵染P. infestans后的DI与对照没有差异，LS比野生型显着降低。转基因植株对B. cinerea的抗性降低，DI和LS均比野生型显着增加。盐胁迫下，转基因植株的存活率和生长参数均比野生型有显着提高；干旱胁迫下，转基因植株的抗性比较复杂，这可能与基因本身的功能有关。
吴伟[8]2010年在《大豆端粒相关序列的克隆、比较与染色体定位研究》文中研究说明端粒相关序列(telomere associated sequence)具有种属间的特异性,可以作为研究和定位染色体末端的标记。本文采用9个端粒重复序列单引物对栽培大豆、半野生大豆和野生大豆进行端粒相关序列的PCR扩增,其中7个引物可以扩增出大小不同的特异性DNA片段。拟南芥型端粒引物扩增得到的PCR产物条带清晰,具有较好的重复性和稳定性。将扩增得到DNA测序,并对序列进行了生物信息学分析和染色体定位研究。本研究克隆了STAS-1452、STAS-1246、STAS-853、STAS-716、STAS-574、STAS-403和STAS-379共7个DNA序列。生物信息学分析发现:STAS-1452、STAS-853、STAS-574、STAS-403和STAS-379具有大豆端粒相关序列的特性,blastn分析结果表明上述序列与GenBank中的大豆端粒相关序列相似性较高,与其它物种的端粒相关序列相似性较低,存在不同拷贝数的拟南芥端粒重复单元和大量发生了碱基突变的重复单元,多数序列中存在着不同拷贝数的串联重复;而STAS-716和STAS-1246与GenBank上的大豆端粒相关序列不具有相似性,STAS-716序列内部仅有一个拷贝的拟南芥端粒重复单元,未出现其它物种类型的端粒重复单元,而STAS-1246中未见拟南芥类型和其它物种类型的端粒重复单元,亦不存在串联重复。染色体定位的结果表明:叁种类型大豆共有的STAS-574位于Williams 82大豆基因组3号染色体的近末端,而STAS-1452、STAS-853、STAS-403和STAS-379序列中的不同大小的片段分别位于大豆基因组不同染色体的近末端。STAS-716和STAS-1246序列中不同大小的片段分别位于大豆基因组不同染色体的中部、近中部或近末端区域。本文通过叁种类型大豆端粒相关序列的克隆、比较与染色体定位研究,有助于了解大豆染色体末端的进化过程,完成大豆分子遗传学与细胞遗传学图谱的整合。
李泽卿[9]2017年在《二球悬铃木花发育基因PaAP3、PaPI和PaSTK启动子的克隆、功能分析及其在不育中的应用》文中提出二球悬铃木(Platanus acerifolia)是我国城市绿化中最为重要的物种之一。其冠大荫浓、生长迅速、适应性较强、具有净化空气的能力,被人们称之为行道树之王。二球悬铃木被广泛种植于全球的各个城市,在园林建设中占据不可替代的作用。然而,二球悬铃木果实成熟之后裂果所带来的毛絮,严重影响到了城市的环境和人们的身心健康。近些年来,有很多的科研工作者在突变育种、枝条修剪等方面做了很多的研究,但都没能从根本上解决二球悬铃木落果飞毛的问题。随着植物分子生物学技术的发展,尤其是在利用基因工程创造不育植株中取得了很大的突破,为培育无球二球悬铃木带来了新的希望。自ABC模型提出以来,研究人员对花器官发育的基因调控网络做了深入分析,使花发育相关的研究从形态描述及生理层次,深入到了分子调节水平。随着对二球悬铃木开花相关基因的克隆,对其成花机理的了解也越来越透彻。深入了解这些花器官形成基因的调控机理,可以更好地将这些遗传资源应用到二球悬铃木等园林植物的育种中。本课题以二球悬铃木为实验材料,采用了TAIL-PCR的方法分离了二球悬铃木中花发育B类两个基因的启动子序列,采用生物信息、启动子截短、GUS蛋白染色和表达分析等手段,研究了启动子的表达活性和部位。后期采用启动子驱动毒性基因BARNASE的办法,获得了不开花的烟草转化植株。同时本课题还克隆了D类STK基因和其启动子,并对其功能和表达特征做了分析。通过本课题的研究更深入的了解了二球悬铃木花发育相关基因的规律,也为通过基因工程的方法改良二球悬铃木品种获得不育植株奠定了基础。主要的研究结果如下:1、选取了二球悬铃木花发育相关B类同源基因AP3和PI为对象,根据已知的CDS序列,采用TAIL-PCR的方法,分离克隆这两个基因起始密码子上游的序列。通过构建中间载体测序等方法验证后,利用生物信息学的手段对启动子进行了顺式元件预测。分析发现,PaAP3启动子(pPaAP3)与PaPI启动子(pPaPI)序列除了含有核心启动子序列外,还含有一些组织特异性元件,例如开花相关的MADS家族基因和干细胞决定基因WUS等作用位点。推测这些启动子很有可能具有组织特异性表达的特点。2、根据启动子顺式元件预测结果,将两个启动子截短成不同长度片段(pPaAP3-p1至pPaAP3-p8,pPaPI-p1至pPaPI-p5),分别驱动GUS基因构建表达载体转化烟草。通过启动子截短加组织化学染色的方法,发现PaAP3启动子在2900bp片段(pPaAP3-p8)驱动下,GUS基因表达较强,在花四轮器官中均有表达,且在营养组织茎和叶中均有一定量的表达。而PaPI启动子则在2800 bp长度时(pPaPI-P5)具有最高的表达量与最好的组织特异性,其表达主要集中在花瓣、雄蕊和雌蕊中,营养器官叶片中仅有极微量的表达,茎中则有一定的表达。后续又通过RT-PCR的方法证实了GUS蛋白染色结果。该结果显示,启动子pPaAP3和pPaPI均具有启动基因表达的作用,但基于PaAP3与PaPI两个基因的表达模式不一样,启动子pPaPI更适合用于遗传改良中不育材料的创建。3、结合启动子缺失和GUS蛋白染色实验结果,分别选择了pPaAP3-p8和pPaPI-p5两个不同长度的片段分别融合BARNASE基因,转化烟草。结果显示pPaAP3-p8::BARNASE的烟草转化植株中,仅有少量阳性植株能存活至开花期,且存活烟草均不能产生正常形态的花蕾,植株顶端分生组织出现褐化枯萎。pPaPI-p5::BARNASE的烟草转化植株营养生长正常且侧枝增多,最终能形成畸形花,但形成花蕾相对对照晚60d左右,且花器官缺失内叁轮,仅残留萼片,败育花蕾早期脱落。RT-PCR结果显示,BARNASE基因在pPaPI-p5::BARNASE植株非生殖器官中的表达要低于pPaAP3-p8::BARNASE转化植株。这些结果和GUS蛋白染色分析结果一致,显示启动子pPaPI可能更适合用于创建二球悬铃木不育植株。4、采用保守区段扩增,结合RACE技术手段克隆了二球悬铃木中D类STK基因(PaSTK)。研究了PaSTK基因的保守区段,比较了PaSTK基因与其它物种中同源基因的差异,分析了它在物种进化中的地位。并利用qPCR研究STK基因在二球悬铃木不同组织中的表达量分析,发现其在4月份雌花序与6月份球果中有显着性的上调表达,而在营养组织和其他时期的花序,球果中表达量较低。该研究为更好了解雌雄异花木本植物的开花分子机理奠定基础。5、与克隆B类基因启动子采用类似的方法,根据克隆到的PaSTK基因信息,采用TAIL-PCR的方法,分离克隆该基因起始密码子上游的启动子序列(pPaSTK)。然后将该启动子驱动GUS基因转化拟南芥。结果表明,GUS蛋白在所有营养器官与花四轮器官中均没有表达或极低量表达,而在拟南芥种子和果荚中则有大量表达。将该启动子融合BARNASE基因转化拟南芥,发现转化植株营养生长不受影响,能形成正常的花朵与荚果,解剖发现荚果仅有外层表皮,没有种子发育形成。该研究证实pPaSTK仅在胚珠中启动基因表达,同样能够应用于基因工程构建二球悬铃木不育系。
陈晓婷[10]2008年在《拟南芥与草酸互作的分子机制研究》文中指出许多在生态、生理学上不同的真菌都可以产生草酸(Oxalic acid, OA)。这些草酸产生菌如核盘菌、灰葡萄孢等寄主范围广泛,可以引致上百种植物病害,造成世界范围的粮油、蔬菜等农作物的严重减产。草酸在病菌致病过程中可能起着关键性的作用。因此研究植物对草酸产生菌的防卫机制,挖掘抗病资源,提高农作物抗性,是急需解决的重要科学问题,也是生产上首先要解决的实践问题。拟南芥具有基因组小、结构简单、形体小、生长周期短、繁殖系数高、自花授粉、基因组序列已知、与高等植物的基因组间有较高同源性等特点,是研究植物防御机制的良好模式植物。因此本论文着眼于拟南芥与草酸的互作机制的研究。分为叁部分:1.通过筛选草酸抗性突变体,并对突变体进行分子分析。最终目的是分离草酸抗性基因来获得作物的菌核病抗性,从而减少农药的使用,提高环境的质量和食品安全;2.草酸可以通过氧化与脱羧两条途径降解,本研究从枯草芽孢杆菌中克隆草酸脱羧酶,从大麦中克隆草酸氧化酶,构建其植物表达载体,转化拟南芥,对转基因植株进行菌核病抗性分析;3.对草酸胁迫下拟南芥全基因表达谱和microRNA的差异表达谱进行分析,进一步明了草酸致病的分子机制,为草酸产生菌的生物防治提供理论基础。获得的主要结果如下:1.通过拟南芥Col-0的浓度梯度的实验,确定了筛选草酸抗性突变体的筛选压为1.2mmol/L OA;建立并优化了草酸抗性突变体的筛选体系;2.通过对中国科学院遗传与发育生物学研究所左健儒实验室构建的化学诱导型功能获得和缺失性突变体库(公开释放的6,000余个突变体)进行两代的筛选,得到5株草酸抗性增强突变体,并通过TAIL-PCR扩增获得T-DNA插入的侧翼序列;BLAST结果显示这5株突变体中有4株突变体(D630、D282、D154、D74)均插在At5g10450的第一个内含子上,并且验证了At5g10450基因的SALK T-DNA插入缺失突变体的SALK_068774(插入位点为外显子)的纯合体并没有草酸抗性。D33突变体插入位点为At2g39720和At2g39730两个基因间区;3.半定量RT-PCR表明D33突变体的At2g39690、At2g39700、At2g39720及At2g39750表达上调;4.构建了At2g39690,At2g39700和At2g39720的过表达载体,进行了拟南芥浸花转化,将对转基因植株进行菌核病抗性和草酸抗性分析;5.对突变体分别进行了核盘菌的离体叶片接种和活体接种,发现无论是离体接种还是活体接种,突变体都比野生型植株更抗菌核病。说明通过筛选草酸抗性突变体来筛选抗菌核的材料是可行的。有可能通过分离草酸抗性基因来获得作物的菌核病抗性,从而减少农药的使用,提高环境的质量和食品安全;6.从枯草芽孢杆菌Bs168中克隆了草酸脱羧酶基因(Yvrk),从大麦中克隆了草酸氧化酶基因(Y14203)并构建了植物表达载体,对拟南芥进行转化,获得了转基因植株。转草酸脱羧酶的拟南芥植株表现出对核盘菌的抗性,这为草酸产生菌的生物防治提供了一条新途径;7.首次利用拟南芥全基因组Oligo芯片研究草酸胁迫下差异基因表达谱。通过对两张生物学重复的表达谱芯片数据的生物信息学分析表明:草酸胁迫诱导了拟南芥的JA/ET途径,而不是SA途径。此外,苯丙烷代谢途径、WRKY转录因子家族、细胞色素P450家族、ABC转运蛋白、热激蛋白基因家族上调表达,表明这些途径或基因家族参与了拟南芥对草酸的抗性反应。8.首次利用拟南芥microRNA芯片研究草酸胁迫下microRNA差异基因表达谱。获得叁个差异表达microRNA和9个差异表达的Predicted_miRNA。其中下调表达的小立碗藓Ppt-miR1211,根据miRU找到一个最匹配的靶mRNA是一个萜烯合成酶(At3g14520);另一下调表达的毛果杨Ptc-miR3991 (与Ath-miR399b同源),对应的靶mRNA是一个泛素连接酶(At2g33770);这两个靶基因在表达谱芯片中的Ratio值都上调。上调表达的Ath-miR858有叁个靶mRNA,分别为At2g47460(转录因子)、At3g08500(转录因子)、At3g20310(ethylene responsive element- binding family protein),它们在表达谱芯片中对应的Ratio值都分别下调。说明microRNA对其靶mRNA确有负调控功能。
参考文献：
[1]. 利用拟南芥遗传资源构建植物人工染色体[D]. 孙砚. 华中农业大学. 2003
[2]. 2012年中国植物科学若干领域重要研究进展[J]. 钱前, 瞿礼嘉, 袁明, 王小菁, 杨维才. 植物学报. 2013
[3]. 拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析[D]. 邢继红. 河北农业大学. 2006
[4]. 2015年中国植物科学若干领域重要研究进展[J]. 杨淑华, 王台, 钱前, 王小菁, 左建儒. 植物学报. 2016
[5]. 拟南芥蛋白质的互作机制及桑树同源基因功能的研究[D]. 沈国新. 浙江大学. 2005
[6]. 植物基因组和碱基编辑工具箱的创制及功能验证[D]. 王志平. 中国农业大学. 2017
[7]. 利用拟南芥BOUNTIFUL和HARDY基因以及表皮蜡质合成基因提高番茄耐旱和耐盐性[D]. 孙玉燕. 中国农业科学院. 2012
[8]. 大豆端粒相关序列的克隆、比较与染色体定位研究[D]. 吴伟. 河北科技师范学院. 2010
[9]. 二球悬铃木花发育基因PaAP3、PaPI和PaSTK启动子的克隆、功能分析及其在不育中的应用[D]. 李泽卿. 华中农业大学. 2017
[10]. 拟南芥与草酸互作的分子机制研究[D]. 陈晓婷. 福建农林大学. 2008
标签：生物学论文; 拟南芥论文; 启动子论文; 转基因植物论文; 基因合成论文; 人类染色体论文; 突变理论论文; 基因组论文; 基因工程论文; 悬铃木论文;