芦珂(雅安职业技术学院药学检验系四川雅安625000)
【摘要】目的：为血吸虫病预防和控制中制造抗原、研究血吸虫病致病机理和相关药物研发创造良好的基础，研究取得较高生物活性的日本血吸虫卵的分离方法与活性鉴定措施。方法：将被血吸虫感染的肝脏组织悬液进行分级过滤，然后将滤液离心，去除碎片，再以325目分样筛过滤分离的虫卵，收集筛上的虫卵，将收集到的虫卵以密度为1.070的Percoll分离液进行梯度离心，吸取Percoll液下层的纯化虫卵，用显微镜观察其纯度，用丫啶橙染色检查分离虫卵的死活，用环卵沉淀试验检查分离虫卵的分泌活性。结果：每块肝脏均能获得0.6克左右的虫卵，且分离出的虫卵纯度较高，环卵沉淀试验结果和丫啶橙染色结果均显示分离出的活虫卵比例较高、生物活性较好。结论：该日本血吸虫卵分离法用时较短，操作简且效果较好，所分离出的虫卵完全能够满足研究需要。
【关键词】日本血吸虫卵分离活性鉴定
【中图分类号】R446【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2013）03-0300-01
血吸虫卵是血吸虫病传播的重要媒介，因此，控制传染源是从源头上治疗血吸虫病的根本途径，而无论是相关实验研究还是现场对策制定，都需要分离高浓度和生物活性的完整血吸虫卵。当前血吸虫卵分离方式较多，但绝大多数方式操作都十分繁琐，且血吸虫卵的有效分离率偏低，虫卵的纯度、成熟卵比率与分泌活性均比较低。本次研究利用尾蚴是血吸虫生活史中感染人体和保虫宿主的重要阶段，用被尾蚴感染了的肝脏组织分离虫卵，在总结以前办法的基础上对日本血吸虫卵的分离方式做了一定的简化与改善，取得了较为理想的效果，现报告如下。
1材料与方法
1.1一般材料倒置荧光显微镜和光学显微镜（日本奥林巴斯公司生产），多种口径的样品筛（河南安平筛网厂生产）、组织捣碎机（上海标本模型厂生产），吖啶橙（美国Amersco公司生产）、Percoll细胞分离液（美国Pharmacia公司生产）、NaCl，尾蚴感染钉螺。
1.2分离方法
1.2.1感染模型将被日本血吸虫感染的阳性钉螺置于25℃的去氯水中，光照2小时，逸出尾蚴，用接种环将尾蚴挑出，移至玻璃片上，并在解剖镜下计数，固定好肝脏标本，将含有尾蚴的玻璃片覆盖其上，保持20分钟，每块肝脏感染血吸虫尾蚴约2000条。
1.2.2虫卵分离将感染肝淹没于生理盐水放冰箱冷藏室浸泡24小时，去除肝内胆管、大血管和结缔组织，将其剪为碎块，置于组织捣碎机中，加入浓度1.2%的NaCl约1/2，先低速匀浆1分钟，再分两次高速匀浆，每次30s，两次间隔3—5分，防止温度过高。将匀浆液经过80、100、120样品筛，同时以浓度1.2%的盐水冲洗筛网，收集自然沉降滤液40分钟，弃上清，再以定量盐水稀释重悬，弃上清，最后将所得沉淀物治愈硬质玻璃管2000r/分离心。去除组织碎片和上层液体，剩余黄色底层虫卵，以浓度1.2%盐水重悬并合并各个离心管中的虫卵，重复离心并去除上层残渣，将初步分离的虫卵经325目样品筛去除细小残渣，收集筛上虫卵。
1.2.3虫卵纯化配置浓度1.07的Percoll分离液并加入玻璃试管，将上部收集的虫卵以0.9%浓度盐水重悬，覆盖与Percoll液上层，3000r/分离心20分钟，吸取最底层虫卵悬液，以1.2%浓度NaCl洗涤三次。
1.2.4吖啶橙染色取少量纯化后的虫卵，置入0.5ml吖啶橙溶液中，置于37℃保温箱内染色120分钟，以PH值7.4的PBS洗涤两次，置于载玻片上，以盖玻片覆盖并在荧光显微镜下观察。
1.2.5环卵沉淀滴两滴血吸虫感染的血清于载玻片，取100虫卵置于其中混合均匀，以盖玻片覆盖，石蜡密封，置37℃湿盒孵育48小时，于显微镜下观察结果。
2结果
两块被血吸虫感染的肝脏共分离出1.2g左右的血吸虫卵，经样品筛过滤、离心后，初成品中含有较多组织碎片与杂质，但经Percoll液纯化后血吸虫卵纯度更高，且出少量虫卵碎片外几乎无组织碎片和杂志，说明密度1.07的Percoll液在梯度离心后能够收集纯度极好的虫卵。
核酸活性鉴定：吖啶橙染色结果为所有血吸虫卵均显示红色、绿色荧光，证明所有虫卵均含丰富而有活性的DNA、RNA，虫卵内核酸未被降解。分泌活性鉴定：COPT结果表明血吸虫卵周围均出现形态不一、大小不等的免疫复合物沉淀。
3讨论
目前，分离血吸虫卵的方式有很多，最常见的是将肝组织匀浆过筛后离心，该方式操作简单，但获得的虫卵杂质较多，只能用于对纯度要求不高的实验，有学者试图通过多次过筛来提高其纯度，但笔者亲自试验证实多次过筛并不能有效提高其纯度，且会损失较多的虫卵，操作也相对复杂。本次研究结果显示，利用Percoll液来提取高纯度日本血吸虫卵用时较短，操作简且效果较好，所分离出的虫卵完全能够满足研究需要，能够为制造抗原，研究血吸虫病致病机理和相关药物研发，创造良好的基础。
参考文献
[1]张萃,陈晓军,朱继峰,迟莹,温小云,贺蕾,周莎,刘丰,苏川.日本血吸虫可溶性成虫抗原和虫卵抗原对CD4—+T淋巴细胞凋亡和细胞周期的影响[J].中国血吸虫病防治杂志.2010(01)：13-16.
[2]姜旭淦,傅行礼,陈盛霞,徐会娟,帅连云,曹建平,仇锦波.日本血吸虫成虫和虫卵可溶性抗原及其组分抗原的研究[J].江苏大学学报(医学版).2007(01)：19-22+56.