郭继东[1]2004年在《NMDA受体甘氨酸位点的调制参与脊髓和前扣带皮层痛觉信息整合》文中研究说明N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体包含多个激动剂结合位点及调制位点,受体离子通道的开放需要谷氨酸和甘氨酸位点同时被占据,因此,甘氨酸位点被称为协同激动剂(co-agonist)位点。甘氨酸位点是否饱和是一个争论已久的问题。一方面,细胞外液中含有高浓度的甘氨酸,许多研究表明甘氨酸位点激动剂不能增强NMDA受体功能,认为甘氨酸位点被饱和。另一方面,有研究发现突触部位甘氨酸浓度受到特异性转运系统的调节,低于饱和甘氨酸位点所需的水平;而且,许多在体和离体实验显示,甘氨酸位点激动剂可以增强NMDA受体介导的神经功能。NMDA受体广泛参与痛觉信息的传递与加工,包括对痛刺激的感觉分辨和痛情绪反应过程。脊髓NMDA受体参与痛觉信息传递,介导组织损伤或炎症后的脊髓中枢敏化;前扣带皮层(anterior cingulate cortex, ACC)是痛情绪反应的关键部位,ACC内的NMDA受体参与介导痛厌恶情绪的形成。D型丝氨酸(D-serine,D-ser),星形胶质细胞合成的一种D型氨基酸,可能是NMDA受体甘氨酸位点的内源性配基。本研究旨在阐明D-ser在脊髓背角及前扣带皮层对NMDA受体的调
姚永兴[2]2008年在《突触蛋白Homer1b/c介导病理性疼痛的脊髓和皮层机制》文中研究说明疼痛是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的,人类共有而个体差异很大的不愉快的主观感觉和情感体验。疼痛提供机体受到威胁的警报信号,同时也给患者带来痛苦。疼痛按时程可以分为急性疼痛和慢性疼痛。各种原因引起的慢性疼痛是导致劳动力丧失的重要原因。在过去的几十年中,从外周到中枢,对疼痛及其机制的研究取得了长足的进展,发现了一些新的药物作用靶点,并且开发了多种用于治疗的药物。但是,仍有大量病人时刻遭受着疼痛的折磨。前扣带皮层(anteior cingulate cortex,ACC)是边缘系统的重要组成部分。ACC接受来自皮层下多种信息的传入又可恒定地被外周伤害性刺激所激活,成为近年来疼痛研究的热点区域。研究表明ACC不仅参与痛情绪的形成,还对疼痛感觉有调节作用。但是,外周伤害性刺激的持续传入使ACC产生可塑性变化的分子机制,仍然知之甚少。研究认为,中枢突触功能的重塑是疼痛慢性化的重要机制。谷氨酸及其受体系统是介导伤害性信息传递和突触重塑最重要的递质/受体系统。突触后致密物(postsynaptic density,PSD)是新近在谷氨酸能突触后膜中发现的一种特殊结构。PSD中的多种蛋白质,能够在突触水平对谷氨酸受体进行募集整合。Homerlb/c是PSD家族的一员,最近研究发现Homerlb/c与慢性疼痛的发生有关,但未有进一步的研究报道。在慢性疼痛的研究中,完全弗氏佐剂(CFA)致大鼠慢性单关节炎模型(MA)和大鼠坐骨神经慢性缩窄(chronic constriction injury,CCI)模型是两种广泛应用的慢性痛模型,良好地模拟了人类慢性疼痛所表现的自发痛和刺激诱发痛等现象。本研究应用动物行为学、免疫组织化学、免疫沉淀和共沉淀、以及Western-Blot等方法,在大鼠关节炎和坐骨神经慢性缩窄模型上探讨了突触蛋白Homerlb/c在介导慢性疼痛发生发展中的可能作用及其机制,为研究慢性疼痛的发病机理及寻找有效的药物靶位,提供实验依据。本实验分为叁个部分:1.在大鼠关节炎和坐骨神经慢性缩窄模型上,应用免疫组织化学、免疫沉淀和共沉淀等方法,检测了脊髓背角以及前扣带皮层(ACC)Homerlb/c的表达以及Homerlb/c与另一种突触蛋白PSD-95的相互作用;2.应用动物疼痛指标测定的方法,观察了鞘内注射Homerlb/c反义寡核苷酸对关节炎大鼠机械痛敏和热痛敏的影响;3.应用免疫组织化学染色,在大鼠鞘内注射Homerlb/c反义寡核苷酸后,观察Homerlb/c在脊髓背角Fos表达和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化中的作用。结果发现:1.Homerlb/c在脊髓背角的表达特征与其他PSD蛋白的表达方式相似,Homerlb/c阳性细胞主要集中在脊髓背角浅层,在其他层次只看到很浅的免疫反应阳性信号。在高倍镜下观察,Homerlb/c免疫反应阳性物位于细胞膜,细胞呈圆形或椭圆形。免疫印迹结果发现,Homerlb/c在大鼠脊髓背角有较高表达,而脊髓腹角未检测到信号。2.CFA致炎后,大鼠脊髓背角Homerlb/c的表达增加在CFA致炎后,大鼠脊髓背角Homerlb/c的表达呈单侧性增加,大鼠脊髓背角Homerlb/c和PSD-95的共沉淀增加。而PSD-95的表达未见增加。相反,在炎症的基础上,对大鼠踝关节施加强制曲伸的急性刺激(retrival)后,PSD-95的表达减少。3.在CFA致炎后,大鼠ACC Homerlb/c和PSD-95表达以及相互作用发生变化大鼠在CFA致炎后,对侧ACC Homerlb/c和PSD-95表达增加;对侧ACCHomerlb/c和PSD-95的共沉淀增加。该结果说明,在慢性疼痛状态下,突触后膜信号蛋白的相互作用加强。4.Homerlb/c参与神经病理性疼痛的维持与先前研究结果一致,大鼠坐骨神经慢性缩窄性损伤(CCI)后,损伤同侧脊髓背角Homerlb/c表达增加;我们同时发现,损伤对侧ACC部位Homerlb/c和PSD-95的共沉淀增加。说明Homerlb/c同样参与神经病理性疼痛的维持。5.抑制Homerlb/c的表达对MA大鼠的痛敏反应有减轻作用鞘内应用Homerlb/c反义寡核苷酸(10μg/10μl),每日1次,连续4天,抑制大鼠脊髓背角Homerlb/c的表达的同时,减轻了炎症痛大鼠对机械刺激和热刺激的痛敏反应。这种作用具有剂量依赖性。6.鞘内给予Homerlb/c反义寡核苷酸(ODN)对大鼠急性疼痛和运动功能无影响鞘内给予错义寡核苷酸(10μg/10μl)或反义寡核苷酸(10μg/10μl),连续4天,测定机械和热刺激反应阈值。结果发现,与给药前比较,反义寡核苷酸对正常动物的机械缩足反射阈值(PWT)和热缩足反射潜伏期(PWL)无显着影响。对大鼠后肢的回缩,抓握功能以及整体动物的翻正反射评分显示,鞘内给予Homerlb/c反义寡核苷酸(ODN)对大鼠运动功能无影响。7.Homerlb/c介导初级中枢伤害性感受免疫组化结果显示,鞘内应用Homerlb/c反义寡核苷酸,10μg/10μl,每日1次,连续4天,减轻了MA大鼠对伤害性刺激后,脊髓背角Fos蛋白的表达和CREB的磷酸化。该结果表明,Homerlb/c介导慢性疼痛时,初级中枢伤害性感受的信号转导,以及下游的突触功能的重塑。由以上结果得出如下结论:1.脊髓背角和前扣带皮层Homerlb/c参与了慢性炎症性疼痛和神经病理性疼痛的维持;2.慢性疼痛状态下,脊髓Homerlb/c介导初级中枢伤害性感受信号的转导和基因转录;3.前扣带皮层(ACC)PSD蛋白的变化可能是高级中枢参与慢性疼痛调制的分子机制。
何雨芩[3]2015年在《PKCγ/P2X3介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制》文中认为背景及目的创伤后应激障碍(PTSD)是指个体经历异乎寻常突发威胁性或灾难性创伤应激事件,导致延迟出现及慢性持续存在的生理、心理障碍。PTSD主要表现为病理性重现,即持续重复体验创伤事件的经历、高度的警觉性、反应麻木与情感淡漠及逃避回忆等特征性症候群。PTSD病程慢性延续,严重影响患者的心理社会功能及生活质量。因时代特点突发应激事件高发,特别是官兵面临现代高技术战争挑战的新形势下,PTSD的发病率呈日渐增加趋势。PTSD伴发病、共病多且难治。PTSD与疼痛发生及痛觉敏化/去敏化的形成有密切的关系。PTSD样应激状态下内脏痛觉敏化/去敏感化关联疾病,如PTSD后肠易激综合征(IBS)、膀胱疼痛综合征的发生率呈上升趋势。PTSD样应激可能是IBS内脏痛敏触发、加重的重要因素。既往有关PTSD样应激状态下痛觉敏化/去敏感的研究主要聚焦于大脑的下丘脑、海马、杏仁核、内侧前额叶皮质和前扣带等,但目前以单纯的下丘脑-垂体-肾上腺轴应激理论为靶点开发的药物疗效欠佳。为此,寻找新的有效的治疗靶点有十分重要的价值。新近有研究提示脊髓及背根神经节(DRG)在应激相关的内脏痛觉敏化/去敏化的形成和维持中亦发挥了重要作用,且应激状态下脊髓中枢水平敏化和外周DRG水平敏化的研究逐渐成该研究领域的热点。迄今为止,尚不清楚PTSD样应激状态下内脏敏感改变-痛觉敏化/去敏感的确切分子机制及防治措施。嘌呤核苷酸P2受体亚型3(P2X3)高度选择性地表达于中、小直径DRG神经元中,蛋白激酶Cγ亚型(PKCγ)主要分布于脊髓背的Ⅱ层内侧部及Ⅲ层的交界处。诸多研究证实,PKCγ/P2X3在DRG和脊髓水平介导了疼痛信号的传导及其痛觉敏化的过程。PKCγ在静息时无活性,当受到外界刺激后神经元内Ca2+浓度增加,PKC发生转位而被激活;而PKCγ的激活引起通道电容的改变、多种兴奋性神经递质的释放、疼痛相关受体激活的级联放大效应。既往采用神经病理性痛、炎症性、癌性痛等研究发现,脊髓背角PKCγ的表达明显升高,鞘内给予PKC特异性阻断剂GF109203X可逆转痛觉敏化现象,而在PKCγ基因敲除小鼠未观察到痛觉敏化的发生。既往亦发现P2X3参与了多种痛觉敏化/去敏化的发生,如在神经痛、炎性痛、骨癌痛大鼠模型DRG神经元P2X3表达明显增加,其介导的ATP激活的门控通道电流显着增强;应用P2X3受体激动剂α,β-me ATP可诱导痛觉敏化,而P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP可逆转痛觉敏化,基因敲除鼠的P2X3受体其痛觉反应性降低。另有研究证实,PKCγ/P2X3之间存在相互作用,共同调控痛觉敏化/去敏化的形成。P2X3受体的结构上N末端与PKC结合后,可导致PKC磷酸化;改变P2X3受体上的PKC结合位点或采用PKC抑制剂阻断其作用后,可减少α,β-me ATP诱发的P2X3受体内向电流;PKC的活化可使DRG上α,β-me ATP诱发的P2X3受体电流增加。根据上述理论基础,我们推测:PKCγ/P2X3介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用及机制。旨在为PTSD样应激状态下痛觉敏化/去敏化的临床防治提供新的思路,希望对各种应激事件后PTSD痛觉敏感性改变相关疾病的有效干预提供重要的理论依据。方法1.选用健康成年SD雌性大鼠,采用连续单一应激(SPS)联合足底电击建立PTSD样应激状态下内脏敏感性改变的动物模型;2.采用结直肠扩张(CRD)-VMR和AWR评估正常对照组、PTSD术后1、6、7、9、14、21、28、29天时内脏敏感性改变/痛行为学变化;3.采用免疫荧光漂染技术联合激光共聚焦显微技术、Western blot技术研究DRG中P2X3及脊髓背角PKCγ表达水平的动态变化;4.采用鞘内注射PKCγ阻断剂GF109203X和P2X3受体阻断剂TNP-ATP方法,观察GF109203X和TNP-ATP分别对PTSD大鼠内脏敏感性/痛行为学的影响;5.采用全细胞膜片钳技术研究PTSD样应激状态下DRG神经元上P2X3受体电生理特性的改变,及TNP-ATP的抑制作用。结果第一部分PTSD样应激状态下VMR和AWR的动态变化采用CRD-VMR和AWR评估正常对照组、PTSD术后1、6、7、9、14、21、28、29天时内脏敏感性改变。在40、60mm Hg压力下行CRD时PTSD术后1天组其曲线下面积(AUCVMR)值和AWR值明显低于正常对照组,PTSD术后6天组AUCVMR值和AWR值逐渐恢复至正常水平。然而在PTSD术后7天组,在40、60mm Hg压力下时AUCVMR值和AWR值明显升高,并且持续到PTSD术后28天,在PTSD术后9天时AUCVMR值和AWR值达到高峰。在PTSD术后29天组其AUCVMR值和AWR值恢复至正常。第二部分PKCγ在脊髓中枢水平介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制1.PTSD样应激状态下脊髓背角PKCγ表达的动态变化采用免疫荧光漂染/激光共聚焦显微技术/Western blot技术研究发现:PKCγ阳性产物主要分布于脊髓背角Ⅱ、Ⅲ层。PTSD术后1天组的大鼠PKCγ蛋白的平均荧光强度值(AOD)和Western blot的相对光密度值(ROD)低于正常对照组,PTSD术后6天时表达水平与正常对照组无差异。在PTSD术后7天开始明显升高,第9天时到高峰,且一直持续至28天,差异有统计学意义。其后在PTSD术后29天PKCγ表达开始降低。2.在PTSD样应激状态下鞘内注射不同浓度梯度的PKCγ阻断剂GF109203X对内脏敏感性/痛行为学的影响PKCγ的表达在PTSD术后9天时达到高峰,故选择在PTSD术后9天行鞘内注射PKCγ特异性阻断剂GF109203X,观察不同浓度梯度的GF109203X对大鼠内脏敏感性/痛行为学的影响。结果显示,在PTSD术后9天时鞘内注射低浓度的GF109203X(0.05-0.15 nmol/10μL)时,其AUCVMR和AWR的值与空白对照组没有显着差别。鞘内注射0.30 nmol/10μL浓度的GF109203X在40 mm Hg水平压力下行CRD时其AUCVMR值和AWR的值降低,但在60mm Hg水平压力下其AUCVMR值和AWR的值与空白对照组没有显着差异。然而鞘内注射0.50 nmol/10μL浓度的GF109203X在40、60mm Hg水平压力下行CRD时其AUCVMR值和AWR的值均呈现显着降低,在PTSD术后7、14、21、28天分别鞘内注射0.50 nmol/10μL浓度的GF109203X可以观察到其AUCVMR和AWR的值与空白对照组比较明显降低,这表明GF109203X在0.50nmol/10μL的浓度时可完全抑制PTSD样应激状态下的内脏高敏感现象。第叁部分P2X3在外周水平介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制1.PTSD样应激状态下DRG上P2X3表达的动态变化P2X3高度选择性地表达于与伤害性感受和痛觉有关的中、小直径DRG神经元中。我们对正常对照组,PTSD术后1、6、7、14、21天组大鼠的DRG行免疫荧光染色发现:PTSD术后1天组的大鼠P2X3的AOD值低于正常对照组,PTSD术后6天时表达水平与正常对照组无差异。在PTSD术后7、14和21天时与正常对照组比较均明显升高差异有统计学意义,其中在PTSD术后第7天时达到高峰。的影响2.PTSD样应激状态下P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP对内脏敏感性/痛行为学因为前面实验提示P2X3的表达在PTSD术后7天时达到高峰,故选择在PTSD术后7天行鞘内注射TNP-ATP。在PTSD术后7天行CRD扩张前10分钟时,鞘内注射TNP-ATP其AUCVMR值和AWR值在40 mm Hg和60 mm Hg可显着降低,与PTSD术后7天对照组比较。3.在PTSD样应激状态下大鼠DRG上P2X3受体电生理特性的变化,α,β-me ATP诱发的P2X3内向电流的改变及P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP的抑制作用α,β-me ATP作用于大鼠DRG神经元后可引起Iα,β-me ATP的内向电流。与正常对照组比较,PTSD术后7天组,α,β-me ATP可使DRG神经元P2X3受体介导的内向电流幅度明显增强,而选择性P2X3受体拮抗剂TNP-ATP可完全抑制其诱发的内向电流,经5分钟洗脱后TNP-ATP的阻断可完全恢复。结论1.采用SPS联合足底电击的方法成功建立了PTSD内脏敏感性改变-痛觉敏化/去敏化的动物模型;PTSD样应激状态下内脏敏感性/痛行为学的发生了动态变化,PTSD样应激对VMR和AWR有明显的影响;2.PKCγ在脊髓中枢水平介导了PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制,PTSD样应激状态下脊髓背角PKCγ表达发生了动态变化,鞘内注射PKCγ阻断剂GF109203X可抑制PTSD内脏高敏感性形成,并发挥抗内脏伤害性刺激的镇痛效应;3.P2X3在外周DRG水平介导了PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制;PTSD样应激状态下DRG上P2X3表达发生了动态变化,P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP减轻内脏敏感性/痛行为学反应;在PTSD样应激状态下大鼠DRG上P2X3受体电生理特性的发生了变化。
参考文献：
[1]. NMDA受体甘氨酸位点的调制参与脊髓和前扣带皮层痛觉信息整合[D]. 郭继东. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2004
[2]. 突触蛋白Homer1b/c介导病理性疼痛的脊髓和皮层机制[D]. 姚永兴. 复旦大学. 2008
[3]. PKCγ/P2X3介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制[D]. 何雨芩. 第叁军医大学. 2015
标签：生物学论文; 氨基乙酸论文; 鞘内注射论文; 突触传递论文; 脊髓论文; 应激障碍论文; 内脏神经论文; 基因位点论文; 慢性疼痛论文; 对照组论文; ptsd论文;