梁鑫[1]2004年在《波尔山羊精子体外获能及体外受精的研究》文中进行了进一步梳理本试验就国内近些年来引进的波尔山羊进行了精子体外获能和体外受精的研究，利用去透明带仓鼠卵穿透试验和台盼蓝-姬姆萨双重顶体染色(TG)技术检测了精子的死活和获能效果，同时将获能的精子与体外培养成熟的屠宰山羊卵母细胞和超排山羊卵母细胞进行了体外受精试验。 在获能液中孵育2～3h后，部分精子呈超激活运动方式，表现为激烈的穿梭运动和“鞭打样”运动。由此可以初步确认精子开始或已经获能。 精子用离心法和上游法处理后的顶体反应率和活力表明，上游法更有利于波尔山羊精子的处理。洗涤后的精子放入含有20μg／ml肝素的T液(含6mg／mlBSA+10mmol／L HEPES)、B液(含2mg／ml BSA+5mmol／L HEPES)、D液(无BSA和HEPES)叁种培养液中进行获能处理，结果表明T液处理波尔山羊精子的效果明显优于B液和D液，精子孵育4～6h的顶体反应率T组极显着高于D、B组(P＜0.01)。从培养液对精子的保护效果来看，培养6h后，T组活力下降缓慢，优于D、B组。无论那种培养液，精子获能4h和6h的效果优于4h以前的获能效果，差异极显着(P＜0.01)，而这两个时间段之间差异不显着(P＞0.05)。 无论是从顶体反应率还是从穿透率上看，肝素的添加剂量以20μg／ml和50μg／ml的效果较好，与20μg／ml以下肝素组的效果相比差异极显着(P＜0.01)，这两个水平之间效果差异不显着(P＞0.05)。钙离子载体的添加剂量以0.3μmol／L为宜，顶体反应率和去透明带仓鼠穿透率均高于其它剂量组。咖啡因与肝素、钙离子载体具有协同作用，尤其与钙离子载体的协同作用更加明显，去透明带仓鼠卵穿透率达到78.3％。 无论是肝素还是钙离子载体，获能精子与去透明带仓鼠卵孵育4h和6h的穿透率均高于2h时的穿透率。经肝素诱导的获能精子与山羊成熟卵母细胞进行体外受精的适宜时间为17h，时间短时精卵未完全结合，时间长则对受精卵的进一步发育不利。超排山羊卵母细胞的受精率略高于体外培养成熟的屠宰山羊卵母细胞。 山羊的冻精比较脆弱，获能后活力急剧下降。从顶体反应率来看，鲜精的获能效果明显优于冻精，二者差异极显着(P＜0.01)。
斛智莲[2]2001年在《波尔山羊精子体外获能及获能前后超微结构的变化》文中指出本文就国内新引进的波尔山羊精子体外获能及获能前后超微结构的变化进行研究。获能处理前先进行活精子分离，然后按实验之需，用含有肝素的培养液获能处理，获能结束后用溶血磷脂酰胆碱（LC）诱导顶体反应，TG染色法测得有顶体反应的活精子作为评价精子获能的指标。肝素添加剂量设5个水平，即0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml；处理时间分4h、3h、2h、1h、15min5个水平；LC处理时间设0min、3min、6min、9min、12min、15min、20min7个水平。电镜样品用常规方法固定、脱水、包埋、聚合，LKB-2088V切片机切片，铀铅片染，JEM-100XII观察，拍照。 结果表明：叁种培养液中，从获能效果、精子活力和活精子百分率来考虑，S培养液效果最好，4h的顶体反应率达60.88％，与D、B培养液的获能效果相比，差异极显着（P＜0.01），获能4h和6h的效果差异不显着（P＞0.05）；肝素的添加剂量以15μg/ml和20μg/ml的效果最好，与其它处理组的效果相比差异显着（P＜0.05），但这两个水平间的效果差异不显着（P＞0.05）；LC诱导顶体反应的时间在15min时效果极显着高于15min以下处理组的效果（P＜0.01）。羊精子的超微结构与其它哺乳动物的类似，分头、颈、尾叁部分。头部主要由细胞核构成，含有遗传物质；颈部脆弱，尾部易从此脱落；尾部由中段、主段和末段组成。精子获能后，顶体质膜膨胀、断裂和丢失；顶体外膜囊泡化，进而顶体内膜裸露。
周佳勃[3]2003年在《山羊体外受精和显微受精及相关问题的研究》文中认为山羊作为一种经济动物，具有生长速度快，适应能力强、分布范围广等特点。但是，我国现有的山羊品种生产性能相对较低。为增加山羊养殖的效益，进一步推动我国山羊良种化的进程，需要用人工输精、体外受精和胚胎移植等技术来加快山羊育种进程。本实验使用屠宰场获得的山羊卵巢卵母细胞体外成熟后的进行体外受精和显微受精，研究体外受精和显微受精中的影响因素和相关问题，达到为生产和山羊胚胎发育研究提供大量优质廉价的胚胎的目的。还对山羊精液液态保存的机理、稀释液配方和保存的程序进行了研究。 结果表明： 1、山羊精子在mDM液中38.5℃、肝素浓度为50μg／ml、获能45分钟获能效果最好。在获能过程中单层输卵管上皮细胞有助于提高获能和体外受精效果。 2、体外受精中不同公羊之间在受精率和桑椹胚／囊胚率上都有显着差异。 3、附睾尾和鲜精的受精能力没有显着差异。山羊精子只有经过附睾以后才获得受精能力。 4、扩展良好的山羊卵巢卵母细胞的受精率和胚胎发育能力显着高于卵丘扩展差的卵母细胞。受精前去掉山羊卵丘或者去掉部分卵丘对受精率没有显着影响，但是受精前完全去掉卵丘对于胚胎的后续发育有明显影响。 5、山羊附睾不同部位精子通过ICSI技术都可以正常受精并能支持早期胚胎发育，但在带下注射时附睾头和附睾体的精子受精和胚胎发育均显着低于附睾尾精子。 6、山羊死亡精子通过ICSI技术可以受精并发育，但是随死亡时间延长受精和发育能力下降。 7、低浓度的(0.0005％)TritonX—100处理的精子有助于提高ICSI的受精率和发育率。 8、A23187和Inomycin／6-DMAP都能显着提高ICSI注射后卵母细胞的受精率、卵裂率和桑椹胚／囊胚发育率，而且在山羊Inomycin／6-DMAP的激活作用效果与A23187的激活作用效果没有显着差异。 9、用0.3M的蔗糖处理是一种优选山羊MⅡ期卵母细胞的有效方法。 10、在15℃山羊精液液态保存稀释液保存效果顺序：ANDROHEP＞H-M199＞ZORLESCO＞mTyrode＞BTS＞M2＞mDPBS＞Tris-柠檬酸钠液。山羊精液液态保存稀释后的降温速度为3—24min／℃效果较好。不同温度下的山羊精液液态保存效果依次为5℃＞15℃＞20℃＞25℃＞38.5℃。在5℃山羊精液稀释倍数5—10倍液态保存的效果最好。山羊精液液态保存稀释液添加卵黄有助于保存，但是必须排除精浆的副作用。
姬云涛[4]2003年在《安格斯牛除精浆冷冻精液效果的研究》文中研究表明用安格斯牛精液为实验材料，采用两步稀释法，在稀释前分别以脱脂乳-卵柠液和生理盐水为洗涤液，以离心法去除精浆，然后计算精子活率和测定精浆中酶的活性，观察精子顶体状态并分析其超微结构，用仓鼠进行穿卵试验，以探讨除精浆对安格斯牛精子冷冻保存效果的影响，并对其发生的机理进行分析。试验共分四组：生理盐水除精浆组、脱脂乳-卵柠液除精浆组、离心不除精浆组及常规冷冻组。分别对稀释后、平衡后和解冻后叁个阶段进行比较，结果表明： 1．以生理盐水和脱脂乳-卵柠液为离心洗涤剂除精浆的两个试验组，解冻后精子活率分别为0.493±0.043和0.497±0.067。Ⅰ类顶体率分别为(78.3±2.7)％和(78.7±2.8)％，精子畸形率分别是(6.35±0.72)％和(6.32±0.57)％。这两组之间这几项指标差异不显着(P＞0.05)，说明用生理盐水和脱脂乳-卵柠液为离心洗涤剂除精浆对精子品质无显着影响(P＞0.05)。而未除精浆的另两组，离心与非离心组解冻后精子活率分别为0.312±0.053和0.313±0.062，Ⅰ类顶体率分别为(58.7±2.9)％和(58.9±2.9)％，精子畸形率分别是(9.42±0.38)％和(9.39±0.82)％。这两组之间这几项指标差异也不显着(P＞0.05)，说明离心对牛精子品质无明显影响(P＞0.05)。而除精浆的两组与未除精浆的两组之间上述指标存在显着或极显着差异(P＜0.05；P＜0.01)，表明去除精浆对解冻后牛精液品质有显着提高。 2．经过稀释、降温和平衡以及冷冻等处理过程，除精浆的两个试验组精液的精浆中GOT和LDH的活性逐渐上升，并在稀释后达到一个较高值，分别为(72.17±3.29)IU/ml和(71.98±4.05)IU/ml、(284.1±31.4)IU/ml和(281.9±45.1)IU/ml。而未除精浆的两组在稀释后没有出现较高值，分别是(52.45±5.18)IU/ml和(51.83±7.01)IU/ml、(208.7±23.6)IU/ml和(206.9±39.2)IU/ml。表明除精浆增强了精子膜的通透性。从平衡到解冻后，除精浆的两组GOT和LDH活性与未除精浆的两组相比较，增加的幅度明显的缓慢。在解冻后各试验组的GOT和LDH活性无显着差异。这可能是由于除精浆降低了冷冻过程中对精子膜有损伤作用成分的原因。 3．电镜观察发现，离心洗涤处理使冷冻前精子质膜有轻微扩张。除精浆处理没有对冷冻前精子膜造成形态上明显影响；而冷冻后，未除精浆造成了精子的严重损害，出现了类似顶体反应的退行性变化，精子顶体肿胀破裂，内容物丢失，线粒体鞘受损。除精浆精子，从整体上观察所受损伤程度明显减少。除精浆处理明显增强了精子的耐冻性。4.用去透明带仓鼠卵受精试验检测冻后精子受精能力，除精浆的两个试验组精子穿卵率可达(8 4.5士7.8)%和(85.1士6.2)%。而未除精浆的两组精子穿卵率仅为(70.4士12.3)%和(71.1士9.7)%。前两组与后两组差异显着(P<0.05)。除精浆的两组卵内平均精子数为(2 .93士0.35)个和(2 .91士0.59)个，未除精浆的两组为(1.58士0.43)个和(l .70士0.81)个，前两组与后两组也存在明显的差异(P<0.05)，本实验结果表明除精浆可以显着提高冻后精子受精能力。
胡日查[5]2004年在《稀释液中添加胆固醇对山羊精液冷冻过程中胆固醇磷脂的影响》文中研究指明本研究采用Duck—Chong的方法及胆固醇测定终点法分别测定了山羊精液冷冻各处理步骤中磷脂、胆固醇的含量，以期通过C/P值的变化判断其获能的可能性，并研究了在稀释液中添加胆固醇对山羊冷冻精液的影响，以提高山羊精液冷冻后的受胎率。用Tris型稀释液冷冻山羊精液效果良好，解冻后对照组精子平均活率达46.99%，最高活率58%。胆固醇的添加对精子解冻后活率无影响，主要影响平衡解冻时期部分脱落和全部脱落顶体的百分率，但由于数据尚少，有待于进一步研究。对照组鲜精、稀释、平衡及冷冻解冻过程中精子内磷脂的含量分别为404.86、423.74、383.27、333.39 nmol/109精子，变化不显着（P>0.05）。胆固醇含量分别为246.21、190.35、141.91、111.00 nmol/109精子。只有平衡和解冻后差异不显着（P>0.05），其它均显着(P<0.05)。稀释液中胆固醇的添加对各处理步骤精子中胆固醇的含量没有显着影响，而在平衡和解冻过程对磷脂的含量有显着影响。叁组间胆固醇磷脂比无显着差异(P>0.05)。在冷冻解冻过程中，稀释液中卵黄没有影响到精子内磷脂的含量，而精子内胆固醇含量下降也没有因为胆固醇的添加而受到影响。
郑云胜[6]2008年在《LDL和PCS对羊精子冷冻效果及脂类含量的影响》文中研究表明由于山羊和绵羊的冷冻精液输精后受精率低于自然交配,在生产中还没有推广。山羊和绵羊冷冻精液受精率低的原因之一可能是在冷冻过程中精子的胆固醇流失,过早获能造成的。因此,本研究以绒山羊和内蒙古细毛羊为实验动物,用卵黄稀释液稀释精液,分析冷冻后精子中胆固醇和磷脂的变化,在此基础上,用低密度脂蛋白(LDL)代替卵黄,添加胆固醇硫酸脂(PCS),研究在冷冻过程中LDL和PCS对精子胆固醇的保护作用及对精子的活力、膜完整率和顶体完整率的影响,结果如下。1.用卵黄稀释液进行山羊和绵羊精液冷冻保存,冷冻后,山羊和绵羊精子胆固醇含量分别从鲜精的230.33nmol/109精子下降到175.33和从234.54 nmol/109精子下降到163.76;山羊和绵羊精子的磷脂含量在鲜精和冷冻-解冻后分别为443.33、461.66和431.61、449.18nmol/109精子;山羊和绵羊精子胆固醇与磷脂的比例(c/p)分别从鲜精的0.5211和0.54下降到冷冻-解冻后的0.3796和0.36。2.在稀释液中以LDL替代卵黄后,可以维持精液冷冻过程中山羊精子的胆固醇含量和胆固醇与磷脂的比例,能提高冷冻—解冻后山羊精子的活率、质膜完整率和顶体完整率。因此,LDL可以替代卵黄作为山羊精液冷冻的保护剂。LDL的添加量以9gLDL/100ml对精子的保护作用最好。3.在稀释液中以LDL替代卵黄后,可以维持精液冷冻过程中精子的胆固醇含量和胆固醇与磷脂的比例,提高冷冻后精子的活率。而在质膜和顶体方面,与卵黄相似。因此,LDL可以作为绵羊精液冷冻的保护剂,保护效果较卵黄好,LDL在稀释液中的添加量以9gLDL/100ml为宜。4.在LDL稀释液中添加PCS,可提高冷冻后山羊精子胆固醇与磷脂的比值,可进一步提高山羊精液冷冻后精子的活力和质膜完整率,而对精子顶体无不良影响。5.在卵黄稀释液中添加PCS可提高山羊精子冷冻后的磷脂含量,避免山羊精子在冷冻过程中胆固醇的流失,维持冷冻过程中精子胆固醇与磷脂的比例,提高精子活率、精子质膜完整率和精子顶体完整率(I型顶体),可以作为山羊精液冷冻稀释液的成分。添加量以0.10gPCS/100ml为宜。6.在LDL稀释液中添加PCS对绵羊精子在冷冻过程中精子磷脂含量、精子质膜和顶体完整率影响不大,不利于精子的活率,但可提高精子胆固醇含量和胆固醇与磷脂的比例。7.在卵黄稀释液中添加PCS可提高绵羊精子冷冻后磷脂含量,保持精子胆固醇的含量,维持精子的胆固醇与磷脂的比例,提高精子活率、精子的质膜完整率和精子顶体完整率。在卵黄稀释液中添加PCS,有利于提高绵羊精液的冷冻保存效果。
参考文献：
[1]. 波尔山羊精子体外获能及体外受精的研究[D]. 梁鑫. 四川农业大学. 2004
[2]. 波尔山羊精子体外获能及获能前后超微结构的变化[D]. 斛智莲. 山西农业大学. 2001
[3]. 山羊体外受精和显微受精及相关问题的研究[D]. 周佳勃. 东北农业大学. 2003
[4]. 安格斯牛除精浆冷冻精液效果的研究[D]. 姬云涛. 西北农林科技大学. 2003
[5]. 稀释液中添加胆固醇对山羊精液冷冻过程中胆固醇磷脂的影响[D]. 胡日查. 内蒙古农业大学. 2004
[6]. LDL和PCS对羊精子冷冻效果及脂类含量的影响[D]. 郑云胜. 内蒙古农业大学. 2008
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