翼手目动物短波长敏感视色素的分子进化及功能研究

论文摘要

蝙蝠隶属于翼手目（Chiroptera）,是哺乳动物中的第二大类群。蝙蝠属于夜行性动物,传统分类中的小蝙蝠拥有回声定位能力,它们主要是靠回声定位进行捕食和辨别方向,而有些蝙蝠就没有回声定位能力而是靠视觉和嗅觉来寻找食物和辨别方向。有研究认为蝙蝠是能够看到紫外光的,然而,目前针对于蝙蝠能够看到紫外光的研究仅局限于相关理论研究和一些电生理实验,并没有进行体外功能实验的验证。此外,还有研究报道,一些洞栖型果蝠由于长期栖息在黑暗无光的洞穴中导致SWS1基因发生缺失。有趣的是,使用恒频回声定位的蝙蝠则是由于视觉与回声定位能力之间发生感官代偿,导致SWS1基因缺失。因此,本论文对部分蝙蝠的SWS1视色素进行了体外功能验证并对使用恒频回声定位的帕氏髯蝠（Pteronotus parnellii）SWS1基因的进化进行了研究。本论文的第一部分是蝙蝠紫外视觉的分子进化研究与功能验证。首先,我们选择了占据不同生态位的11种蝙蝠,对它们的SWS1基因进行扩增和测序。有趣的是,在进行测序结果分析时,发现普通吸血蝠（Desmodus rotundus）和白翼吸血蝠（Diaemus youngi）的SWS1基因已经变为假基因。为了研究其他蝙蝠的SWS1基因在整个哺乳动物进化过程中的选择压力,我们共选择了81种哺乳动物的SWS1基因序列进行选择性压力分析,结果表明八种现存蝙蝠的SWS1基因在其进化过程中非常保守。除此之外,本研究还对八种现存的蝙蝠物种及其祖先的SWS1视色素进行了体外功能验证,实验结果表明,它们的SWS1视色素均对紫外光敏感,最大吸收波长(λmax)范围为357nm-359nm。以上结果表明紫外视觉对部分蝙蝠物种具有重要作用,但对另一部分物种已不重要。本论文的第二部分对P.parnellii的SWS1视色素功能进行了研究。首先,将本课题组两个P.parnellii个体的Cytb基因并进行扩增和序列比对,最终确认这两个P.parnellii个体分别属于P.mexicanus和P.sp1两个物种。随后我们扩增了这两个个体的SWS1基因序列,结果发现它们的SWS1基因编码区序列完整。我们接下来对髯蝠SWS1基因在进化过程中受到的选择压力进行了分析。结果表明,与其他哺乳动物以及其他使用斜频回声定位的髯蝠相比,使用恒频回声定位的P.mexicanus、P.sp1及帕氏髯蝠物种复合体祖先的SWS1基因均趋于中性进化。体外功能实验结果表明,帕氏髯蝠物种复合体祖先与灰髯蝠的SWS1视色素均对紫外光敏感,最大吸收波长均为357nm,而使用恒频回声定位的P.mexicanus与P.sp1的SWS1视色素则无光谱吸收功能,说明它们的SWS1视色素功能在进化过程中发生了独立丧失。随后,我们对P.mexicanus SWS1视蛋白的表达进行了验证。我们通过Western blot和液相色谱-质谱联用仪进行蛋白表达测定,结果表明P.mexicanus的SWS1视色素表达,但是并没有功能。最后,为了阐明其功能丧失的分子机制,通过实验验证最终确定是由三个关键氨基酸替代所导致,分别是G6R、G83A和R314W。三个位点中任何一个位点突变就会导致P.mexicanus SWS1视色素功能丧失。将6、83和314位点同时进行反向突变可以恢复P.mexicanus SWS1视色素的功能。本论文通过对具有代表性的蝙蝠SWS1基因进行扩增和分析,并对其视色素进行功能验证,实验结果表明,紫外视觉在部分蝙蝠中具有非常重要的作用,但在另一些物种中丧失。另外,在P.mexicanus SWS1视蛋白功能的研究中发现,SWS1基因虽然存在的但是并没有功能。后续的研究发现,这是由于三个关键位点的氨基酸替代导致SWS1视色素功能丧失。因此,本研究结果表明SWS1基因存在并不能完全说明蝙蝠具有紫外视觉。

论文目录

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第一章前言

1.1 蝙蝠的概述

1.1.1 蝙蝠的起源

1.1.2 蝙蝠的分类

1.1.3 蝙蝠的感官概述

1.1.4 蝙蝠的食性

1.2 视蛋白的概述

1.2.1 非视觉系统中的视蛋白

1.2.2 视觉系统中的视蛋白

1.3 哺乳动物视觉的研究进展

1.3.1 哺乳动物的视觉研究

1.4 紫外视觉的研究进展

1.5 影响SWS1 视色素波长敏感性的机制

1.5.1 关键氨基酸位点对SWS1 视色素波长敏感性的影响

1.5.2 质子化对SWS1 视色素波长敏感性的影响

1.6 本研究的目的与意义

第二章蝙蝠紫外视觉的分子进化研究

第一节蝙蝠SWS1 基因序列的扩增

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 蝙蝠基因组DNA和总RNA提取结果

2.2.2 蝙蝠SWS1 基因PCR扩增引物

2.2.3 SWS1 基因PCR扩增及胶回收结果

2.2.4 阳性克隆选择

2.2.5 蝙蝠SWS1 氨基酸序列比对结果

2.2.6 吸血蝠SWS1 基因序列比对结果

2.3 小结

第二节蝙蝠SWS1 基因的进化分析

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 Clade Model C模型

2.2.2 滑动窗口分析

2.3 小结

第三节蝙蝠SWS1 视色素的体外表达

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 蝙蝠SWS1 视色素的表达和纯化

2.3 小结

2.4 讨论

第三章帕氏髯蝠SWS1 基因进化及分子机制研究

第一节物种鉴别及SWS1 基因序列扩增

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 P.parnellii物种鉴别结果

3.2.2 P.parnellii SWS1 基因扩增结果

3.3 小结

第二节髯蝠SWS1 基因的进化分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 髯蝠SWS1 基因系统发育树重建

3.2.2 枝模型结果分析

3.2.3 枝-位点模型结果分析

3.2.4 Clade model C模型结果分析

3.3 小结

第三节髯蝠SWS1 视色素的体外表达

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 髯蝠SWS1 视色素的纯化

3.3 小结

第四节 P.mexicanus SWS1 视蛋白的鉴定

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 重组质粒双酶切结果

3.2.2 p1D4 重组质粒转染结果

3.2.3 P.mexicanus SWS1 视色素的光谱敏感性

3.2.4 Western blot结果

3.2.5 LC-MS鉴定结果

3.3 小结

第五节 P.mexicanus SWS1 基因的定点突变及表达

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 序列比对结果

3.2.2 突变型SWS1 视蛋白功能测定结果

3.2.3 关键氨基酸位点

3.3 小结

3.4 讨论

第四章结论

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间发表学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李龙飞

导师: 刘洋

关键词: 蝙蝠,视色素,进化,分子机制

来源: 沈阳农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 沈阳农业大学

分类号: Q953

DOI: 10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000089

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