亚铁与细胞色素c间电子转移机制研究

论文摘要

微生物是地球表层生物地球化学过程的驱动力。微生物驱动的铁循环过程包括Fe（III）还原与Fe（II）氧化两个重要过程,与碳/氮/硫/重金属等元素的循环转化、污染物降解、岩石风化和土壤形成等过程密切相关。在整个微生物驱动的铁循环过程中,Fe（II）/Fe（III）通过其氧化还原状态变化与微生物的胞外电子发生相互作用。由于Fe（II）/Fe（III）的电位Eh较负,铁的形态极易受环境因素如pH、有机质等的影响,虽然这些因素对化学铁循环的影响研究已经非常深入,其对微生物驱动铁循环的影响仍不够清晰。铁矿由于其独特的半导体性质,在光催化的能源与环境领域已有广泛研究。近年来,研究者发现非光合微生物可以利用半导体矿物的光生电子实现自身生长,铁矿的半导体性质逐渐在微生物胞外电子传递领域逐渐引起了重视。虽然已有研究提出半导体矿物的导电性促进了铁还原菌的胞外电子传递过程,但是关于半导体铁矿是如何影响微生物亚铁氧化的机制仍不清楚。细胞色素c（Cytochrome c,c-Cyts）作为生物体电子传递链中的关键蛋白,其在铁呼吸菌的胞外电子传递功能也逐渐被证实。本论文以功能蛋白c-Cyts为模型蛋白,利用光谱及电化学等动力学和热力学方法研究不同Fe（II）形态对c-Cyts蛋白与Fe（II）间电子传递机制的影响,通过动力学模型分析定量评估不同形态铁（游离态、有机络合态、铁矿半导体）对c-Cyts与Fe（II）间电子传递机制的贡献,试图从化学及分子视角解析微生物氧化亚铁的电子传递机制,主要研究内容及结果如下:（1）游离态Fe（II）与细胞色素c蛋白的电子转移动力学及热力学机制研究。通过亚铁初始浓度、pH及离子强度等因素对c-Cyts与Fe（II）反应动力学的影响实验,结果发现c-Cyts的还原速率常数随着亚铁（5-1000μM）初始浓度的增加而增加,这是因为Fe（II）/Fe（III）的氧化还原电位随着Fe（II）浓度的增加而降低。而c-Cyts的还原速率常数随着pH（5.5-8.0）的增加而增加。一方面,电化学测试说明了这是由于Fe2+的还原能力随着pH的提高而显著增加。另一方面,光谱电化学结果表明c-Cyts的还原程度与pH极度相关,这表明了H+参与了c-Cyts的还原过程。因此,pH的影响可以归因于H+参与了Fe2+与c-Cyts的反应。离子强度的影响实验结果显示,c-Cyts的还原速率常数随着NaCl的浓度增加而降低。并且通过其动力学速率常数与Fe（II）物种的浓度和活度做相关性分析,发现不同离子强度下Fe2+活度是影响反应动力学的重要因素。本研究结果为厌氧状态下酶催化亚铁氧化过程与机制提供了分子尺度的新视角。（2）有机络合态Fe（II）与细胞色素c蛋白间电子传递机制及其贡献。由于环境中大量有机质的存在,络合态Fe（II）/Fe（III）也是亚铁氧化微生物获取的重要能量来源,本研究仍以c-Cyts蛋白为模型蛋白研究了6种不同有机配体对c-Cyts与Fe（II）反应的影响。实验结果表明,有机配体的存在显著加速了c-Cyts和Fe（II）之间的反应,通过Minteq软件分析,结果发现Fe（II）与有机配体的络合常数越大,有机配体态Fe（II）的含量越高,c-Cyts与Fe（II）反应的动力学速率越大。通过Kintek动力学模型软件获得了体系中各Fe（II）形态与c-Cyts反应的速率常数。通过Fe（II）配体的络合常数与c-Cyts和Fe（II）的反应速率常数的相关性分析,结果发现表观反应速率常数(kapp)与Fe（II）配体之间的络合常数、及c-Cyts和Fe（II）L物种（L代表―配体‖）反应的速率常数都密切相关。并且配体的结构越相似,其相关性越高。通过循环伏安（CV）实验获得Fe（II）络合物的氧化还原电位（中点电位）结果表明,具有相似结构配体的Fe（II）络合物,其氧化还原电位与络合常数呈正相关。说明氧化还原电位并不是影响Fe（II）络合物与c-Cyts反应动力学的主要因素,而进一步的反应重组能分析发现,由于不同配体结构引起电子转移的反应重组能变化比吉布斯自由能（ΔG）更能影响该反应动力学。本研究结果从配体的分子结构方面,解析了有机络合态Fe（II）与c-Cyts间电子传递的动力学及热力学机制,并通过动力学模型定量评估了有机络合态Fe（II）与c-Cyts间电子传递机制的贡献。（3）赤铁矿半导体介导的细胞色素c与Fe（II）间电子传递的机制及贡献。在赤铁矿存在的c-Cyts蛋白与Fe（II）的混合体系中,由于赤铁矿的表面吸附作用及独特的半导体性质,使得在该混合体系中,赤铁矿在c-Cyts与Fe（II）间电子传递的途径多样化。本研究中,我们设计了不同浓度赤铁矿对c-Cyts蛋白与Fe（II）间氧化还原反应及吸附反应的表观动力学实验,结果表明赤铁矿的加入使得c-Cyts的还原速率显著增加;且赤铁矿浓度越高,c-Cyts还原速率越大。通过吸附态c-Cyts或吸附态Fe（II）电位下测试赤铁矿电极在Fe2+或c-Cyts溶液中的It曲线测试及吸附态c-Cyts与矿物/电极间界面电子转移动力学实验结果表明,赤铁矿从电极传出或接受电子能力都有所增加。上述动力学结果说明赤铁矿介导并促进Fe（II）与c-Cyts间的电子转移过程。赤铁矿表面吸附态c-Cyts或Fe（II）的热力学电位测试结果表明,与游离态Fe（II）电位相比,吸附态Fe（II）的电位发生负移;而c-Cyts的电位几乎不变。通过Mott-Schottky曲线测试获得赤铁矿在吸附c-Cyts或Fe（II）前后赤铁矿表面空间电荷区能带的变化,结果发现,在Fe（II）和c-Cyts的存在下,赤铁矿的平带电位分别发生了负移和正移。Fe（II）存在下,赤铁矿表面的电子密度增加,而c-Cyts的存在下,表面电子密度有所降低,这导致了赤铁矿在空间电荷层发生了能带弯曲。通过上述c-Cyts、Fe（II）及赤铁矿各体系的热力学电位测试,提出了赤铁矿由于表面吸附Fe（II）和c-Cyts的不同表面电子密度而形成的内建电场加速并介导了Fe（II）到c-Cyts间电子转移过程。该结果从热力学方面提出并证实了赤铁矿半导体介导Fe（II）到c-Cyts的电子转移机制。不同半导体矿物对c-Cyts与Fe（II）反应体系的动力学及热力学实验结果表明,在非均相的混合体系中,不仅有半导体矿物介导c-Cyts与Fe（II）间电子传递机制,也存在半导体矿物表面吸附态Fe（II）与c-Cyts直接电子传递过程。最后通过动力学模型的建立,获得混合体系中赤铁矿体相介导c-Cyts与Fe（II）间电子传递速率常数及表面吸附态Fe（II）与c-Cyts的反应速率,都比游离态Fe（II）与c-Cyts反应速率常数高几个数量级。该结果通过动力学模型定量评估了赤铁矿半导体介导c-Cyts与Fe（II）电子转移机制的贡献。在无光厌氧条件下,赤铁矿导带介导的c-Cyts与Fe（II）的电子转移过程为自然体系中微生物与矿物相互作用的研究提供了新视角。

论文目录

摘要

abstract

第1章引言

1.1 铁的地球化学循环过程及意义

1.1.1 铁的来源及其形态分布

1.1.2 微生物铁循环的基本过程

1.1.3 铁循环的环境意义

1.2 细胞色素c参与的胞外电子转移

1.2.1 c-Cyts的结构及其研究方法

1.2.2 c-Cyts参与的铁还原电子传递过程

1.2.3 c-Cyts参与的亚铁氧化电子传递过程

1.3 微生物/蛋白与Fe（Ⅱ）间电子传递的影响因素

1.3.1 pH的影响

1.3.2 有机质的影响

1.4 半导体铁矿介导的微生物铁循环电子传递研究

1.4.1 铁矿物的结构及其半导体性质

1.4.2 半导体铁矿介导铁还原的电子传递过程

1.4.3 半导体铁矿与亚铁氧化微生物间的电子传递

1.4.4 c-Cyts蛋白与半导体铁矿间电子转移

1.5 本论文的研究目的、意义和主要内容

1.5.1 研究目的和意义

1.5.2 主要研究内容

第2章游离态Fe（Ⅱ）与细胞色素c反应的动力学与热力学机制

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 光谱动力学测试方法

2.2.3 光谱电化学测试方法

2.2.4 动力学与热力学计算方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 Fe（Ⅱ）与c-Cyts反应的光谱研究

2.3.2 初始Fe（Ⅱ）浓度的影响

2.3.3 不同pH的影响

2.3.4 离子强度的影响

2.3.5 酶催化亚铁氧化的意义

2.4 结论

第3章有机配体态Fe（Ⅱ）与细胞色素c的电子传递机制及贡献

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 动力学实验

3.2.3 电化学测试

3.2.4 动力学模型

3.3 结果与分析

3.3.1 配体对Fe（Ⅱ）还原c-Cyts动力学的影响

3.3.2 Fe（Ⅱ）-ligands还原c-Cyts的动力学模型

app)与配体态Fe（Ⅱ）络合常数的依赖性'> 3.3.3 表观反应速率常数(k_app)与配体态Fe（Ⅱ）络合常数的依赖性

app)与Fe（Ⅱ）L和 c-Cyts反应的依赖性'> 3.3.4 表观反应速率常数(k_app)与Fe（Ⅱ）L和 c-Cyts反应的依赖性

3.3.5 Fe（Ⅱ）L与 c-Cyts反应的热力学分析

3.4 结论

第4章铁矿物半导体介导的Fe（Ⅱ）与细胞色素c间电子传递机制及贡献

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 赤铁矿对Fe（Ⅱ）与c-Cyts反应的光谱动力学影响实验

4.2.3 赤铁矿的光生电子还原c-Cyts实验

4.2.4 荧光光谱测试

4.2.5 电化学测量

4.2.6 动力学模型

4.3 结果与讨论

4.3.1 赤铁矿Fe（Ⅱ）与c-Cyts反应动力学的影响

4.3.2 赤铁矿对表面吸附态c-Cyts和 Fe（Ⅱ）的热力学影响研究

4.3.3 吸附态Fe（Ⅱ）和c-Cyts对赤铁矿的热力学影响研究

4.3.4 赤铁矿的导带电子对c-Cyts的还原反应

4.3.5 赤铁矿导带介导的Fe（Ⅱ）与c-Cyts间电子传递的机制

4.3.6 不同半导体矿物对Fe（Ⅱ）与c-Cyts之间电子转移的影响

4.3.7 赤铁矿介导Fe（II与）c-Cyts反应电子传递机制的贡献

4.4 半导体矿物介导c-Cyts与 Fe（Ⅱ）反应电子传递机制的环境意义

第5章主要结论、创新之处及展望

5.1 主要结论

5.2 创新之处

5.3 存在的问题与展望

参考文献

致谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王莹

导师: 李芳柏,刘同旭

关键词: 细胞色素,亚铁氧化,电子传递,铁形态

来源: 中国科学院大学(中国科学院广州地球化学研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 中国科学院大学(中国科学院广州地球化学研究所)

分类号: X172;X132

DOI: 10.27544/d.cnki.gzcds.2019.000004

总页数: 148

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亚铁与细胞色素c间电子转移机制研究

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