细菌耐丁醇元件的挖掘及大肠杆菌的溶剂耐受性研究

论文摘要

微生物对有机溶剂的耐受能力在许多生物燃料有效生产中是至关重要的,并且在非水相催化工业生物技术中也占据关键地位,因此,获得一株溶剂耐受能力较好的宿主菌具有很大的研究价值和工业应用潜力。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是常被用于环境生物修复、生物活性物质合成等领域的重要工业微生物。大肠杆菌（Escherichia coli）是一类遗传背景清晰的平台微生物,其较差的有机溶剂耐受性成为工业化应用的瓶颈。本文基于sRNA调节基因及其分子伴侣工程、ARTP随机诱变技术两个研究方向来获得高正丁醇耐受性的大肠杆菌。一方面,通过在E.coli JM109中过表达sRNA调节基因（hfq,fur,sgrs和rpoS）或RNA伴侣基因（hfq,fur,rpoH,stpA,nusB,cspC,cspD,proQ和ffh）来改善对正丁醇的耐受性。在添加8 g·L-1正丁醇的条件下,JM109/pQE80L-rpoS过表达菌株的耐受性相比于对照菌株提高了41%。然后,将rpoS基因与两个分子伴侣基因（secB和groS）共表达。在9.6 g·L-1正丁醇浓度下,菌株JM109/pQE80L-groS-secB-rpoS的正丁醇耐受性是对照菌株的近3倍,并且通过实验发现基因的表达顺序差异会影响菌株的正丁醇耐受性。此外,通过构建rpoS基因随机突变文库,筛选了10000个左右的突变体,最终获得正丁醇耐受性提高1.5倍的突变体C11和1.8倍的突变体D5。另一方面,基于ARTP随机诱变技术对P.putida 901进行诱变,再经过一系列正丁醇浓度下的传代驯化,获得在8 g·L-1的正丁醇添加下耐受性提高了约2倍的突变体,并且其对正丁醇的最大耐受浓度进一步提高到12 g·L-1。通过Illumina HiSeq平台对突变株与对照菌株进行全基因组重测序,结果显示共获得大约1900万对reads,平均读长为150nt,与参考基因组的片段配对率为92.03%,覆盖率为90.34%。共检测到40704个单核苷酸位点变异（Single Nucleotide Variation,SNV）,其中纯合的为39319个,杂合的为1385个;存在2153个基因小片段插入/缺失序列（Insert&Deletions,InDels）,其中纯合的突变位点数量为1871个,杂合的突变位点数量为282个。最后,将所有突变进行GO/KEGG数据库功能注释,发现突变数目最多的是涉及到代谢相关基因,其中以氨基酸代谢和糖代谢路径相关基因为主。综上,本研究基于sRNA调节基因及分子伴侣工程等基因工程策略,提高了大肠杆菌的正丁醇耐受性,并通过ARTP随机诱变技术与生物信息学分析为筛选大肠杆菌正丁醇耐受性的元件及大肠杆菌宿主菌的表型改造提供了理论依据。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 微生物有机溶剂耐受性研究及耐受机制

1.1.1 有机溶剂对微生物细胞的影响

1.1.2 微生物的有机溶剂耐受性机制研究进展

1.2 小分子RNA及 RNA分子伴侣

1.2.1 小分子RNA及分子伴侣的功能简介

1.2.2 小分子RNA及分子伴侣的研究进展

1.3 ARTP随机诱变技术的简介及发展

1.4 高通量测序方法简介及发展

1.5 本课题研究意义和主要研究内容

1.5.1 课题来源

1.5.2 课题研究意义

1.5.3 课题研究内容

第二章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌株与载体质粒

2.1.2 实验所用引物

2.1.3 实验试剂与主要仪器

2.1.4 培养基及溶液

2.2 实验方法

2.2.1 差异表达基因的筛选

2.2.2 构建重组菌株

2.2.3 重组菌的有机溶剂耐受性测定

2.2.4 细胞表面疏水性测定

2.2.5 细胞形态学观察

2.2.6 细胞膜脂肪酸组成成分测定

2.2.7 细胞膜电位和细胞膜通透性检测

2.2.8 RpoS随机突变文库的构建及筛选

2.2.9 单点突变体的构建及耐受性验证

2.2.10 恶臭假单胞菌901 的随机诱变

2.2.11 诱变驯化菌的基因组重测序及数据分析

第三章结果与讨论

3.1 重组菌的构建及耐受性验证

3.1.1 单基因过表达菌株的正丁醇耐受性验证

3.1.2 双基因共表达菌株的正丁醇耐受性验证

3.1.3 三基因共表达菌株的正丁醇耐受性验证

3.1.4 三基因共表达菌株的不同有机溶剂耐受性验证

3.2 共表达菌株的耐受性机制研究

3.2.1 正丁醇对共表达菌株细胞形态的影响

3.2.2 共表达菌株细胞膜脂肪酸组成成分及含量测定

3.2.3 正丁醇对共表达菌株细胞膜电位和通透性的影响

3.3 RpoS随机突变文库的构建及筛选

3.3.1 随机突变文库的建立

3.3.2 随机突变文库的筛选

3.4 突变体C11和D5 的耐受性及机制研究

3.4.1 单点突变体正丁醇耐受性的测定

3.4.2 突变体细胞表面疏水性研究

3.5 ARTP诱变驯化P.putida及基因组重测序

3.5.1 P.putida的 ARTP诱变驯化结果分析

3.5.2 基因组重测序结果分析

主要结论和展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录A 实验中所用引物

附录B 作者在攻读硕士期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 肖琳

导师: 倪晔

关键词: 正丁醇耐受性,大肠杆菌,恶臭假单胞菌,基因共表达

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学

基金: 国家轻工技术与工程一流学科计划(LITE2018-07),国家自然科学基金(21506073,21776112)

分类号: Q939.9

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