大肠杆菌耐药性分析及ompF基因与Ⅰ类整合酶基因在生物被膜状态下表达相关性的研究

论文摘要

大肠埃希氏菌,又名大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）,属于革兰氏阴性菌,主要分为致病性和非致病性两类。随着抗生素在畜牧业的普遍应用和滥用,导致多重耐药甚至泛耐药大肠杆菌的产生和流行,致使大肠杆菌病的防控愈发困难。因此,通过开展大肠杆菌的耐药性调查,分析其与基因型、致病性和分子流行病学之间的关系,才能够选择更加合适有效的药物对大肠杆菌病进行预防与治疗。细菌耐药性的产生与多种蛋白相关,整合子作为一种重要的耐药基因捕获及传播元件,已经成为产生细菌耐药的主要机制之一,研究发现一些蛋白,如recA等可以通过应激反应影响Ⅰ类整合酶基因的表达,但外膜蛋白F（ompF）作为抗生素进入细菌内部的主要通道,它对大肠杆菌耐药基因的转移是否也有影响,目前尚无报道。本研究从甘肃、青海两省的病料和粪便样品中分离到猪源,牦牛源,鸡源和犬源大肠杆菌各100株。MLST分型发现这400株大肠杆菌共有142个ST型（1STs/2.8株大肠杆菌）,揭示该地区大肠杆菌流行菌株的复杂性。虽然不同动物源大肠杆菌的ST型不同,但均存在ST10（优势ST型）。eBURST分析将142个ST型分为19个克隆群（CCs）和67个单体,其中CC1,CC3,CC7,CC14和CC16克隆群属于潜在的致病群（B2/D群）,其它属于非致病群（A/B1群）。B2/D群大肠杆菌在健康动物中的携带率为12.5%。耐药性检测发现,400株大肠杆菌共存在237个耐药表型,不同动物源大肠杆菌的耐药谱虽然不同,但所有动物源大肠杆菌对氨苄西林,四环素和强力霉素的耐药率均高于其它药物,对美罗培南和多粘菌素的耐药率均低于其它药物;伴侣动物（狗）和家畜（鸡和猪）对大多数抗生素的耐药率均在40%以上,而牦牛对15种抗生素的耐药率均低于40%;此外,伴侣动物（狗）和家畜（鸡和猪）的ESBL大肠杆菌分离株也远远多于牦牛,提示我们对伴侣动物和家畜要合理用药。本研究通过耐药性检测,筛选出一株对本试验所选用的15种抗生素均敏感、且Ⅰ类整合酶基因阳性并能形成生物被膜的大肠杆菌N46（E.coli N46）进行基因敲除,研究其耐药性机理。通过Red同源重组,敲除E.coli N46的ompF基因,命名为E.coli N46/OmpFΔ;通过psTV28质粒成功构建回复株,命名为E.coli N46/OmpFcom。生长曲线检测发现ompF基因虽然不是大肠杆菌生长繁殖所必需的功能性基因,敲除后不会导致大肠杆菌的死亡,但会对大肠杆菌的生长有一定的影响。实时荧光定量PCR检测野生株,ompF基因缺失株和回复株的Ⅰ类整合酶基因在生物被膜状态下的表达情况,发现ompF基因缺失株Ⅰ类整合酶基因的表达水平比野生株明显降低,回复株Ⅰ类整合酶基因的表达水平有所升高,但不能回复到野生株的表达水平。初步确定在生物被膜状态下,ompF基因对大肠杆菌Ⅰ类整合酶基因的表达有影响。

论文目录

摘要

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第一章引言

1.1 大肠杆菌特性概述

1.2 大肠杆菌的流行病学及分型

1.2.1 大肠杆菌的流行病学

1.2.2 大肠杆菌分型

1.3 整合子的研究进展

1.3.1 整合子的简介

1.3.2 整合子的分类

1.3.3 整合子的结构

1.3.4 整合子介导的大肠杆菌耐药性基因盒的传播

1.4 研究目的及意义

第二章不同动物源大肠杆菌的分离鉴定,MLST分型及耐药性检测

2.1 材料

2.1.1 样品及来源

2.1.2 标准菌株

2.1.3 培养基

2.1.4 培养基的制备

2.1.5 药敏纸片

2.1.6 其它试剂和仪器

2.2 方法

2.2.1 样品采集

2.2.2 大肠杆菌分离、鉴定

2.2.3 DNA提取

2.2.4 MLST分型

2.2.5 序列进化分析

2.2.6 系统进化分群试验

2.2.7 耐药型检测

2.3 结果

2.3.1 大肠杆菌分离和鉴定

2.3.2 大肠杆菌7 个看家集因的MLST扩增结果

2.3.3 序列进化分析结果

2.3.4 系统进化分群结果

2.3.5 不同动物源大肠杆菌的耐药性检测结果

2.3.6 ESBL的检测结果

2.3.7 筛选出耐药性符合基因敲除条件的大肠杆菌菌株

2.4 讨论

2.4.1 ST分型

2.4.2 系统进化分群

2.4.3 耐药性

第三章大肠杆菌ompF基因缺失株和回复株的构建

3.1 材料

3.1.1 质粒与菌株

3.1.2 主要试剂与仪器

3.1.3 主要试剂的配制

3.2 方法

3.2.1 筛选目的大肠杆菌菌株

3.2.2 大肠杆菌ompF基因缺失株的构建

3.2.3 大肠杆菌ompF基因回复株的构建

3.3 结果

3.3.1 目的大肠杆菌菌株筛选结果

3.3.2 大肠杆菌ompF基因缺失株的构建

3.3.3 大肠杆菌ompF基因回复株的构建

3.4 讨论

第四章大肠杆菌外膜蛋白ompF基因与Ⅰ类整合酶基因在生物被膜状态下表达相关性的研究

4.1 材料

4.1.1 菌株

4.1.2 主要试剂与仪器

4.2 方法

4.2.1 亲本株和ompF基因缺失株MIC值的测定

4.2.2 生长曲线的测定

4.2.3 大肠杆菌外膜蛋白ompF基因与Ⅰ类整合酶基因在生物被膜状态下表达相关性的研究

4.3 结果

4.3.1 亲本株和ompF基因缺失株MIC试验结果

4.3.2 生长曲线差异的比较

4.3.3 RNA质量分析

4.3.4 mRNA的定性检测

4.3.5 intⅠ基因在生物被膜状态下mRNA表达水平差异比较

4.4 讨论

第五章全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王艺凝

导师: 刘永生

关键词: 大肠杆菌,多位点序列分析,基因,类整合酶基因,生物被膜耐药

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 甘肃省科技计划(17YF1WA170)

分类号: S852.61

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大肠杆菌耐药性分析及ompF基因与Ⅰ类整合酶基因在生物被膜状态下表达相关性的研究

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