检测无侵入性诊断前列腺癌的意义
于航1张光明2佟双喜2黄雪松3
(1.吉林医药学院附属465医院泌尿外科;2.北华大学附属医院泌尿外科;
3.吉林市第二中心医院泌尿外科吉林130000）
【摘要】目的：探讨PSA值增高患者前列腺按摩后尿液沉渣中DD3mRNA检测在前列腺癌诊断中的应用价值。方法：在前列腺穿刺活检前或术前麻醉后收集患者前列腺按摩后患者的尿液，离心取细胞沉淀物，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法和荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应(RealtimeRT-PCR)方法检测DD3mRNA和PSAmRNA含量，以PSAmRNA作为管家基因校正沉渣中的前列腺细胞，以DD3mRNA/PSAmRNA比值表示DD3mRNA含量。SPSS13.0分析相关数据，以穿刺活检或术后病理检查结果为金标准，同时探讨了前列腺按摩后尿液中DD3Mrna含量与前列腺癌病理分级之间的关系。结果：PSA值增高患者中前列腺癌患者前列腺液DD3mRNA表达量明显高于BPH，差异具有统计学意义。不同病理分级之间DD3mRNA的含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论：PSA值增高的患者行前列腺按摩后尿液沉渣中DD3mRNA含量检测，较前列腺活检的损伤更小，作为前列腺癌的一种非损伤性诊断方法具有良好的应用前景。
【关键词】DD3mRNA；实时荧光定量RT-PCR；前列腺癌
【中图分类号】R450【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）11-0023-02
我国前列腺癌的发病率虽远低于西方国家，但近年来随着人口老龄化，营养膳食结构的改变，生活方式的逐渐西化而呈显著增长态势，发病人数不断增多[1],为临床的多见病。血清前列腺特异性抗原（prostatespecificantigen,PSA）是目前诊断前列腺癌最重要的肿瘤标记物，但其在4-10ng/ml范围时很难区分前列腺良性增生和前列腺癌，所谓检测灰区[2]。此时主要依靠细针穿刺活检而确诊。但前列腺穿刺活检是有创检查，患者有一定痛苦和感染、出血等并发症。
目前PCa的早期诊断与无创诊断手段的探讨与研究备受国内外研究人员的关注,二氢二醇脱氢酶3(dihydrodioldehydrogenase3,DD3)基因是近年来所发现的一种前列腺癌特异性基因，其表达仅限于前列腺上皮细胞且在前列腺癌中表达量明显升高。至目前为止,该基因被认为是非编码基因,未发现该基因的相关蛋白,因此限制了其在蛋白水平的检测[3],前列腺是一个外分泌腺体,包绕前列腺尿道部,前列腺导管系统与尿道相通，绝大多数前列腺癌为腺癌，其发病部位是在腺腔表面的前列腺的腺上皮，由于肿瘤细胞代谢较活跃，脱落的肿瘤上皮细胞会混合在前列腺液中，这样为通过前列腺液中前列腺癌特异性因子检查诊断前列腺癌提供了理论依据。本研究在建立荧光定量RT-PCR方法检测DD3mRNA含量的基础上，对前列腺按摩后尿液中DD3mRNA含量进行检测，以探讨其作为前列腺癌无侵入性诊断方法在临床上的应用价值。
1研究对象和方法
1.1研究对象:患者来源于吉林市北华大学附属医院、吉林医药学院附属465医院门诊和住院患者。所有患者均没有前列腺炎病史，术前行尿常规检查均正常。
(1）研究组：31例前列腺癌患者作为研究组，年龄54-81岁，平均年龄69.4岁，按Gleason分级分为三组：其中高分化癌组11例(年龄63～81岁，平均年龄71.54±5.78岁)，中分化组10例(年龄54～80岁，平均年龄67.50±8.08岁)，低分化组10例(年龄60～78岁，平均年龄69±671岁)。
(2）对照组：共59例前列腺增生患者，年龄52～80岁，平均年龄6825±6.25岁。
诊断及分型标准：采用双盲设计收集标本和进行检验，以避免主观因素的影响。所有病例的诊断均以术后病理诊断结果为金标准。
1.2主要试剂和仪器:TRIzol试剂（购自Invitrogen公司）、逆转录试剂盒（MBI公司）、实时荧光PCR反应试剂盒(购自荷兰里生公司)、－80℃超低温冰箱（日本三洋）、TGL-16G-A低温高速离心机(上海安亭科学仪器厂型)、DU800紫外分光光度仪（美国Beckman公司）、Genesscan凝胶成像扫描分析系统（荷兰QIAGEN公司）、BIO-RAD梯度PCR扩增仪（美国ABI公司）、ABI7000Real-timePCR仪。
1.3标准品的制作:从阳性高表达样本中选取一个标本，根据上述步骤提取总RNA，R值为2.0，浓度为1.122ug/ul。进行RNA电泳，有清晰的285、185、5s条带。
将此RNA溶液按照1:10的比例进行梯度稀释，分为5管。从5管中分别取出lul，按照下述反转录反应步骤和条件转化为cDNA。从各管中取出2ul共5管作为制作DD3标准曲线的标准品，再分别取出2ul共5管作为制作PSA标准曲线的标准品。
1.4统计学分析：用SPSS13.0统计软件包对数据进行统计分析，数据呈偏态分布，两样本比较用Mann-WhitneyTest秩和检验分析前列腺癌患者和前列腺增生患者DD3mRNA表达量的差异。
2结果
2.1RNA提取、RT-PCR扩增产物及结果。
2.1.1RNA质量检测结果:对所提取总RNA经分光光度计检测，其A260/A280比值均在1.8-2.1之间，经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色，28s18s5s条带清晰可见，无明显降解。
2.1.2目的基因DD3mRNA的扩增结果：
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由上表可知，两组病人的年龄比较无显著差异；前列腺体积tPSA的比较有显著性差异。
2.3运用realtimeRT-PCR反应进行相对定量测定的结果:PCa和BPH患者前列腺按摩后尿液DD3mRNA表达量的比较：用DD3mRNA/PSAmRNA比指表示前列腺按摩后尿液中DD3mRNA的含量。PCa组(中位数：0.267095559；范围：从0.000189129到0541169527)与BPH组(中位数：0.001964868；范围：从0.000192014到0297394775)相比表达量显著增高，差异具有统计学意义(U=201.5，W=1971.5，Z=-6.054，P<0.05)。
3讨论
我们之前的研究发现，前列腺癌患者前列腺液中存在大量肿瘤细胞，但前列腺癌患者年龄普遍较大，前列腺液获取较为困难、前列腺癌早期脱落细胞较少，往往不能获取足够量的前列腺液或含有足够多的前列腺癌细胞的前列腺液来进行脱落细胞学检查，得出真实的结论，其临床应用受到限制。
DD3(differentialdisplaycode3)是近年来发现的位于人染色体9q21～22，全长约25kb的基因，研究发现其高度表达于人类前列腺癌细胞中,是一个具有临床潜力的前列腺癌标志物。目前认为其是一种非编码RNA基因，细胞浆中无蛋白质表达，故多在核酸水平对其进行检测分析。
本研究在建立SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法检测DD3mRNA表达的基础上，PSA增高患者前列腺按摩后尿液中的DD3mRNA的相对定量值进行了检测和对比分析，结果发现，PCa患者DD3mRNA表达量明显高于BPH患者，差异具有统计学意义(P<0.01)，与Bussemakers、陶志华在前列腺组织检验结果较为一致[5,6]。
PSA值增高的患者行前列腺按摩后尿液沉渣中DD3mRNA含量检测，较前列腺活检的损伤更小，可避免前列腺穿刺活检的风险和并发症，作为前列腺癌的一种非损伤性诊断方法具有良好的应用前景。
参考文献
[1]孙颖浩.我国前列腺癌的研究现状.中华泌尿外科杂志[J],2004,25(2):77-80
[2]周利群,陈为民,那彦群,等.良性前列腺增生与前列腺癌患者血清总PSA水平与游离PSA比例的比较[J].中华泌尿外科杂志,2005,23(6):354-357
[3]De-KokJB,VerhaeghGW,RoelofsRW,etal.DD3(PCA3),averysensitiveandspecificmarkertodetectprostatetumors.CancerRes,2002,62(9):2695-2698
[4]BussemakersMJ,vanBokhovenA,VerhaeghGW,etal.anewmolecularurinetestforthedetectionofprostatecancer[J].Urology,2004,64(2):311-315
[5]BussemarkersMJ,vanBokhovenA,VerhaeghGW,etal.DD3:anewprostatespecificgene,highlyoverexpressedinprostatecancer[J].CancerRes,1999,59(23):5975-5979
[6]陶志华,毛晓露等.DD3mRNA在前列腺癌组织中定量表达分析，中华男科学杂志，2007(2):130-133