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结缕草转录因子基因ZjDREB 1.4功能研究

2020-12-09阅读(634)

结缕草转录因子基因ZjDREB 1.4功能研究

论文摘要

高温、低温、干旱和高盐等非生物胁迫是影响草坪种植和观赏性的重要因素,因而非生物胁迫抗性及其机制一直是草坪草研究的重要内容。结缕草属（Zoysia Willd.）是我国重点开发的暖季型草种之一,具有抗旱、耐热、耐盐碱、抗病等特点,其抗逆性的分子机制有待深入研究。植物转录因子DREB（Dehydration responsive element binding）与多种非生物胁迫响应密切相关,通过激活多个抗逆相关基因的表达使植物获得抗逆能力。结缕草DREB转录因子的功能尚未有系统的研究报道。本研究以日本结缕草’Meyer’（Zoysia japonica Steud.）为材料对DREB类转录因子基因ZjDREB1.4开展研究,主要研究结果如下:（1）ZjDREB1.4基因编码区长681 bp,无内含子,推测编码226个氨基酸,含有一个AP2结构域,其上下游具有DREB转录因子A-1亚组的典型特征序列。在禾本科植物DREB1同源基因的系统进化树中,ZjDREB1.4基因属于在暖季型植物中得到选择性扩张的Ⅲa分支。根据qRT-PCR分析结果,ZjDREB1.4基因的表达受高温、低温和干旱胁迫诱导,其中对低温胁迫响应最显著。（2）构建了融合基因ZjDREB1.4-GFP,分别采用烟草下表皮细胞瞬时表达和转化拟南芥稳定表达的方法检测其表达产物在细胞中的定位,发现ZjDREB 1.4-GFP融合蛋白主要定位在细胞核中,在细胞质中也有少量分布。（3）酵母单杂交分析结果表明,ZjDREB1.4蛋白与ACCGAC为核心序列的DRE元件的结合能力较弱,而转录激活活性较强。通过纯化大肠杆菌细胞中诱导表达的完整ZjDREB1.4蛋白,采用凝胶阻滞电泳检测其DRE元件的结合活性,发现ZjDREB1.4蛋白可以结合以ACCGAC为核心序列的DRE元件,与GCCGAC为核心序列的DRE元件结合能力更强。（4）构建了ZjDREB1.4基因的植物表达载体并通过农杆菌浸花法转化拟南芥,获得了组成型表达ZjDREB1.4基因的拟南芥植株。与野生型相比,转基因植株对高温和冷冻低温胁迫的耐受能力明显增强,但是营养生长无明显改变,仅抽薹时间推迟3-8 d。（5）通过qRT-PCR验证和生理参数测定,从基因表达和渗透调节物角度研究了ZjDREB1.4基因增强植株抗逆能力的机制。正常生长条件下,ZjDREB1.4的组成型表达引起1153个基因表达发生变化,其中仅包括大约15%的拟南芥CBF调节子。转基因株系中脯氨酸和可溶性糖的水平比野生型中的水平高出30%-50%。本研究结果说明,结缕草ZjDREB1.4是DREB转录因子A-1亚组中的一员,对GCCGAC为核心序列的DRE元件有结合偏好,具有抗逆功能,但是其调节的下游基因与CBF调节子有明显差异,超表达后对植株生长发育无明显不利影响。因此,ZjDREB1.4在植物育种中的应用潜力值得进一步探究。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1 结缕草抗逆特征
  •   2 结缕草抗逆机制研究进展
  •   3 转录因子DREB1/CBFs研究进展
  •     3.1 DREB1/CBF转录因子结构特征
  •     3.2 逆境对DREB1/CBF的表达调控
  •     3.3 CBF调控的下游基因
  •     3.4 DREB1/CBF增强植物抗逆能力效果
  •     3.5 对植物生长发育的影响
  •   4 本研究基本思路
  • 第二章 结缕草ZjDREB1.4基因生物信息学分析及逆境胁迫下的表达模式
  •   1 材料、试剂与仪器
  •     1.1 植物材料培养与逆境处理
  •     1.2 试剂及引物
  •     1.3 仪器
  •   2 方法
  •     2.1 ZjDREB1.4基因克隆
  •     2.2 生物信息学分析
  •     2.3 基因表达的qRT-PCR检测
  •   3 结果
  •     3.1 ZjDREB1.4基因的序列特征
  •     3.2 ZjDREB1.4的系统进化分析
  •     3.3 逆境胁迫下ZjDREB1.4表达调节
  •   4 讨论
  • 第三章 结缕草ZjDREB1.4蛋白的亚细胞定位
  •   1 材料、试剂与仪器
  •     1.1 材料
  •     1.2 试剂及引物
  •     1.3 仪器
  •   2 方法
  •     2.1 ZjDREB1.4-GFP融合基因表达载体的构建及转化农杆菌
  •     2.2 ZjDREB1.4-GFP基因在烟草下表皮细胞瞬时表达
  •     2.3 ZjDREB1.4-GFP基因在拟南芥根中的稳定表达
  •   3 结果
  •     3.1 pGreenⅡ-ZjDREB1.4重组质粒鉴定
  •     3.2 ZjDREB1.4-GFP表达产物在细胞中的分布
  •   4 讨论
  • 第四章 结缕草ZjDREB1.4基因的转录因子活性鉴定
  •   1 材料、试剂与仪器
  •     1.1 材料
  •     1.2 试剂及引物
  •     1.3 仪器
  •   2 方法
  •     2.1 酵母单杂交载体构建
  •     2.2 原核表达载体构建
  •       2.2.1 连接酶法将ZjDREB1.4克隆到pET-28a和pET-30a中
  •       2.2.2 无缝重组法将ZjDREB1.4克隆到pGEX-4T-1中
  •     2.3 酵母单杂交检测ZjDREB1.4基因转录激活和结合功能
  •     2.4 ZjDREB1.4蛋白的原核表达及纯化
  •       2.4.1 蛋白诱导表达
  •       2.4.2 蛋白纯化
  •     2.5 凝胶阻滞电泳检测ZjDREB1.4蛋白的DRE元件结合功能
  •   3 结果
  •     3.1 酵母单杂交用载体
  •     3.2 原核表达载体构建
  •     3.3 ZjDREB1.4基因转录激活和结合功能鉴定
  •     3.4 ZjDREB1.4蛋白诱导表达及纯化
  •       3.4.1 不同裂解缓冲液的比较
  •       3.4.2 不同表达载体的比较
  •       3.4.3 融合蛋白的纯化
  •     3.5 EMSA体外检测ZjDREB1.4基因转录结合功能
  •   4 讨论
  • 第五章 超表达ZjDREB1.4拟南芥植株的生长表型及抗逆特征
  •   1 材料、试剂与仪器
  •     1.1 材料
  •     1.2 试剂及引物
  •     1.3 仪器
  •   2 方法
  •     2.1 ZjDREB1.4基因植物表达载体的构建
  •     2.2 超表达ZjDREB1.4基因拟南芥的表型观察
  •     2.3 植株抗逆性评价
  •   3 结果
  •     3.1 构建ZjDREB1.4植物表达载体
  •     3.2 转基因植株的生长表型特征
  •     3.3 抗逆评价
  •   4 讨论
  • 第六章 ZjDREB1.4增强拟南芥植株抗逆机制
  •   1 材料、试剂与仪器
  •     1.1 材料
  •     1.2 试剂
  •     1.3 仪器
  •   2 方法
  •     2.1 脯氨酸和可溶性糖含量测定
  •     2.2 转基因植株DREB1下游基因表达量检测
  •   3 结果
  •     3.1 转基因植株生理特征
  •     3.2 转基因植株的差异表达基因
  •   4 讨论
  • 第七章 全文总结及研究展望
  • 参考文献
  • 缩略词
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文目录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 冯婉倩

    导师: 韦善君

    关键词: 日本结缕草,非生物胁迫,转录因子,结合活性,生理功能

    来源: 中央民族大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 中央民族大学

    分类号: Q943.2

    总页数: 88

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