郴州市第一人民医院湖南423000
【摘要】目的探讨乌司他丁对H2O2刺激下的肺泡上皮细胞氧化应激的影响。方法A549细胞随机分为对照组（无处理），氧化应激组（0.2mMH2O2刺激6小时）及乌司他丁组（乌司他丁1000u/L预处理60分钟后予0.2mMH2O2刺激6小时）。分别以H2DCFDA探针法检测细胞内活性氧（ROS）水平；以试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平；MTT法检测细胞活力。结果与对照组比较，氧化应激组中细胞内ROS及MDA水平显著增加，SOD水平及细胞生存率显著下降（P?0.05）；而与氧化应激组比较，乌司他丁组细胞内ROS及MDA水平显著降低，SOD水平及细胞生存率显著增加（P?0.05）。结论乌司他丁显著抑制H2O2刺激诱导的肺泡上皮细胞氧化应激水平。
【关键词】乌司他丁；氧化应激；肺泡上皮细胞
Abstract：objectivetoexploretheulinastatinonH2O2underthestimulusofalveolarepithelialcelloxidativestress.MethodsA549cellswererandomlypidedintocontrolgroup（notreatment），oxidativestressgroup（0.2mMH2O2stimulation6hours）andulinastatingroup（ulinastatin1000u/Lpretreatmentto0.2mMH2O2stimulus6hoursafter60minutes）.RespectivelybyH2DCFDAprobemethodtodetectintracellularreactiveoxygenspecies（ROS）level；Withthekitssuperoxidedismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）level；DeterminedbyMTTmethodtodetectthecellvitality.Resultscomparedwithcontrolgroup，intracellularROSinoxidativestressgroupandlevelofMDAincreasedsignificantly，SODlevelandcellsurvivalratedecreasedsignificantly（P0.05）?；Comparedwithoxidativestressgroup，andulinastatingroupofintracellularROSandMDAlevelsignificantlyreduced，SODlevelandcellsurvivalrateincreasedsignificantly（P?0.05）.ConclusionulinastatinheDingXianzhusuppressthealveolarepithelialcellsinducedbyH2O2stimulusoxidativestresslevel.
Keywords：ulinastatin，oxidativestress，alveolarepithelialcells
氧化应激导致细胞损伤，是脓毒症、高血压和糖尿病等许多疾病进展的重要因素[1-2]。急性肺损伤（ALI）是脓毒症的常见并发症之一，肺泡上皮细胞损伤在ALI中的发病过程中扮演重要作用[3].研究证实氧化应激导致肺泡上皮细胞损伤参与ALI的发病过程[4]。乌司他丁是近年来治疗脓毒症的热点药物，研究证实其在ALI治疗中具有一定的疗效[5-7]。本研究旨在探讨乌司他丁对氧化应激作用下肺泡上皮细胞损伤的影响。
1.材料及方法
1.主要试剂
A549细胞购于广州赛库生物科技有限公司；乌司他丁由广州天普洛安提供；MTT、SOD、MDA、H2DCFDA试剂盒购于广州新进度生物科技有限公司。
2.模型及分组
A549细胞分为四组：对照组、氧化应激组及乌司他丁组。对照组无处理，氧化应激组以0.2MmH2O2刺激，乌司他丁组予乌司他丁5000u/L预处理60分钟后予以0.2MmH2O2刺激。H2O2刺激6小时后检测相关指标。
3.检测方法
细胞内活性氧（ROS）检测：将A549细胞加入10μ/mol／LH2DCFDA混匀，37℃孵育30min，荧光显微镜下观察，流式细胞仪进行荧光定量检测。
超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测：步骤参照试剂盒说明书。
细胞活力检测：采用MTT法检测细胞活力，步骤参照试剂盒说明书。
4.统计学处理
数据以均数±标准差（）表示，应用SPSS20.0统计软件进行分析，组间比较使用单因素方差分析（onewayANOVA）比较。P<0.05有统计学意义。
2.结果
1.乌司他丁对A549细胞内ROS水平的影响
对照组A549细胞内绿色荧光强度为100%±7.4%，提示ROS水平较低；而氧化应激组A549细胞内绿色荧光较对照组显著增强（荧光强度为492.8%±32.5%，与对照组比较P?0.05），提示ROS水平增加；乌司他丁组A549细胞内绿色荧光较氧化应激组显著减弱（荧光强度为216.3%±17.2%，与氧化应激组比较P?0.05），提示细胞内ROS水平较氧化应激组减低。如表1。
表1乌司他丁对A549细胞氧化应激的影响
2.乌司他丁对A549细胞内SOD及MDA的影响
与对照组比较，氧化应激组SOD水平显著下降为12.5±0.9U/mg蛋白，而MDA则显著增加为5.3±0.5nmol/mg蛋白（与对照组比较P?0.05）；与氧化应激组比较，乌司他丁组SOD水平显著上升为27.4±1.9U/mg蛋白，而MDA则显著减少为3.4±0.2nmol/mg蛋白（与氧化应激组比较P?0.05）。如表1。
3.乌司他丁对A549细胞活力的影响
与对照组比较，氧化应激组细胞生存率显著下降为49.3%±4.4%（与对照组比较P?0.05），而乌司他丁组细胞生存率显著上升为79.4%±5.9%（与氧化应激组比较P?0.05）。如表1。
3.讨论
在ALI中，肺泡上皮细胞氧化应激损伤是病程进展的关键因素[8，9]。活性氧（ROS）是导致肺泡上皮细胞损伤的一个重要因素，机体产生大量活性氧自由基可以直接造成细胞膜及具有膜结构的细胞器，如内质网、溶酶体和线粒体的严重损伤，同时还可以损伤细胞DNA的结构，导致ALI的发生和发展[4]。乌司他丁抗炎、调节免疫力及保护重要脏器功能的作用已被肯定[3]，而其保护抗氧化应激反应的作用也逐渐受到重视，如乌司他丁通过抗炎、抗氧化作用治疗胰腺炎[10]。而也有实验研究证实乌司他丁可以减轻急性肺损伤中氧化应激水平[11，12]。虽然在动物水平证实乌司他丁对于ALI中肺部氧化应激具有抑制作用，但是肺部细胞众多，且在ALI的发病中扮演不同的作用，因此在细胞水平探讨其对II型肺泡上皮氧化应激的影响仍具有一定意义。A549细胞是人非小细胞肺癌细胞，广泛用于II型肺上皮细胞的体外模型中[9]，本实验采用H2O2刺激模拟氧化应激，检测乌司他丁对A549细胞氧化应激损伤的影响。我们发现乌司他丁可以显著减少H2O2刺激导致的A549细胞内ROS上升。在氧化应激过程中，SOD降低，MDA增加，而我们发现乌司他丁可以显著抑制H2O2刺激导致细胞SOD降低及MDA增加。进一步实验发现，乌司他丁还可以显著提高H2O2刺激下细胞的生存率。我们的研究证实乌司他丁可以显著减轻氧化应激导致的肺泡上皮细胞损伤，为乌司他丁在ALI治疗中的应用提供了一定的理论基础。
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