胡华[1]2004年在《骨髓间充质干细胞对雌性大鼠压力性尿失禁影响的研究》文中提出压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是指患者腹压突然增加(咳嗽、大哭、喷嚏、体举重物)时,尿液不自主地由尿道口流出的现象。目前女性发病率约为15%-60%,是影响女性尤其是中老年女性生活质量的主要疾病之一,特别是在我国,随着人口进一步老龄化,SUI越来越受到人们的重视。目前对于SUI的治疗主要涉及两大方面:非手术治疗以及手术治疗。非手术治疗主要是通过体育锻炼、生物反馈、药物治疗等手段改善病情,适用于症状较轻的患者及年轻女性,使用范围较窄。手术治疗主要包括经阴道尿道膀胱颈筋膜缝合术、经耻骨后膀胱尿道悬吊术、无张力阴道悬带术等。手术疗效较好,然而诸如病人的选择、手术技巧、病变情况等因素都直接影响手术治疗效果, 同时手术创伤大,且手术中悬吊力度不易掌握,易出现矫枉过正,发生尿储留。近几年,注射治疗以其安全、简单、方便、创伤较小,在门诊即可施行的优点日渐引起了人们的重视,它是将药物或化学制剂注射到后尿道或膀胱内口周围粘膜下及肌层中,使尿道腔变窄、拉长和缩小,从而提高尿道阻力,关闭尿道内口,以有效控制尿流。目前在注射治疗中远期疗效好、花费成本较少、安全的组织材料仍待发现。理想的填充试剂应具有低免疫原性、无毒性、较低过敏原性、有效性、与局部解剖结构相一致性且注射后与局部组织相结合只有很轻微的炎症等特点。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能较好的满足以上要求,其具有向成肌细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞及神经细胞等多种细胞分化的潜能,且来源丰富,可在体外分离、培养及扩增,具有较好的同种异体免疫反应调节能力,是一种良好的替代治疗靶细胞。利用MSCs及其向成肌细胞方向分化的细胞进行注射治疗,具有安全、免疫排斥性小、低过敏原性等优点,相信在不远的将来可能会为压力性尿失禁提供新的治疗机会。本研究通过将MSCs及经5-Aza-CR诱导后的MSCs注射到压力性尿失禁大鼠的后尿道以及膀胱内口周围粘膜下及肌层中,采用喷嚏负荷试验及尿动力学检查等方法研究以上述两种细胞为介质的注射治疗对雌性大鼠SUI的影响。主要实验方法及结果
吴桂珠[2]2010年在《脂肪间充质干细胞治疗压力性尿失禁的实验研究》文中提出目的：本研究在体外通过改良两步酶消化法结合差速贴壁技术分离ADSCs并标记,体外定向诱导ADSCs分化为成肌细胞。将ADSC移植至SUI大鼠的近端尿道,检测了ADSCs移植后体内形态和分布以及尿动力学变化,及尿道及其周围组织形态学改变,观察间充质干细胞移植治疗压力性尿失禁大鼠是否有效可行,为压力性尿失禁的组织工程学治疗奠定基础。方法：1、采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术分离ADSCs,对连续传代细胞进行计数并描绘生长曲线；收集P3细胞,进行细胞表面抗原流式细胞术鉴定及成脂、成骨定向分化功能鉴定；2.以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体系统作为基因转导的媒介对ADSCs进行转染。3、选用第2代ADSCs,经5-氮杂胞苷体外定向向成肌细胞诱导分化。在倒置显微镜、透射电镜下及激光共聚焦显微成像下观察细胞形态学和超微结构。采用免疫细胞化学对诱导前后细胞进行Desmin检测,采用RT-PCR和Western Blot方法对诱导后细胞sarcomeric、Desmin基因mRNA和蛋白表达的检测。4、以双侧阴部神经离断的方法,制备大鼠SUI动物模型。模拟人体尿动力学检查的方法,测定实验动物的最大膀胱容量(MBV)、腹压漏尿点压(ALPP)、最大尿道闭合压(MUCP)、能性尿道长度(FUL)各项指标,证实SUI动物模型制作成功。并通过HE染色、Masson特殊染色、Mallory特殊染色、电镜超微结构对大鼠尿道横纹肌性括约肌的显微解剖进行研究。5、将建模成功的33只大鼠分成ADSCs移植治疗组和培养基注射对照组,以5×106个细胞／只的细胞数移植注射到大鼠尿道中下段3、9、12点。移植2周后进行尿动力学检测,评价动物尿动力学变化情况。通过HE染色、Masson染色、Mallory染色及对尿道评价细胞移植后尿道周围组织病理变化。同时对横纹肌性括约肌的超微结构的形态学变化观察及采用肌肉分割法评估干细胞治疗后控尿系统的修复。激光共聚焦扫描显微镜观察移植细胞存活情况,以及采用二次谐波(SHG)成像技术探测尿道周围SHG峰值信号,定量评价胶原蛋白含量的变化。结果：①体外培养的ADSCs主要呈梭形和多角形,细胞表达CD44、CD90,不表达CD34、CD45、CD106;细胞成脂、成骨定向分化诱导后油红-0染色、茜素红染色阳性。倒置相差荧光显微镜下,GFP转染大鼠ADSCs发出绿色荧光,荧光强度随MOI值的增加而增强,但以MOI为8的病毒感染大鼠ADSCs荧光强度最强,传至P3时GFP阳性细胞达82%-86%。②ADSCs经5-Aza等诱导分化后其形态发生改变,细胞大小不一致；在透射电镜、激光共聚焦显微成像系统下观察到,逐渐由长梭形变为多角形及星形,细胞表面有许多微绒毛；细胞器丰富,胞质内可见丰富的线粒体、粗面内质网,胞浆内可见肌丝样结构。诱导后细胞表达结蛋白Desmin。RT—PCR、Western Blot结果证实,诱导细胞结蛋白Desmin基因的表达明显高于对照组(P＜0.05)。③雌性SD大鼠的尿道为一长约2.0 cm的管状结构。其组织结构由外向内依次为环形横纹肌层、环形平滑肌层、纵行平滑肌层、致密结缔组织层和上皮层。双侧阴部神经离断的方法能成功制造大鼠SUI模型。尿动力学检测结果：模型建立后大鼠膀胱最大容量增加(0.89±0.04)ml(P＜0.01),腹压漏尿点压下降(15.46±5.49)cmH2O(P<0.01),最大尿道闭合压和功能性尿道长度亦下降(7.97±3.25)cmH2O、(0.69±0.32)cm(P＜0.01)。建模后尿道及其周围组织形态学观察：括约肌排列松散,部分肌肉有断裂现象,肌层变薄；结缔组织所占比重增加,胶原纤维稀疏,排列紊乱。④尿动力学检测ADSCs移植后尿控功能变化,ADSCs治疗后大鼠膀胱最大容量下降(0.78±0.35)ml,腹压漏尿点压增加(15.06±4.36)cmH2O,最大尿道闭合压和功能性尿道长度亦增加(9.69±2.57)cmH2O、(0.69±0.32)cm,与对照组比较各指标均有显着性意义(P＜0.01)。ADSCs移植治疗后可以使注射局部尿道肌层得到明显的加强和增厚,括约肌形态及功能得到明显的改善,周围结缔组织紧密,支撑作用得到加强。横纹肌肌肉分割分析显示干细胞治疗4周横纹肌肌肉面积及其长短轴比值均得到明显增加。移植治疗后尿道周围的胶原蛋白含量明显高于对照组(P<0.01)。结论：1、通过消化分离,percoll密度梯度离心和preplate差速贴壁技术,可以获得纯度较高的SD大鼠ADSCs。本实验使用携带GFP基因重组的慢病毒成功高效地转染了ADSCs,该方法为长期观测ADSCs的体内状况创造了条件。2、本研究提示：在特定诱导条件下ADSCs能被定向诱导分化为成肌细胞；并为SUI的干细胞移植治疗提供了新的思路。3、本部分研究通过双侧阴部神经离断的方法,成功建立了SUI的动物模型,为后续实验奠定了基础。尿道横纹括约肌呈封闭环形分布于雌性大鼠尿道的中外段,提示此处为控尿机制的主要部位。4、ADSCs移植至压力性尿失禁模型大鼠后能存活、分化而整合至宿主尿道括约肌,改善压力性尿失禁大鼠的尿控功能,并且主要可能通过在体内定向分化为肌细胞,增强尿道括约肌系统,并改善尿道粘膜闭合机制及尿道周围组织中胶原蛋白的含量而实现。组织工程学技术的发展为压力性尿失禁的治疗提供了新的思路和手段。
石海燕[3]2012年在《脐带间充质干细胞对尿道括约肌功能影响的实验研究》文中提出研究目的：本研究通过建立SUI大鼠模型，检测SD雌鼠尿流动力学变化，观察尿道及其周围组织学形态改变。应用免疫组化和图像分析方法，分析HUMSCs治疗前后desmin、MHC及PGP9.5叁种因子在尿道中的表达情况，分析间充质干细胞治疗压力性尿失禁的效果和可能的机制，探讨两种不同方式干细胞移植后的效果，以指导临床。材料和方法：1.1选用SD（清洁级）雌鼠模拟人类妊娠、难产产伤、双侧卵巢去势后低雌激素建立SUI模型。测定实验动物的最大膀胱容量(MBC)、漏尿点压(LPP),喷嚏实验阳性率和组织学形态检验模型的成功与否。通过HE染色、Masson特殊染色、Mallory特殊染色、免疫组化方式对大鼠尿道括约肌的显微解剖进行研究。2.2将建模成功好的20只大鼠分为叁组：静脉注射组（A组，6只），尿道局部注射组(B组，8只)、对照组（不注射任何物质C组，6只)，D组正常组（6只）将获得MSCs分别以5*106个细胞/只通过尾静脉和尿道局部注射方式移植于SUI大鼠模型体内，移植4周及6周后分别用BL-410生物机能实验系统检测尿流动力学指标和喷嚏实验阳性率，以评估尿流动力学变化。2.3注射细胞6周后处死所有大鼠，进行尿道及其周围组织取材，通过组织形态学和图像分析法观察尿道及其周围组织变化，定量评价desmin、MHC、PGP9.5含量和计算横纹肌占整个尿道阳性面积比及尿道括约肌占整个尿道的阳性面积比。结果：1.正常SD雌鼠尿道及其周围组织形态学观察尿道括约肌在整个尿道分布不均，在中下段开始增多，其中横纹肌呈环形分布。模拟人类妊娠、难产产伤、去势后低雌激素方式能建立SUI模型SD雌鼠:尿道括约肌肌层减少，排列松散，混乱，部分肌肉有断裂，形成空泡等现象，肌相关蛋白desmin及MHC染色下降，甚至出现丢失现象。2.LPP是反应尿控功能最重要的指标，其中LPP升高提示尿控功能得到部分恢复或完全恢复，本研究显示HUMSCs移植A、B两组LPP、MBC均增加，HUMSCs移植后4周LPP值A组、B组、C组、D组分别为：18.15±1.21mmHg，18.79±1.48mmHg,13.55±1.43mmHg，22.83±2.17mmHg，6周后LPP分别为18.86±1.14mmHg,19.40±0.85mmHg，11.82±0.91mmHg,24.36±3.26mmHg.组间两两比较有统计学差异(P<0.01)，其中C组LPP最小，A组、B组及D组两两比较有统计学意义（P<0.01），但是A与B组比较无统计学意义(P>0.05)，HUMSCs治疗后4周与6周各组间LPP无统计学意义(P>0.05)。3．HUMSCs移植治疗后可以使尿道括约肌肌层得到明显的增厚，形态及功能得到明显的改善。图像分析显示治疗4周、6周后尿道横纹肌及括约肌阳性面积比较未治疗都有明显的增加，PGP9.5数目也较阳性对照组明显增多,A组、B组、C组、D组横纹肌阳性面积比(%)分别为(15.3±3.77)%,(15.2±4.79)%,(9.55±2.06)%,(16.49±2.4)%,；尿道括约肌阳性面积比(%)分别为(35.14±5.38)%,(36.88±3.93)%,(22.46±3.52)%,(37.9±1.80)%, PGP个数分别为7.75±1.26，8.14±1.68，5.2+2.05，10.25+1.89，上述叁种因子的检测组间两两比较均有统计学差异(P<0.01)，其中C组横纹肌阳性面积最小，与其他叁组相比差异有统计学意义(P<0.01)，但A组、B组及D组两两比较无统计学意义(P>0.05)；结论:1.本部分研究通过妊娠、分娩阴道扩张及双侧卵巢切除去势的方法，成功建立了SUI的动物模型，为后续实验奠定了基础。2.尿道括约肌损伤和神经纤维的减少导致SUI出现，提示尿道结构和功能的改变是引发SUI的直接原因。3.HUMSCs移植到SUI模型SD雌鼠可以增加肌相关蛋白desmin、MHC的含量和神经轴突标记物PGP9.5数目。4.局部注射治疗和静脉注射治疗的两种不同方式疗效无明显的区别。5.HUMSCs移植到SUI模型SD雌鼠可修复薄弱的尿道括约肌，改善尿控功能。
徐梦遥[4]2013年在《组蛋白乙酰化对骨髓间充质干细胞微环境适应性的调控作用及机制》文中研究指明骨髓间充质干细胞（BMSCs）是治疗括约肌功能障碍型（ISD）压力性尿失禁的理想细胞，临床上把BMSCs移植到尿失禁患者的尿道周围，希望通过成体组织细胞对BMSCs的诱导，使干细胞发生向相应成体细胞的分化，以治疗受损肌肉的排尿功能障碍。然而，至今为止该疗法并没有获得预期的疗效，究其原因是BMSCs诱导分化的机制研究较少，很多关键性的问题没有解决直接影响着干细胞在临床上的治疗效果。前期的一些实验中可以观察到在体外膀胱平滑肌细胞的微环境中BMSCs可向平滑肌细胞的表型分化，提示参与干细胞定向分化的信号可能存在于干细胞生存的微环境中,通过相应的信号转导通路,启动干细胞的基因在时空上特异性表达,合成特异性蛋白质,从而使细胞在功能、结构等方面发生不同改变。微环境之所以能够精密的调控干细胞向特定细胞分化，关键因素就是干细胞对其微环境的适应性以及微环境对干细胞的潜在影响。因此，针对干细胞在微环境中的适应性对于全面及清楚的认识干细胞分化情况具有非常重要的理论意义，但是到目前为止，与干细胞微环境适应性有关的具体机制仍不清楚。因此研究干细胞在体内外微环境诱导下的适应性的调控变化及机制显得十分重要。近几年来组蛋白乙酰化修饰对干细胞分化的影响引起了人们广泛关注，组蛋白乙酰化可能是干细胞微环境适应性中重要的胞内信号调控事件，染色质核小体组蛋白可以通过共价修饰而发生乙酰化、甲基化和磷酸化,其中与特异性基因转录调控关系最为密切的是组蛋白的乙酰化修饰，通过染色质水平调节DNA构型疏密，并由染色质不同位点组蛋白的乙酰化修饰构成了多种多样的“组蛋白密码”。一般而言，乙酰化的染色质与基因转录激活有关，相反的，去乙酰化的染色质与基因转录抑制相关，启动子附近的组蛋白乙酰化水平升高可影响多种生物的可诱导基因的转录起始。因而在真核细胞中，组蛋白乙酰化/去乙酰化对染色质结构及基因转录的调控是一个多层次、多步骤的复杂过程。本实验取材于3周龄雌性SD大鼠，分别采用密度梯度离心法和胶原酶消化法，分离培养了BMSCs和BSMCs；并模拟体内盆底环境，体外构建膀胱平滑肌与BMSCs接触培养体系，建立间充质干细胞向平滑肌细胞分化模型，旨在研究组蛋白乙酰化修饰在BMSCs向平滑肌分化的意义以及膀胱平滑肌微环境诱导BMSCs适应性的调控机制，主要实验方法及结果如下：一、细胞培养鉴定与共培养模型的建立1.大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离与培养无菌操作下取3周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨，DMEM-F12培养基反复冲洗骨髓腔，冲洗液混匀，梯度密度离心弃上清后提取沉淀，加入含10%FBS的DMEM-F12培养液中，置37℃的5%CO2培养箱中培养。所得第叁代贴壁细胞经流式细胞仪检测其分子表型。结果：成功的分离出形态为梭形的骨髓间充质干细胞，其分子表型为：CD31、CD45阴性、CD29、CD44、阳性。2.大鼠膀胱平滑肌细胞（BSMCs）的分离与培养无菌操作条件下取3周龄雌性SD大鼠膀胱，采用胶原酶消化法分离膀胱平滑肌细胞，用含10%FBS的HG-DMEM培养，所得贴壁细胞，免疫荧光法鉴定其标志蛋白的表达。结果：平滑肌标志基因a-SMA, Calponin和SM-MHC均表达阳性。3.建立大鼠膀胱平滑肌微环境诱导BMSCs体外分化模型BMSCs和膀胱平滑肌细胞分别种在悬挂式细胞培养小室transwell多孔膜（1um）两侧，cell culture inserts放入六孔板中作为实验组，以未经过共培养的同代同批次BMSCs作为对照组。收集接触共培养4日后的BMSCs，RT-PCR、Western Blot、及免疫荧光检测实验组与对照组成肌分化后平滑肌标志性蛋白。结果：RT-PCR、Western Blot、及免疫荧光结果显示实验组较对照组的BMSCs中平滑肌标志性蛋白的表达量显着增加，说明BMSCs在平滑肌微环境中成肌分化，建模成功。二、组蛋白乙酰化对BMSCs向BSMCs分化的影响1.微球菌核酸酶实验检测BMSCs分化前后平滑肌标志性基因启动子区染色质开放性，将第叁代BSMCs接种于培养小室transwell下室面，放入培养箱中培养6h后将翻转过的transwell放入含平滑肌培养液的六孔板中继续培养。次日将BMSCs接种于膜内面。分别收集共培养3天的实验组与对照组BMSCs，PCR检测进行不同时间微球菌核酸酶处理的实验组与对照组中叁个标志性基因α-SMA、calponin、SM-MHC启动子区染色质开放性。对PCR产物运用凝胶分析软件对DNA的量进行定量分析。结果：随着时间的递增，分化后的BMSCs启动子区的PCR扩增效率明显低于未分化的BMSCs，说明与BMSCs接触共培养能显着的增强BMSCs平滑肌相关蛋白启动子区域对核酸酶的敏感性，使启动子开放性增强，开启上游抗性基因和下游报告基因的表达，增加外源基因的转化效率和转化频率。2. ChIP检测α-SMA、SM-MHC以及Calponin启动子区H4表观遗传修饰状态，Transwell上室面取培养组和对照组中BMSCs，用甲醛固定活细胞，超声将DNA打断成不同大小的片段，用目的蛋白质H4特异性抗体免疫沉淀该蛋白质-DNA复合物，复合物65℃解交联，分离纯化DNA，后进行定量PCR扩增，扩增条件为98℃30s，变性94℃20s，退火60℃1min，延伸60℃1min，共40个循环；Q-PCR检测BMSCs分化前后平滑肌标志性基因启动子区乙酰化差异。结果：经共培养诱导分化后，α-SMA、SM-MHC和Calponin启动子区乙酰化程度较未分化前显着增加，平滑肌标志基因启动子区DNA的乙酰化可能参与了BMSCs向SMCs分化过程。结论：本研究成功的分离出了骨髓间充质干细胞及膀胱平滑肌细胞，并成功建立了接触共培养体系并模拟体内环境建立了体外诱导分化模型，在该模型的基础上研究了组蛋白乙酰化对BMSCs分化水平的影响。研究表明，干细胞分化后目的基因启动子区域存在乙酰化程度高表达。
王荥[5]2012年在《Deltex-1基因在骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中的作用及其机制研究》文中研究指明研究背景与目的压力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)是指膀胱无自主收缩情况下腹压突然增高导致尿液不自主流出，也称真性压力性尿失禁、张力性尿失禁、应力性尿失禁，其特点是正常状态下无遗尿，而腹压增高时尿液不自主流出。主要表现为咳嗽或剧烈运动后出现尿液自尿道外口不自主漏出[1,2]，为女性常见病，其患病率随年龄增长而增高，严重影响女性生活质量。SUI的关键机制是膀胱颈支撑功能障碍与尿道固有括约肌缺陷(intrinsic sphincter deficiency，ISD)。而ISD主要由尿道周围平滑肌细胞(smoothmuscle cell，SMC)病变或凋亡所致[3]。目前SUI的治疗方法众多，但均不能从本质上恢复尿道括约肌功能。近年来，成体干细胞的移植已成为再生医学的重要手段[4]，为压力性尿失禁的治疗提供了新的策略。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, bMSCs)具有自我更新和多向分化潜能，经诱导后在体外可分化为多种细胞，尤其如SMC。bMSCs取材方便，可直接由骨髓提取，提取后增长速度较快，可自体移植。同时，由于bMSCs具有诱导多向分化性和表观修饰后能表达特定外源目的基因等特性，将其用作种子细胞，用于基因及细胞治疗的前期研究，已成为当下热点。但值得我们关注的是体外诱导bMSCs向SMC分化的数量及功能均难以达到治疗SUI的目的。因而，研究其作用机制成为我们研究的重点和方向。MSCs多向分化能力可能涉及多种不同的机制,主要包括叁个方面，转录因子随机抑制或激活、微环境诱导分化及信号转导通路的调控作用。现越来越多的研究者发现信号转导通路在干细胞分化中发挥着重要的作用。目前的研究已经揭示了调控干细胞命运的叁大信号: Notch、Wnt和Shha。其中Notch家族是由高度保守的蛋白质组成，是细胞间实现通讯的重要信号分子。该家族具有受体和基因调节转录的功能，可通过细胞间信息的相互传递使胞内蛋白之间作用而实现信号的调控。其配体为膜蛋白，脊椎动物体内存在多个Notch配体,其中与Deltex同源的称为Deltex或Deltex-like。在本研究获国家自然科学基金资助项目(30772309)研究经费资助。哺乳动物体内，Deltex家族包括deltex-1，Deltex-2，Deltex-3，Deltex-4成员。Deltex-1作为Notch信号通路的下游分子，可增强或抑制Notch信号表达[8]，可通过调控Notch通路以调节淋巴前体细胞、调节神经前体细胞的分化等。Deltex-1蛋白在结构上高度保守，包括叁个结构域，DomainⅠ，DomainⅡ和DomainⅢ。DomainⅠ是Deltex-1功能的必须部位，与Notch胞内段ANK重复结构结合，以调节Notch信号[9]；DomainⅡ为脯氨酸聚集区，与SH3结合，主要调节蛋白与蛋白或蛋白与脂类间的相互作用；DomainⅢ与Deltex-1的降解有关。研究表明，Notch通路的激活可促进bMSCs向SMC分化[5-6]。Notch信号通路可分为CSL非依赖及CSL依赖两种途径。Arias等[7]在研究Notch基因突变时在果蝇体内发现CSL非依赖途径,后于哺乳动物体外细胞实验中证实。随后的研究发现, Deltex蛋白在介导CSL非依赖的Notch通路中发挥了重要作用，但其作用机制暂不清楚。因此，本研究探讨bMSCs在SMC环境中deltex-1基因促进bMSCs向SMC分化的作用及其机制，为进一步研究采用经deltex-1基因修饰的bMSCs治疗女性压力性尿失禁奠定基础。方法本研究拟首先分离、培养与鉴定SD大鼠bMSCs，随后克隆Deltex-1基因，构建其腺病毒载体pAd/Deltex-1，并以此腺病毒载体感染大鼠bMSCs，观测Deltex-1基因对大鼠bMSCs增殖的影响。随后将经Deltex-1基因修饰的bMSCs与SMC共培养，观测经Deltex-1基因修饰的bMSCs在SMC环境中的变化情况，以此探讨Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制，具体如下。一、bMSCs的分离、培养及鉴定采用密度梯度离心法(percoll,1.073g/ml)分离SD大鼠bMSC，特异性免疫抗体标记结合流式细胞仪及进行成骨、成脂诱导对bMSC的纯度与干性予以鉴定。二、Deltex-1基因腺病毒载体的构建及其在大鼠bMSCs中的表达1.腺病毒载体pAd/Deltex-1的构建、病毒包装与病毒滴度测定设计扩增Deltex-1基因引物，以大鼠肝组织总RNA为模板，RT-PCR扩增Deltex-1基因的全长编码序列，构建其克隆载体PTA2/Deltex-1，并予以测序鉴定。以PTA2/Deltex-1为模板，采用KpnI、Xba1酶切位点将Deltex-1基因亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV，经PmeⅠ酶线性化后，与超螺旋骨架载体pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组，形成重组腺病毒质粒pAd/Deltex-1。脂质体Lipofectamine-2000介导经PacⅠ酶线性化的重组腺病毒质粒pAd/Deltex-1的DNA转染健康293细胞进行病毒包装，倒置显微镜观察，是否可见绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达、病理空斑是否形成、细胞是否变圆等变化，证实pAd/Deltex-1腺病毒包装是否成功。pAd/Deltex-1重组腺病毒经293细胞成功包装后，经5轮传代扩增以提高其滴度，之后大量扩增，采用倍比稀释法测定其滴度。2.Deltex-1基因在大鼠bMSCs中的表达检测第叁代大鼠bMSCs贴壁生长至60%～80%融合后，予以Deltex-1重组腺病毒感染，以空病毒感染的bMSCs作对照。倒置荧光显微镜观察并拍照。在基因(RT-PCR法)与蛋白(Western blot技术)水平检测Deltex-1在bMSCs中的表达情况。叁、Deltex-1基因促进bMSCs向SMC分化的作用及其机制1.Deltex-1基因对bMSCs增殖的影响—增殖曲线绘制将经Deltex-1基因修饰的bMSCs接种至4个96孔板(3000个细胞/150μl/孔)，以经空病毒与Deltex-1基因干扰片段转染的bMSCs作实验对照，Scramble-a(CGTTTGTCCCTCCAGCATCT)作用的bMSCs作无关对照，未作任何处理的bMSCs作正常对照。每组分别于24h、48h、72h取出一96孔板，每孔加换新培养基与CCK-8，相同条件下继续培养4h，振荡30秒混匀，酶标仪测定450nm波长处光密度值，以光密度值为Y轴，时间为X轴绘制增殖曲线，分析Deltex-1基因对bMSCs增殖的影响。2.免疫荧光组化、RT-PCR及Western blot分析Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制将经Deltex-1基因修饰的bMSCs与SMC共培养，采用免疫荧光组化染色结合激光共聚焦、RT-PCR及Western blot观测经Deltex-1基因修饰的bMSCs表达SMC特异标志蛋白α-SMA的情况，具体分组：①b MSC正常对照、②b MSC+空病毒、③b MSC+Deltex-1病毒、④b MSC+空病毒+SMC、⑤b MSC+Deltex-1病毒+SMC、⑥bMSC+Deltex-1干扰+SMC、⑦SMC正常对照。以此探讨Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制。结果一、bMSCs的分离、培养及鉴定采用密度梯度离心法分离的SD大鼠初代bMSC，培养24ｈ后，贴壁生长，呈梭形，培养4～7d后,挑取其单克隆,传代扩增单克隆bMSCs,置孵箱中培养7～10d,观察细胞长势良好。特异性免疫抗体标记结合流式细胞仪检测发现，bMSC的CD90、CD44表达阳性，分别为99.57%和85.66%，CD45表达阴性，阳性率为0.35%；成骨诱导后,茜素红染色发现,3周后细胞质中出现似钙沉淀；成脂诱导后,油红染色发现,3周左右,细胞核周可见折光性较强的脂肪小滴出现,继续培养一周,脂肪小滴逐渐增多。二、Deltex-1基因重组腺病毒载体的构建及其在大鼠bMSCs中的表达1.腺病毒载体pAd/Deltex-1的构建、病毒包装与病毒滴度测定测序证实，克隆到Deltex-1基因全长编码序列，成功构建其重组腺病毒载体pAd/Deltex-1。脂质体介导重组pAd/Deltex-1病毒DNA转染健康293细胞进行病毒包装，10d后，倒置显微镜下可见GFP的表达、病理空斑形成、细胞变圆、肿胀、脱壁及细胞核变大等变化，据此pAd/Deltex-1腺病毒包装成功。包装成功的pAd/Deltex-1病毒经5轮传代扩增以提高滴度，之后大量扩增，采用倍比稀释法测定其滴度为：1.23×1010IU/mL。2.Deltex-1基因在大鼠bMSCs中的表达检测从单克隆分离培养的bMSCs，经Deltex-1病毒感染，每3～5d传1代，传至第3代，与未经感染的bMSCs相比，其形态无异常改变。倒置荧光显微镜观察可见GFP的较强表达，对照组则相反。提取此代细胞的总RNA，并以之为模板，采用R-PCR法可检测到Deltex-1基因的较强表达，对照组Deltex-1基因的表达则较弱。Western blot结果显示，感染pAd/Deltex-1病毒的bMSCs检测，在约67kDa处出现较强的Deltex-1蛋白相应染色带，对照组的该条带则较弱。这些结果提示外源基因Deltex-1能在bMSCs中正常编码表达。叁、Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制1.Deltex-1基因对bMSCs增殖的影响—增殖曲线绘制第叁代bMSCs总的生长趋势是1～3d为潜伏期，3～5d为快速增殖期,6～7d为平台期。CCK-8法结果显示,各组细胞的生长趋势基本与此相符，但经Deltex-1基因修饰的bMSCs的增殖，72h明显慢于其他组(P<0.01)。2.免疫荧光组化、RT-PCR及Western blot分析Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制将经Deltex-1基因修饰的bMSCs与SMC共培养，采用免疫荧光组化结合激光共聚焦、RT-PCR及Western blot均能检测到经Deltex-1基因修饰的bMSCs较强表达SMC特异标志蛋白α-SMA，正常对照与空病毒感染等组则较弱，经Deltex-1基因干扰片段转染的bMSCs几乎不表达这些标志蛋白。由此提示，Deltex-1基因可促进bMSCs向SMC分化。结论1.本实验成功分离到纯度好，干性优良的bMSCs；2.克隆到Deltex-1基因全长编码序列，成功构建其重组腺病毒载体pAd/Deltex-1，该载体得以病毒包装，并获得滴度为1.23×1010IU/mL的高感染力病毒；3.成功实现了Deltex-1基因在SD大鼠bMSCs中的表达；4.Deltex-1基因修饰的bMSCs，72h的增殖明显受抑制，与对照组相比P<0.01；5.与未修饰的bMSCs相比，经Deltex-1基因修饰的bMSCs与SMC共培养可高表达SMC特异蛋白α-SMA。Deltex-1基因可促进bMSCs向SMC分化。
佚名[6]2011年在《中华临床医师杂志(电子版)2011年第5卷主题词索引》文中指出说明:(1)本索引按主题词汉语拼音字母顺序排列。(2)冠有阿拉伯数字、西文字母、西文姓氏的主题词,按其后的汉字拼音顺序排序;在汉字相同的情况下,按数字、英文字母、希文字母顺序先后排列。
曹莉莉[7]2016年在《人脐血单个核细胞移植改善雌鼠压力性尿失禁的实验研究》文中研究表明压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是一种常见的盆底功能障碍性疾病(pelvic floor dysfunction,PFD),世界范围内约有2亿人存在尿失禁问题。SUI与盆底和尿道薄弱有关,妇女分娩时的肌肉组织、结缔组织和神经损伤可能是导致该疾病最重要的危险因素。引起压力性尿失禁的主要机制有尿道高活动性和固有括约肌功能障碍(intrinsic sphincter deficiency,ISD)。目前多数研究者认为大多压力性尿失禁患者同时有ISD和尿道高活动性两种因素存在,ISD在SUI的发病过程中起重要作用[1-3]。一位有80年寿命的女性一生中可能要承受11.1%的盆底手术风险,其中29%至少经历一次手术。15年后,这个风险相似,约12.2%,其中19%有再次手术风险,6.2%接受了再次手术[4]。基于美国的一组数据也证明,80年寿命的女性一生中可能要承受20%的盆底手术或者尿失禁手术的风险[5]。尿道悬吊带术和尿道旁填充术作为初始尿失禁(urinary incontinence,UI)的外科治疗方法已经被认可。但是,前者有30%再次手术的风险,后者是前者的9倍。即便手术达到85%~90%的成功率,也意味着有10%~15%的手术患者仍然持续的尿失禁,而且还有吊带侵蚀、梗阻和感染等发生。目前治疗尿失禁的方法多只能解决膀胱颈支撑功能障碍和改善尿道局部压力,不能纠正ISD,因此长期疗效不理想,而且并发症较多。利用干细胞修复和增强受损括约肌的功能,是目前治疗SUI的新思路。脐血干细胞(umbilical cord blood stem cell,UCBSC)主要含有造血干细胞和间充质干细胞,经体外培养可以分化为多种细胞,并且在临床上已经得到运用。UCBSC免疫原性较弱,可以为异体细胞移植所用。脐血是一种非常有潜力的干细胞资源,随着脐血库的建立及规范化管理,脐血有望成为将来干细胞移植治疗SUI的最可靠和最稳定的细胞来源。脐血单个核细胞(human cord blood mononuclear cells,HCMNCs)含有UCBSC,是一多异质性细胞群,能分泌多种细胞因子(cytokines,CKs),因此,可能是一种理想的细胞移植的来源。本实验目的在于研究HCMNCs移植至SUI大鼠近端尿道后,观察受损尿道组织内的细胞分布和尿道组织解剖形态学的变化,以及检测SUI大鼠控尿能力的改变,探讨移植细胞对有isd的尿道括约肌的修复和功能重建作用。本研究以sprague-dawley雌性大鼠为研究对象,采用反复阴道扩张的方法模拟产道损伤建立雌性sd大鼠sui模型,利用密度梯度离心法分离出hcmncs;检测和鉴定sui模型;培养并标记hcmncs,于sui大鼠模型移植注射标记的细胞,观察移植细胞的分布及尿道组织形态的变化,以及sui模型尿控的改变。主要实验方法及结果如下:一、动物分组、sui模型建立和尿道组织解剖研究40只雌鼠用于研究,分为模拟组(sham)10只和实验组(即阴道扩张组,vd)30只,实验组包括细胞移植治疗组(t)15只,实验对照组(c)15只。实验组大鼠麻醉后,消毒会阴部,然后放置经润滑的8-frfoley尿管入阴道内,4/0丝线缝合固定在阴道外口,3ml生理盐水注入气囊,经过2小时阴道扩张,抽出气囊盐水,拔出尿管,7天后重复扩张一次。模拟组只置入导尿管而不扩张。结果:所建模型的功能检测中喷嚏试验均为阳性,并且尿动力学检测数据发生变化;再则,模型雌鼠阴裂变长,同时尿道组织形态提示尿道括约肌受损[6]。二、人脐血单个核细胞分离、培养及标记无菌条件下取脐带血50~100ml,6小时内分离,采用密度梯度离心法分离出单个核细胞,l-dmem培养,采用不同标记物标记,观察细胞生长情况。结果:分离的脐血单个核细胞培养后细胞胞体增大,呈纺锤形、梭形细胞和团簇样细胞。brdu(5-溴脱氧尿核苷)及dapi(4,6-联脒-2-苯基吲哚)可标记上细胞。叁、hcmncs移植及检测移植后sui模型尿控的改善和尿道括约肌的改变1.经dapi标记的hcmncs注射进模型鼠尿道周围,取近端尿道组织切片,于激光扫描共聚焦显微镜(confocallaserscanningmicroscope,clsm)下观察到dapi染色阳性的移植细胞较均匀的分布于尿道周围肌肉,表明移植的hcmncs在尿道括约肌内存活,部分染色阳性的细胞形态呈扁平状,并参与到肌内的组成。2.通过染色,我们发现阴道扩张后尿动力学数据的改善与尿道括约肌组织的恢复有关。细胞移植后见大鼠尿道括约肌肌层明显增厚,实验对照组(c)尿道控尿能力和组织形态随时间亦逐渐恢复,但是,与细胞移植治疗组(t)比较,尿控改善略差,组织恢复较慢[6]。结论:本研究成功地分离培养和标记了hcmncs,通过反复扩张阴道模拟女性生产时阴道扩张的损伤,建立了sd雌鼠压力性尿失禁模型,证明了移植的脐血单个核细胞可在受损尿道括约肌内存活、分布,移植hcmncs能促使尿道括约肌得以较好的修复,压力性尿失禁大鼠控尿能力明显改善,为脐血干细胞移植治疗压力性尿失禁提供了理论支持。
孙思[8]2009年在《采用大鼠向肌样细胞分化的骨髓间充质干细胞复合藻酸钙凝胶构建组织工程化肌肉的初步研究》文中提出【目的】压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是成年女性较常见的疾病,随年龄增长症状加重,严重影响中老年妇女的身心健康。我们拟采用经肌肉分化诱导的骨髓间充质干细胞和藻酸钙复合凝胶作尿道内口注射,一方面增加尿道阻力,一方面利用经肌肉分化诱导的骨髓间充质干细胞逆转和替代相关部位细胞的退行性改变,以修复盆底肌肉、筋膜及尿道固有括约肌的生理功能。本实验作为本研究课题的一部分,对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)进行体外分离、培养及向肌样细胞分化诱导的技术进行实验和分析。探讨以可降解生物材料藻酸钙(Alginate)凝胶为支架混合大鼠骨髓间充质干细胞和诱导后的肌样细胞,构建组织工程化可注射性材料的特性。【材料和方法】第一部分:大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养:通过新生SD大鼠(1周龄)骨髓提取分离骨髓间充质干细胞,在体外培养增殖,观察并通过流式细胞仪鉴定得到的细胞情况。经鉴定后,扩增的骨髓间充质干细胞用吖啶橙(Acridine Orange,AO)作示踪染色,为下一步实验做准备。第二部分:大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向肌样细胞诱导分化的研究:以5-氮杂胞苷10μmol/L作用于大鼠骨髓间充质干细胞24小时,诱导其向肌样细胞分化,继续培养3周后,通过苏木精-伊红(H&E)、结蛋白(Desmin)、α-横纹肌动蛋白(α-SMA)免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞的分化情况。第叁部分:制备藻酸钙凝胶的研究:将2%藻酸钠溶液分别与5%、2%、1%叁种不同浓度的CaCl_2按体积比1:1、5:1、10:1叁种比例混合,观察在4℃、室温和37℃下形成的藻酸钙凝胶的大体物理性状的变化。第四部分:以藻酸钙凝胶为支架构建组织工程学研究:以2%藻酸钠溶液与1%浓度的CaCl_2按体积比5:1混合制成可注射性藻酸钙凝胶,以藻酸钙凝胶作为支架复合大鼠骨髓间充质干细胞和诱导后的肌样细胞分别注射于SD大鼠(体重200～250g)背部皮下和四肢肌肉中,观察大鼠背部凝胶形成皮丘的体积变化及4周、8周后组织块取出后,免疫组化染色观察干细胞及佳赴谠逅岣颇褐Ъ苣诘纳の涨榭觥?【结果】第一部分:从新生大鼠四肢长骨中提取骨髓,经贴壁法分离,可得到较为纯化的骨髓间充质干细胞。原代培养2天后,干细胞贴壁生长,细胞形态由均一单个圆梭形逐渐贴壁,呈梭形或纺锤形生长,细胞核呈圆形或椭圆形。继续培养5～10天后,细胞生长融合达90%,细胞形态发生较大变化,可见纺锤形和星形多突起样生长,细胞生长速度减慢,经0.25%的胰蛋白酶+2g/LEDTA消化后按1:3传代。10cm培养皿长满后可得细胞量约3～5×10~6个。经2～3次传代后,P2、P3代为比较纯净的骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测细胞表面抗体CD29阳性率89.6%、CO105阳性率46.0%,CD34、CD45呈阴性反应。培养所得大鼠骨髓间充质干细胞经吖啶橙(AcridineOrange,AO)染色有强绿色荧光反应。第二部分:大鼠骨髓间充质干细胞经过5-氮杂胞苷诱导24小时,继续培养3周后,细胞成簇密集生长。诱导后细胞部分变为多角形状,呈长梭形生长,胞内可见趋于融合的多核肌管样细胞结构,未诱导的干细胞,诱导后培养1周的细胞和诱导后继续培养3周的细胞做免疫组织化学染色显示,普通H&E染色叁组细胞未见明显差别。骨髓间充质干细胞结蛋白和α-横纹肌动蛋白两种蛋白几乎不着色,诱导后培养1周的细胞结蛋白(Desmin)染色为淡蓝色、α-横纹肌动蛋白(α-SMA)染色为褐色,诱导后3周的细胞两种蛋白染色较1周时明显增强,呈强阳性表达。第叁部分:2%藻酸钠溶液为黄褐色粘性液体,无气味、透明。藻酸钙凝胶为无色透明或乳白色,形态及质地根据配比不同随之变化。按体积比1:1加入CaCl_2后凝胶形成固性好,质地较硬。按体积比5:1加入CaCl_2震荡混匀后形成均一凝胶层,凝胶均质,周围无多余液体。24小时后,1%CaCl_2浓度组凝胶仍有流动性,易碎。可作为可注射性材料。按体积比10:1加入CaCl_2后藻酸钠溶液有明显残余,凝胶不能即刻形成,均可震荡混匀,形成凝胶体积较前两种体积比各组均小,质地软,流动性强,易碎。4～37℃不同温度对凝胶的形成速度及成型后的性状无明显影响,凝胶烘干后体积明显缩小至原体积的5～10%左右。扫描电镜观察3种凝胶表面微结构见CaCl_2浓度越小,形成的凝胶微结构空隙越大。第四部分:藻酸钙凝胶中混合细胞后扫描电镜观察见细胞均匀散布于藻酸钙凝胶表面和内部空隙中。SD大鼠体内单纯注射细胞,1～2天后由于培养液被很快吸收,无法进行组织采集。凝胶组及干细胞、肌样细胞复合凝胶组大鼠背部凝胶1月后缩小50%以上,2月后凝胶体积缩小80%左右。凝胶注射4周后取出皮下凝胶块,凝胶块体积较注射前明显减小,凝胶块外形成明显包膜,4周、8周时取出大鼠皮下及四肢肌肉组织块做免疫组织化学染色和荧光示踪照相,显示凝胶样本有炎性细胞浸润,梭形成纤维细胞样包膜形成,凝胶边缘有新生血管长入。BMSCs和肌样细胞在凝胶中均有生长,肌样细胞在皮下和肌肉内特异蛋白表达较弱,注射于肌肉中的BMSCs在8周时有轻度结蛋白和横纹肌动蛋白表达,但均未见明显新生肌肉样组织生长。【结论】从新生大鼠四肢长骨中提取骨髓,靠密度梯度离心结合贴壁法分离,可得到较为纯化的骨髓间充质干细胞,方法简便高效。大鼠骨髓间充质干细胞生长活力好,增殖迅速,可大量培养增殖。经5-氮杂胞苷作用后的骨髓间充质干细胞有明显的肌样蛋白表达,说明5-氮杂胞苷可诱导干细胞向肌样细胞分化,但5-氮杂胞苷的浓度和作用时间必须限定在一定范围内。藻酸钠溶液与不同浓度的CaCl_2及按不同体积比混合所得藻酸钙凝胶性质也不尽相同,高浓度的CaCl_2参与形成的藻酸钙凝胶硬度和强度较大。要选用藻酸钙凝胶作为可注射性材料,CaCl_2的浓度也需要控制在一定范围之内。藻酸钙凝胶复合BMSCs或诱导后的肌样细胞植入动物体内,会有一定的炎性反应,随着凝胶的分解吸收,炎性反应逐渐减轻,并有新生血管长入凝胶,但肌样细胞是否有成肌效应尚待进一步研究。
胡佳佳, 尹春艳[9]2014年在《人脐带间充质干细胞在妇科疾病中的研究进展》文中研究说明人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)是来源于中胚层的一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞。与其他来源的间充质干细胞(MSCs)相比,hUCMSCs具有来源丰富、低免疫原性、对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势,因此hUCMSCs在细胞治疗和再生医学的临床应用方面拥有广阔的前景。近年研究表明,hUCMSCs可能为妇科疾病治疗提供新的思路。
陈翠平[10]2007年在《17β-E_2对骨髓间充质干细胞增殖、成肌分化作用的实验研究》文中认为目的：1．贴壁法分离、纯化BMSCs，观察体外培养的生物学性状及诱导成骨骼肌分化的特征，为压力性尿失禁(SUI)的细胞治疗提供理想的细胞源。2．观察17β-E_2对BMSCs增殖、成肌分化的影响，以提高BMSCs成骨骼肌分化效率，为SUI的治疗提供足量的细胞，同时在细胞水平上探索雌激素治疗SUI的作用机理，为临床用药提供理论依据。方法：1．运用贴壁法分离、培养和纯化SD大鼠的BMSCs，通过对生长曲线、贴壁率等测定，观察体外培养BMSCs的生物学特性。2．通过细胞形态学观察、流式细胞仪对细胞表面标志的测定以及诱导成骨、软骨和脂肪细胞的多向分化潜能来鉴定BMSCs。3．利用5-氮杂胞苷(5-aza)诱导BMSCs向骨骼肌分化，通过免疫荧光法(IF)检测desmin、myogenin、MHC(myosin heavy chain)的表达，以分析BMSCs成骨骼肌分化的特性。4．MTT法检测在0-1nmol／L浓度范围内17β-E_2对BMSCs增殖的影响，以确定最佳的作用剂量。5．Hoechst33258染色测定17β-E_2诱导的BMSCsDNA含量变化，以观察其对BMSCs增殖的影响。6．IF检测17β-E_2对BMSCs骨骼肌分化标志MHC、myogenin、desmin表达，以分析17β-E_2对BMSCs成骨骼肌分化的影响。7．利用TUNEL法检测5-aza诱导BMSCs的凋亡率，同时分析17β-E_2对药物诱导细胞凋亡的影响。结果：1．利用贴壁法分离法可获得高纯度的BMSCs，且细胞活性高。原代细胞贴壁生长速度较慢，BMSCs分离培养24h后开始少量贴壁，细胞呈短梭形，3d后贴壁细胞明显增多，呈现集落样生长，10-14d细胞近融合。传代后，细胞增殖、贴壁速度加快，10h后有90％以上细胞贴壁，细胞倍增时间约为30h，7-10d细胞融合。2．流式细胞仪测定显示CD34~-／CD29~+，Von Kossa染色、油红0染色和甲苯胺蓝染色证实BMSCs分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。3．IF显示BMSCs表达myogenin、desmin、MHC，细胞浆发红色或绿色荧光，胞核呈蓝色荧光，对照组仅见胞核染色，证实BMSCs向骨骼肌细胞分化。4．MTT法检测17β-E_2对BMSCs增殖的作用，显示成浓度依赖关系，最佳促增殖浓度为1nmol／L。5．Hoechst33258法测定0、1nmol／L 17β-E_2对BMSCsDNA的影响，结果示诱导48h差异不显着，，7d、14d时两组细胞内DNA含量有显着性差异。6．17β-E_2可增加BMSCs骨骼肌分化标志物表达，差异有显着性。7．5-aza可诱导BMSCs凋亡，TUNEL阳性细胞率呈时间依赖性增加，17β-E_2可降低TUNEL阳性细胞率，差异有显着性。结论：1．利用贴壁法可建立简单的、稳定的BMSCs培养体系，细胞活性高，且具有向骨骼肌等多向分化潜能。2．17β-E_2对BMSCs的增殖具有促进作用，且能增强5-aza诱导骨骼肌分化效率，降低药物诱导引起的细胞凋亡。
参考文献：
[1]. 骨髓间充质干细胞对雌性大鼠压力性尿失禁影响的研究[D]. 胡华. 第叁军医大学. 2004
[2]. 脂肪间充质干细胞治疗压力性尿失禁的实验研究[D]. 吴桂珠. 福建医科大学. 2010
[3]. 脐带间充质干细胞对尿道括约肌功能影响的实验研究[D]. 石海燕. 暨南大学. 2012
[4]. 组蛋白乙酰化对骨髓间充质干细胞微环境适应性的调控作用及机制[D]. 徐梦遥. 第叁军医大学. 2013
[5]. Deltex-1基因在骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中的作用及其机制研究[D]. 王荥. 第叁军医大学. 2012
[6]. 中华临床医师杂志(电子版)2011年第5卷主题词索引[J]. 佚名. 中华临床医师杂志(电子版). 2011
[7]. 人脐血单个核细胞移植改善雌鼠压力性尿失禁的实验研究[D]. 曹莉莉. 第叁军医大学. 2016
[8]. 采用大鼠向肌样细胞分化的骨髓间充质干细胞复合藻酸钙凝胶构建组织工程化肌肉的初步研究[D]. 孙思. 复旦大学. 2009
[9]. 人脐带间充质干细胞在妇科疾病中的研究进展[J]. 胡佳佳, 尹春艳. 现代妇产科进展. 2014
[10]. 17β-E_2对骨髓间充质干细胞增殖、成肌分化作用的实验研究[D]. 陈翠平. 暨南大学. 2007
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